全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 4期，第 877-886页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.4, 877-886
研究报告
Research Report
盐生植物小花碱茅外整流K+通道 PtSKOR基因的克隆及 RNAi载体构建
段丽婕 王沛 陈梦词 王锁民 *
草地农业生态系统国家重点实验室,兰州大学草地农业科技学院,兰州, 730020
*通讯作者, smwang@lzu.edu.cn
摘 要 为研究盐生植物小花碱茅(Puccinellia tenuiflora)耐盐的分子机制，本研究根据已克隆到的 PtSKOR
基因片段，利用 RACE技术得到小花碱茅 PtSKOR的 3和 5cDNA序列，拼接后的基因全长为 2 353 bp，编
码 715个氨基酸，系统进化分析显示 PtSKOR编码外整流 K+通道。在此基础上，采用酶切连接的方法，构建
了 CaMV 35S启动子驱动的含 PtSKOR基因片段反向重复序列的 PtSKOR-RNAi植物表达载体。
关键词 盐生植物,小花碱茅, PtSKOR, RNAi载体构建
Cloning Outward-Rectifying Potassium Channel PtSKOR Gene and
Constructing Its RNAi Vector in Halophyte Puccinellia tenuiflora
Duan Lijie Wang Pei Chen Mengci Wang Suomin *
State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou, 730020
* Corresponding author, smwang@lzu.edu.cn
DOI: 10.13271/j.mpb.013.000877
Abstract In order to investigate the molecular mechanism of the halophyte plant Puccinellia tenuiflora for salt
tolerance, the 3 cDNA sequence and 5 cDNA sequence were cloned with RACE technology based on the reported
PtSKOR gene fragment. Sequencing results indicated that the length of the PtSKOR gene from P. tenuiflora was
2 353 bp encoding 715 amino acids. Homology comparison showed that it was the outward-rectifying potassium
channel gene named PtSKOR. Then the RNAi plant expression vector PtSKOR-RNAi with inverted repeats of
PtSKOR driven by the promoter CaMV 35S was constructed by restriction enzyme digestion and ligation.
Keywords Halophyte, Puccinellia tenuiflora, PtSKOR, RNAi vector construction
收稿日期：2014-09-29 接受日期：2014-10-24 网络出版日期：2014-12-20
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/2569
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31170431)、教育部博士点基金优先发展领域项目(20130211130001)和兰州大学
中央高校基本科研业务费专项资金(lzujbky-2013-239)共同资助
土壤盐碱化是农作物面临的主要环境胁迫之一
(Kobayashi et al., 2012)，地球上约有 9.5×108 hm2盐
碱地，而中国约有 9.9×107 hm2的盐渍地，其中盐碱
化的耕地约 7.6×106 hm2，占耕地面积的近 1/5 (周和平
等, 2012)，严重制约了我国农业经济的可持续发展。小
花碱茅(Puccinellia tenuiflora)是生长于中国东北和西
北地区盐碱地的一种禾本科多年生碱茅属植物(王生
银等, 2009)，相较于其他甜土植物小花碱茅极为耐盐，
因此，研究其耐盐机理对改良农作物具有积极意义。
有学者认为小花碱茅的耐盐机制是其具有泌盐
功能(阎秀峰等, 1994)，但解剖学和叶表面观察都没
有发现其具有盐腺或盐囊泡(朱兴运等, 1994;阎顺国,
1997)。Wang等(2004; 2009)进一步研究表明小花碱
茅耐盐并非是泌盐，而是通过限制根部 Na+内流并
提高地上部 K+积累，继而通过维持植株体内高K+/Na+
比来增强耐盐性的(Zhu, 2003)，而地上部的 K+积累
主要是植物通过木质部外整流 K+通道装载根吸收
的 K+随木质部流进入地上部的。
Gaymard等(1998)在拟南芥(Arabidopsis thaliana)
中首次克隆得到 K+通道基因 SKOR (Stelar K+ outward
rectifier)，于爪蟾卵母细胞中异源表达分析表明，
SKOR是植物 shaker家族中的一个外整流 K+通道基
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
因，基因敲除后的突变体茎中与木质部汁液中的 K+
浓度有所下降，说明 SKOR可以将 K+释放进入木质
部汁液中从而实现向茎中转移。
为进一步探讨外整流 K+通道 SKOR在小花碱茅
适应盐胁迫中的作用，本研究在前期克隆得到的小花
碱茅外整流 K+通道基因片段的基础，利用 RACE技
术得到了小花碱茅外整流 K+通道基因 PtSKOR 的
3cDNA序列与 5cDNA序列，拼接得到基因全长，并
构建了 RNAi载体，以期为小花碱茅耐盐机制的研究
奠定基础。
1结果与分析
1.1总 RNA的提取
以小花碱茅根系为材料提取的总RNA，经 Thermo
公司 NanoDrop 1000核酸蛋白检测仪测得 OD260/OD280
平均值为 2.02，表明所提取的 RNA纯度较高；凝胶
电泳检测的结果表明：28S RNA 条带亮度比 18S
RNA条带明显偏高，约为 2倍，由此得到完整性较
好的 RNA，可用于后续实验。
1.2 PtSKOR基因 5端与 3端的克隆
以 Invitrogen公司 3RACE试剂盒(Catalog nos.
