全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-11-04
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30470073)
作者简介:吴彦艳(1982-),华中师范大学生科院2005级研究生,研究方向为农业昆虫与害虫防治,E-mail:yanyanwu430079@sina.com
通讯作者:洪华珠(1946-),华中师范大学生科院教授,主要从事昆虫细胞培养和昆虫病理学的教学和研究工作,hzhong@mail.ccnu.edu.cn
胆固醇是昆虫细胞膜和昆虫蜕皮激素的重要组成成分,对昆虫生理活动具有极其重要的作用[1]。但由
于昆虫缺少胆固醇生物合成中的关键性酶,因此昆虫自己并不能合成胆固醇,他们只能依靠从食物摄取或
者通过共生微生物提供来满足昆虫生理与代谢活动对胆固醇的需求[2]。昆虫细胞不同于脊椎动物细胞的胞
吞作用和溶酶体摄入胆固醇,昆虫从食物中获取胆固醇需借助中肠上皮细胞的载体蛋白,胆固醇在胞内的
转运和向胞外的运输都依赖载体蛋白,SCP-2就是其中一种。
SCP-2对昆虫如此重要,但对这类蛋白的研究却很少见。近几年,该领域的研究才活跃起来。Kreb和
Lan(2003)从黄热伊蚊(Aedesaegypti)cDNA文库中鉴定了 SCP-2基因(简称 AeSCP-2)[3]。AeSCP-2与人和鼠
的 SCP-2蛋白的甾体转移结构域具有高度的同源性(69%)。她们的研究结果显示 AeSCP-2在蚊中具有胆固
醇载体蛋白的功能。同年,Dyer等进行了昆虫 SCP-2与碳 16脂肪酸配体结合的 1.35A结晶的结构测定[4]。
Lan和 Massey(2004)利用免疫电镜研究 AeSCP-2在离体和活体的亚细胞定位,结果显示 AeSCP-2定位于
中肠上皮细胞或培养蚊子细胞的细胞质、线粒体和细胞核[5]。
2005年 Blitzer等利用 RNAi技术研究了 AeSCP-2基因的功能,证明了 AeSCP-2在双翅目昆虫黄热伊
蚊中的胆固醇摄入功能[6],同时 AeSCP-2的敲除影响成虫发育,引起成虫高的死亡率还影响卵的存活率。同
年,Kim等筛选和鉴定了几种 AeSCP-2的抑制剂并做了生测实验,由于黄热伊蚊和烟草夜蛾是不同目的昆
虫,但却对 AeSCP-2抑制有相同效应,这预示着 AeSCP-2或类似的蛋白可能存在于鳞翅目昆虫中。在我国,
迄今尚未见昆虫 SCP-2方面的报道,国外有关昆虫 SCP-2的研究主要集中在双翅目昆虫,鳞翅目昆虫的研
究还是空白。利用抗 AeSCP-2多克隆抗体和棉铃虫中肠、粉纹夜蛾 Tn5B1细胞以及埃及伊蚊四龄幼虫的总
鳞翅目昆虫中甾体载体蛋白-2的初步鉴定
吴彦艳 余学全 彭建新 洪华珠
(华中师范大学,教育部农药与化学生物学重点实验室,武汉 430079)
摘 要: 甾体载体蛋白-2(SCP-2)是介导昆虫胆固醇吸收和运输的一种重要载体蛋白,已在双翅目中被发现和鉴
定。利用SDS-PAGE和westernblot鉴定鳞翅目昆虫棉铃虫和粉纹夜蛾离体培养细胞中 SCP-2的存在,结果表明棉铃虫
中肠组织和粉纹夜蛾Tn5B1细胞中确实存在SCP-2蛋白。
关键词: 鳞翅目昆虫 甾体载体蛋白-2 Western blot
TheIdentificationofSterolCarrierProtein-2inLepidoptera
WuYanyan YuXuequan PengJianxin HongHuazhu
(KeyLaboratoryofPesticide&ChemicalBiology,MinistryofEducation,HuazhongNormalUniversity,Wuhan430079)
Abstract: Sterolcarierprotein-2(SCP-2),aimportantprotein,participatesintransferandtransportofcholesterol
ininsect.IthasbeendiscoveredandidentifiedinDiptera.TheexperimentwasusingSDS-PAGEandwesternblotingto
identifywhetherSCP-2existsinLepidopteraornot.TheresultindicatedthatSCP-2ptoteinexistsinmidgutof
bolwormandTrichoplusianicels.