L1500-01) 所得 RACE产物为模板，P1与 3 Primer
为外侧扩增引物，P2与 3 Nested Primer为内侧巢式
引物扩增得到一个 896 bp的片段(图 1A)；以 clontech
公司 5RACE试剂盒(Catalog nos. 634923 & 634924)
所得 RACE产物为模板，P3与 Universal Primer A为
外侧扩增引物，P4与 Nested Universal Primer A为内
侧巢式引物扩增得到一个 867 bp的片段(图 1B)。测
序结果经 BLAST 表明它们均为 PtSKOR 的基因片
段，与王茜等(2012)克隆到的 PtSKOR基因片段序列
相拼接得到一个全长为 2 353 bp的序列，其中包含
一个 100 bp的 5非翻译区(5UTR)，105 bp包含 poly
(A)尾巴的 3非翻译区(3UTR)以及 2 148 bp的开放
阅读框(ORF)，编码 715个氨基酸(图 2)。
1.3氨基酸序列的分析
通过软件比对氨基酸序列并进行疏水性分析，
结果表明小花碱茅 PtSKOR 有 6 个高度保守的跨
膜区(S1~S6)，位置分别为：66~77，96~116，136~154，
162~189，195~216和 283~306。在 S5和 S6之间有一
个高度保守的孔道区域(pore, P)，C末端包含一个预
测的环核苷酸结合域 (cyclic nucleotide-binding do-
main, cNBD)和锚蛋白域(ankyrin domain,Anky) (图 3)。
多重比较及系统进化分析发现，小花碱茅 PtSKOR
与禾本科植物节节麦(Aegilops tauschii ) AeSKOR
(EMT07667.1)、小麦(Triticum urartu) TuSKOR (EMS-
58765.1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon) Bd-
SKOR (XP_003581272.1)的外整流 K+通道的进化关
系非常近，氨基酸同源性高达 87%~90%，与双子叶
植物如毛果杨(Populus trichocarpa) PoSKOR (XP_00-
6372521.1)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) AtSKOR
(CAA11280.1)、空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)
ApSKOR (AFO70199.1)、苜蓿 (Medicago truncatula)
MtSKOR (XP_003616247.1)的进化关系相对较远，同
源性在 56%~58%之间，而与小花碱茅内整流 K+通
道 PutAKT1的同源性很低，只有 32.7% (图 4)。
1.4 PtSKOR基因 RNAi靶位片段的选择及扩增
利用 GenBank中的 RNAi设计库对 PtSKOR基
因的靶位区段进行筛选，结果表明，PtSKOR基因从
起始密码开始第 1 149~1 746位碱基共 597 bp的片
段为保守区段。以小花碱茅根系总 RNA逆转录所得
的 cDNA为模板，用合成的特异性引物进行 PCR扩
增，扩增得到的正义片段和反义片段(图 5)大小与预
期一致，经回收连接转化后测序，测序结果与克隆到
的 PtSKOR cDNA片段比对同源性为 100%，表明已
成功克隆到目的靶位片段。
1.5 PtSKOR基因 RNAi植物表达载体构建
通过酶切连接的方法，将克隆到的正义及反义
片段分别连接到 pHANNIBAL 载体上，构建了以
PtSKOR为靶标的中间载体 pHS1S2。利用 XhoⅠ-/-
KpnⅠ、XbaⅠ-/-ClaⅠ分别对 pHS1S2进行双酶切，
均得到 597 bp的条带(图 6A)，并以 pHS1S2质粒为
图 1 PtSKOR基因的扩增产物
注 : M: DL1000 DNA marker; A: PtSKOR 基因 3RACE 巢式
PCR产物; B: PtSKOR基因 5RACE巢式 PCR产物
Figure 1 PCR products of PtSKOR
Note: M: DL1000 DNA marker; A: The PtSKOR 3RACE nested
PCR product; B: The PtSKOR 5RACE nested PCR product
878
图 2小花碱茅 PtSKOR基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列
注:左侧的数字分别代表核苷酸和氨基酸的位点;黑色框中为起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)
Figure 2 Nucleotide sequences and deduced amino acid residues of PtSKOR
Note: The nucleotide sequences and amino acid residues are indicated by numbers of the left; The start codon (ATG) and the stop codon
(TAG) were framed
模板，分别用正义片段引物 P5-/-P6及反义片段引
物 P7-/-P8 进行 PCR 扩增，得到相同大小的片段
(图6B)，证明中间载体 pHS1S2构建成功，该载体包
含“正向序列-PDK intron-反向序列”的“hpRNA
盒”。双酶切重组质粒 pHS1S2并将其导入植物表达载
体 pART27 中，最终所得 RNAi 植物表达载体 Pt-
SKOR-RNAi，分别用 P5-/-P6及 P7-/-P8对其进行
PCR鉴定，得到 597 bp的条带(图 6C)，分别用 XhoⅠ
-/-KpnⅠ、XbaⅠ-/-ClaⅠ、SpeⅠ-/-SacⅠ对该载体质
粒进行双酶切分别得到 597 bp 的正义、反义片段、
4 097 bp的“hpRNA盒”片段的条带(图 6D)，说明“正
向序列-PDK intron-反向序列”的“hpRNA盒”已插
盐生植物小花碱茅外整流 K+通道 PtSKOR基因的克隆及 RNAi载体构建
Cloning Potassium Channel PtSKOR Gene and Constructing Its RNAi Vector in Halophyte Puccinellia tenuiflora 879
分子植物育种
Molecular Plant Breeding880
图 3 PtSKOR与其它植物 SKOR氨基酸的多重比较
注:多重比较采用 DNAMAN程序进行;图中 PtSKOR为小花碱茅外整流 K+通道,其他外整流 K+通道(SKOR)氨基酸序列的来
源和基因库登录号分别为:拟南芥 AtSKOR (CAA11280.1);小麦 TuSKOR (EMS58765.1);节节麦 AeSKOR (EMT07667.1);划线
区分别指预测的 6个跨膜区(S1~S6)及 P环结构(Pore);环核苷酸结合域(cNBD);锚蛋白域(Anky)
Figure 3 Sequence alignment of PtSKOR with other SKOR from higher plants
Note: The sequences were aligned with DNAMAN 6.0 software; Sources of SKOR and their GenBank accession numbers are as follows:
AtSKOR (Arabidopsis thaliana, CAA11280.1), TuSKOR (Triticum urartu, EMS58765.1), AeSKOR (Aegilops tauschii, EMT07667.1), and
the PtSKORwas the P. tenuiflora outward-rectifying potassium channel; The six putative trans-membrane domains (S1~S6) and other do-
mains (pore, cNBD binding domain, ankyrin domain) were underlined
盐生植物小花碱茅外整流 K+通道 PtSKOR基因的克隆及 RNAi载体构建
Cloning Potassium Channel PtSKOR Gene and Constructing Its RNAi Vector in Halophyte Puccinellia tenuiflora 881
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
入植物表达载体 pART27中，PtSKOR基因 RNAi植
物表达载体 PtSKOR-RNAi构建成功。
2讨论
本研究克隆到的小花碱茅 PtSKOR与小花碱茅
内整流 K+通道 PutAKT1同源性为 32.7%，而与拟南
芥外整流 K+通道 SKOR同源性为 56.8%，与禾本科
图 4 PtSKOR与其他植物 SKOR的系统进化树
注:系统树分析采用 DNAMAN进行;图中英文缩写分别为:二
穗短柄草 BdSKOR (XP_003581272.1)、空心莲子草 ApSKOR
(AFO70199.1)、毛果杨 PoSKOR (XP_006372521.1)、苜蓿 Mt-
SKOR (XP_003616247.1)为外整流 K+通道, PutAKT1 (ADK93-
728.1)为小花碱茅内整流K+通道;其他英文缩写同图 3
Figure 4 Phylogenetic analysis of PtSKOR with closely related
SKOR from different plant species
Note: The phylogenetic tree was constructed with DNAMAN 6.0
software; Sources of SKOR and their GenBank accession num-
bers are as follows: BdSKOR (Brachypodium distachyon, XP_00-
3581272.1), ApSKOR (Alternanthera philoxeroides, AFO70199.1),
PoSKOR (Populus trichocarpa, XP_006372521.1), MtSKOR (Me-
dicago truncatula, XP_003616247.1), and the PutAKT1 (ADK93-
728.1) was the P. tenuiflora inward-rectifying potassium channel;
Others refer to the legend of figure 3
图 5 PtSKOR基因片段的扩增产物
注: M: DL1000 DNA marker; A: PtSKOR 基因正向片段 PCR
产物; B: PtSKOR基因反向片段 PCR产物
Figure 5 PCR products of PtSKOR
Note: M: DL1000 DNA marker; A: The sense strand products of
PtSKOR; B: The antisense strand products of PtSKOR
图 6 PtSKOR基因“hpRNA表达盒”与 RNAi植物表达载体 Pt-
SKOR-RNAi的构建
注: M1: DL2000 DNA marker; M2: DL15000 DNA marker; A:
中间载体 pHS1S2的双酶切验证; B:中间载体 pHS1S2的 PCR
验证; C: PtSKOR-RNAi 载体的 PCR 验证; D: PtSKOR-RNAi
载体的双酶切验证
Figure 6 Construction of the hpRNA expression box and the plant
expression RNAi vector PtSKOR-RNAi
Note: M1: DL2000 DNA marker; M2: DL15000 DNA marker;
A: Results of pHS1S2 digested by XhoⅠ and KpnⅠ, XbaⅠ and
ClaⅠ respectively; B: Recombinant plasmids of pHS1S2; C: Re-
combinant plasmids of PtSKOR-RNAi vector; D: Results of Pt-
SKOR-RNAi vector digested by XhoⅠ and KpnⅠ , XbaⅠ and
ClaⅠ, SpeⅠ and SacⅠ, respectively
植物小麦和节节麦外整流 K+通道 SKOR同源性高达
89% (图 4)，因此推测此通道为小花碱茅外整流 K+通
道，是 Shaker家族中第五组的成员(靳义荣等, 2012)。
PtSKOR基因的开放阅读框长为 2 148 bp，编码 715
个氨基酸，对氨基酸序列分析后发现该序列有 6个
(S1~S6)跨膜域组成的疏水性核心区域及环核苷酸结
构域与锚蛋白区域(Véry et al., 2014)，与 Shaker通道
家族其他成员类似，在 S5与 S6之间有含有高度保
守片段 TVGYG的 P环，组成了一个狭窄的孔道区
域充当选择性过滤器，在 S4中有正电荷的氨基酸 R
(图 3)，负责通道的电压控制(Benito et al., 2014)。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指生物体
内由双链 RNA诱发的一种基因沉默现象(言普等,
2013)。VanderKro等(1990)发现转基因矮牵牛能够抑
制相应内源基因及其自身的表达，这是首次发现的
RNA沉默，最初将其命名为共抑制(Cosuppression)。
随后 Guo和 Kempheus (1995)发现反义 RNA和正义
882
RNA都能够阻断线虫目的基因的表达；Fire等(1998)
发现双链 RNA能够比反义 RNA或正义 RNA更有
效地关闭基因的表达。此后 RNAi技术就被广泛应
用于植物基因功能鉴定和表达调控等各个领域，成
为反向遗传学的研究手段之一，而构建相应的 RNAi
载体则是其研究的前提(崔喜艳等, 2013)。
对植物进行 RNA干扰的前期研究表明选取目标
基因结构序列不同，得到的双链 RNA (double-strand-
ed RNA, dsRNA) 所产生的效应也存在着显著差异，
基因外显子编码区的 dsRNA能够高效、特异地发挥
阻抑作用(Hutvágner et al., 2000)，且用 pHANNIBAL
载体构建的臂长在 400~800 bp核苷酸的含内含子发
夹结构的 RNA (IhpRNA)都是稳定有效的(Wesley et
al., 2001;张付云等, 2010)。因此，本研究选取了克隆
到的 PtSKOR基因外显子区的含有部分环核苷酸结
构域与部分锚蛋白区域约 597 bp 的片段作为产生
dsRNA的靶序列，分别扩增了含有特定酶切位点
XhoⅠ和 KpnⅠ (XbaⅠ和 ClaⅠ)目的基因的正(反)向片
段，并将正向目的片段插入中间载体 pHANNIBAL内
含子的左侧，反向目的片段插入该载体内含子的右
侧，形成了“正向序列-PDK intron-反向序列”的结
构，该结构在转录后可形成一个带有 30~50 bp环的
IhpRNA，其沉默效果远远高于共抑制或反义结构的
效果(张付云等, 2010)。随后将构建好的基因表达盒
插入到双元植物表达载体 pART27 35S强启动子的
下游区域，使转基因植株中可以高水平转录形成双
链结构，从而有效抑制目的基因 PtSKOR的翻译。由
此成功构建了含 PtSKOR基因片段正反向重复序列
的植物 RNAi表达载体 PtSKOR-RNAi，为进一步探
讨小花碱茅耐盐机制奠定基础。
3材料方法
3.1材料
实验所用植物材料为 4 周龄的小花碱茅 (P.
tenuiflora)幼苗，种子采自兰州大学榆中校区。
3.2主要试剂
pHANNIBAL与 pART27载体为兰州大学草类逆
境生理与基因工程实验室保存，UNIQ-10柱式 Trizol
总 RNA抽提试剂盒(Catalog nos. SK1322)、UNIQ-10
柱式 DNA胶回收试剂盒(Catalog nos. SK8131)、小量
质粒提取试剂盒(Catalog nos. SK1241)购自上海生
工，反转录试剂盒(Catalog nos. DRR047A)、限制性内
切酶(Catalog nos. 1635; 1618; 1634; 1608; 1627; 1631)、
T4 DNA 连接酶(Catalog nos. 2011A)、pMD19-T (sim-
ple)载体(Catalog nos. 3271)、DNAmarker (Catalog nos.
D501S)、高保真 PCR试剂盒 Prime STAR誖HS DNA
Polymerase (Catalog nos. R010A)购自大连 TaKaRa公
司，大肠杆菌 DH5α感受态细胞(Catalog nos. CB101)
购自北京天根，普通 PCR 扩增试剂盒(Catalog nos.
AS111-01)购自北京全式金公司，3RACE试剂盒 Gen-
eRacerTM Kit 为 Invitrogen 公司产品 (Catalog nos.
L1500-01)，5RACE试剂盒 SMARTerTMRACE cDNA
为 clontech公司产品(Catalog nos. 634923 & 634924)，
PCR引物由上海生工合成，其他生化试剂均为进口
或国产分析纯产品。
3.3方法
3.3.1植物的培养
将吸水纸铺于纱网架，并撒播小花碱茅种子，并
将纱网架放置于盛有蒸馏水的白瓷盘中，进行暗催
芽，25℃，约 7 d后浇灌 Hoagland营养液(1.6 μmol/L
ZnSO4·7H2O, 0.5 mmol/LNH4H2PO4, 0.7μmol/L (NH4)6
Mo7O24·4H2O, 5 mmol/L KNO3, 92 μmol/L H3BO3,
1.5 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O, 0.5 mmol/L Fe-citrate,
0.25 mmol/L MgSO4·7H2O, 18 μmol/L MnCl2·4H2O,
0.6 μmol/L CuSO4·5H2O)。约 4 d更换 1次营养液，
培养室空气相对湿度为 60%~80%之间，光强约为
600 μmol·m-2·s-1，光照 16 h/d，昼夜温度为(28±2)℃/
(23±2)℃。
3.3.2总 RNA的提取
取 4周龄小花碱茅幼苗，用含有 25 mmol/L NaCl
和 10 mmol/L KCl的营养液处理 48 h，而后将根系
放置于离心管中，用液氮研磨至粉末，提取根系总
RNA (柱式 Trizol总 RNA抽提试剂盒)，然后用核酸
蛋白检测仪(Thermo NANODROP 1000)与凝胶电泳
(BIO-RAD)鉴定 RNA的纯度与质量。
3.3.3小花碱茅 PtSKOR基因 5端与 3端的克隆
分别用 invitrogen公司 3RACE试剂盒与 Clon-
tech 公司 5RACE 试剂盒合成 cDNA，利用 DNA-
MAN 6.0和 Primer 5.0软件，参考王茜等(2012)克隆到
的 PtSKOR基因片段序列，设计 3端基因特异引物
P1 (外侧引物)、P2 (巢式引物)和 5端基因特异引物 P3
(外侧引物)、P4 (巢式引物) (表 1)，分别与 Invitrogen公
司 3RACE试剂盒提供的 3 Primer (外侧引物)、3 Nest-
ed Primer (巢式引物)和 Clontech 公司 5RACE试剂
盐生植物小花碱茅外整流 K+通道 PtSKOR基因的克隆及 RNAi载体构建
Cloning Potassium Channel PtSKOR Gene and Constructing Its RNAi Vector in Halophyte Puccinellia tenuiflora 883
分子植物育种
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盒提供的 Universal Primer A (外侧引物)、Nested Uni-
versal Primer A (巢式引物) (表 1)配对，用高保真PCR
试剂盒扩增 PtSKOR基因的 3端与 5端，PCR扩增
反应体系与程序参照试剂盒说明，并在巢式 PCR扩
增反应结束后用 Taq酶进行加 A反应，反应体系参
照试剂盒说明，反应程序为 72℃ 20 min，将得到的
PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后切
下所要凝胶，按照 UNIQ-10柱式 DNA胶回收试剂
盒操作说明书回收目的片段，最后将回收所得的
PCR产物连接到 pMD19-T (simple)载体上，并用冻
融法将其转化至大肠杆菌 DH5α感受态细胞中进行
蓝白斑筛选，转化的白斑菌株经 PCR鉴定确认为阳
性克隆后送至上海生工进行测序。
3.3.4序列分析
用 DNAMAN 6.0 生物软件翻译、分析所得序
列，Blast 搜索结果参考 NCBI 网站 (www.ncbi.nlm.
nih.gov/ BLAST)。
3.3.5 PtSKOR基因 RNAi靶位片段的克隆
根据已克隆到的 PtSKOR基因全长设计特异性
引物扩增构建 RNAi靶位片段，该片段起始于起始
密码子后 1 149 bp处，终止于起始密码子后 1 746 bp
处，共 597 bp，并于正义片段(S1)上游引物(P5) 5端
加上酶切位点 XhoⅠ(CTCGAG)，下游引物(P6) 5端
加上酶切位点 KpnⅠ(GGTACC)；反义片段(S2)上游
引物(P7) 5端加上酶切位点 XbaⅠ(TCTAGA)，下游
引物(P8) 5端加上酶切位点 ClaⅠ(ATCGAT) (表 1)，
用高保真 PCR试剂盒扩增该片段，产物末端加 A、回
收纯化、连接转化及测序参照 3.3.3。
3.3.6 PtSKOR基因 RNAi植物表达载体构建
利用限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ(XbaⅠ和 ClaⅠ)
对经测序检验正确的 S1 (S2)进行双酶切，回收 597 bp
的小片段。用 XhoⅠ和 KpnⅠ双酶切中间载体
pHANNIBAL，回收大片段，然后将其与 S1 用 T4
DNA 连接酶连接，将连接产物转化至大肠杆菌
DH5α感受态细胞中，用含 50 μg/mL氨苄青霉素的
LB固体培养基进行筛选，进行 PCR与双酶切鉴定，
得到正义重组质粒 pHS1。用 XhoⅠ和 ClaⅠ双酶切
pHS1，回收大片段，然后将其与 S2连接，得到中间载
体 pHS1S2，该载体包含“正向序列-PDK intron- 反
向序列”的“hpRNA盒”，左右两边含有 SpeⅠ和 Sac
Ⅰ的酶切位点。用 SpeⅠ和 SacⅠ分别双酶切中间载
体 pHS1S2 与植物表达载体 pART27，并回收大片
段，然后用 T4 DNA 连接酶连接，最后得到具有
PtSKOR发卡反向重复序列的 RNAi植物表达载体
PtSKOR-RNAi (图 7)。
表 1实验所用引物列表
Table 1 The primers used in experiment
引物
Primer
P1
3 Primer
P2
3 Nested Primer
P3
Universal Primer A
P4
Nested Universal
Primer A
P5
P6
P7
P8
序列(5-3)
Sequence (5-3)
AGAGGACTTCCTGAGCCAGATTGTTG
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG
ACACTCAACAGCCATGCACAGTTAG
CGCTACGTAACGGCATGACAGTG
TGTCTTGGACCGGACAGCTACCG
CTAATACGACTCACTATAGGGC
CATGTACCTGGTGAGCTCCGTCA
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
CCGCTCGAGGACTTCCTGAGCCAGAT
TGTT
GGGGTACCGTTGACATTGGCTCCTCG
TTG
GCTCTAGAGACTTCCTGAGCCAGATT
GTT
CCATCGATGTTGACATTGGCTCCTCG
TTG
作者贡献
段丽婕是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；段丽婕及王沛完成数据分析，论文初稿的写作；
陈梦词参与实验设计，试验结果分析；王锁民是项目
的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文
写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31170431)、教育
部博士点基金优先发展领域项目(20130211130001)和
图 7 PtSKOR基因 RNAi植物表达载体 PtSKOR-RNAi
Figure 7 Themap of RNAi plant expression vector PtSKOR-RNAi
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兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金(lzu-
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《基因组学与应用生物学》入选中国科学引文数据库来源期刊核心库
根据 2015年 4月 7日中国科学院文献情报中心公布的 2015-2016年度中国科学引文数据库(Chinese
Science Citation Database, CSCD)收录来源期刊目录(网址 http:// sciencechina.cn/cscd_source.jsp)，我校主管主
办的《基因组学与应用生物学》成为广西唯一入选中国科学引文数据库来源期刊核心库（C库）的期刊。
目前，广西共有各种类型的期刊 198份，其中学术期刊 110份。本次入选 CSCD来源期刊扩展库(E库)
的广西省期刊有 3份，他们分别是由广西农业科学院主办的《南方农业学报》、广西植物研究所主办的《广西
植物》和在桂林的中国地质科学院主办的《中国岩溶》。
中国科学引文数据库（CSCD），被誉为“中国的 SCI”，创建于 1989年，是我国第一个引文数据库。来源期
刊分为核心库(C库)和扩展库(E库)两部分。2015-2016年度中国科学引文数据库收录来源期刊 1200份，其中
核心库 872份，扩展库 328份。被收录的期刊是在我国出版的近万份中英文学术期刊中遴选出来的优秀期刊，
涵盖数学、物理、化学、天文学、地学、生物学、农林科学、医药卫生、工程技术、环境科学及管理科学等领域。
《基因组学与应用生物学》编辑部
2015年 4月 22日
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