Keywords: Lepidoptera SCP-2protein Westernblot
2008年第2期
图 1 总蛋白 SDS-PAGE考染分析
1.marker 2.棉铃虫四龄幼虫中肠总蛋白 3.粉纹
夜蛾 Tn5B1细胞总蛋白 4.伊蚊四龄幼虫总蛋白
图 2 总蛋白转膜后的 westernblot分析
蓝、黄色条带为预染 marker1.棉铃虫四龄幼虫中肠总蛋
白 2.粉纹夜蛾 Tn5B1细胞总蛋白 3.伊蚊四龄幼虫总蛋白
吴彦艳等:鳞翅目昆虫中甾体载体蛋白-2的初步鉴定
蛋白进行 westernblot杂交,发现鳞翅目昆虫活体和离体培养的细胞内确实存在 SCP-2。这项研究为下一步
从鳞翅目昆虫中分离和鉴定出 SCP-2基因,揭示其运输胆固醇生理功能,筛选抑制剂等工作奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验昆虫和细胞
伊蚊和棉铃虫的四龄幼虫由武汉科诺生物农药有限公司馈赠。粉纹夜蛾 Tn5B1细胞由美国康奈尔大
学 Granados教授馈赠,由本实验室保存,培养基为 Grace,添加 5%的胎牛血清,28℃恒温培养 3d传代。
1.2 主要试剂
抗 AeSCP-2多克隆抗体由美国 Wisconsin-madison大学昆虫系 LanQue博士制备并馈赠,二抗为辣根
酶标记山羊抗兔 IgG为美国 Pierce产品。Tritonx-100,DTT,EDTA,PMSF,2-巯基乙醇,cocktail,SDS为
Amresco公司产品。
1.3 样品制备
分别收集棉铃虫四龄幼虫中肠 4条,处于对数生长期的 Tn5B1细胞两瓶,伊蚊四龄幼虫 6只,各加入
200μl裂解缓冲液 (0.25MTris-HclpH8.0,0.2%TritonX-100,1mMDTT,5mMEDTA,10Mm-巯基乙醇,1mMPMSF,
cocktail),冰浴 30min,12000g,4℃离心 15min,取上清,用 BCA法测蛋白质浓度。将样品与 5倍上样缓冲液
按 4:1混匀煮沸 5min,13200r/min离心 5min后用于 SDS-PAGE。
1.4 SDS-PAGE分析
上样量为 20μg/孔,分离胶的浓度是 15%,浓缩胶的浓度是 5%,150V电泳至分离胶后 120V电泳至溴
酚蓝接近凝胶底部,电泳结束后用考马斯亮蓝进行染色。
1.5 westernblot检测
SDS-PAGE同上,上样量为 80μg/孔,电泳结束后,30V转膜 1h,一抗(1:3000),二抗(1:5000)先后孵
育 2、3h,最后 DAB显色扫描保存。
2 结果
2.1 SDS-PAGE结果
3个样品的 SDS-PAGE凝胶电泳,经考马斯亮蓝染色,发现在 14.4kD~20.0kD之间可能存在目的条带,
如图 1中箭头所示。为更进一步确定这条带是否是 SCP-2蛋白,又采用抗 AeSCP-2蛋白的多克隆抗体与之
进行 westernblot杂交。
2.2 westernblot结果
将 3个样品 SDS-PAGE凝胶电泳转硝酸纤维膜后,先后与抗 AeSCP-2蛋白的多克隆抗体、辣根过氧化
物酶标记山羊抗兔 IgG结合,经显色,发现在 14.4kD~20.0kD之间确实存在目的条带,这说明在棉铃虫中
肠组织中和粉纹夜蛾离体培养的 Tn5B1细胞里存在 SCP-2蛋白。
3 讨论
本实验提取鳞翅目不同种昆虫,包括活体组织和离体培养的细胞,
以伊蚊 SCP-2为参照,提取棉铃虫中肠、粉纹夜蛾 Tn5B1细胞以及伊蚊四
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
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(上接第154页)
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龄幼虫的总蛋白进行了 SDS-PAGE,发现在 14.4kD~20.0kD之间相同的位置存在蛋白带,用抗 AeSCP-2的
多克隆抗体与 3种样品的总蛋白进行 westernblot杂交,发现这些组织和细胞中确实存在目的蛋白,这就说
明了在鳞翅目昆虫体内是存在具有 SCP-2结构域蛋白,且鳞翅目昆虫的 SCP-2蛋白和伊蚊的 SCP-2蛋白
极有可能是同一种蛋白,但不排除这两个目的 SCP-2蛋白存在某方面的差异,但这只是猜测,可以肯定的
是它们都含有胆固醇载体结构域,都属于同一家族。本实验只是初步的鉴定,要想证实它们是同一种蛋白,
还需进一步测定其分子结构,分离和鉴定其基因等诸多方面的研究。
2005年,Kim等筛选和鉴定了几种 AeSCP-2的抑制剂,这些抑制剂可与胆固醇竞争 AeSCP-2,与
AeSCP-2有相当高的亲和力。通过黄热伊蚊和烟草夜蛾的活体生测显示,抑制剂具有潜在杀虫剂活性和性
质,并表现出和活体相似效应,但对哺乳动物鼠细胞基本无毒性,对昆虫具有特异性[7]。显然,AeSCP-2是重
要的靶标蛋白,通过干扰或抑制 AeSCP-2的作用,阻断胆固醇转运途径,可控制黄热伊蚊种群数量和危害。
那么,同样也可以在鳞翅目害虫中找到同类的新靶标,开发新型的对脊椎动物安全的杀虫剂,从根本上控
制害虫的种群数量。近年来,由于棉铃虫对化学杀虫剂和生物杀虫剂抗性的持续增加,严重威胁着棉花产
量和相关行业的可持续发展,寻找新的靶标,并以此为基础开发、研制出新型、高效、环保的杀虫剂是害虫
防治的首要任务。SCP-2正是针对阻断昆虫代谢活动、阻碍或影响昆虫发育的情况下寻找到的新靶标,由
此非常有必要继续进行 SCP-2基因鉴定、SCP-2蛋白在鳞翅目昆虫中的分布和亚细胞定位、研究 SCP-2基
因在棉铃虫胆固醇转运中的功能及对其发育的影响以及该基因在昆虫中存在的普遍性,从分子水平阐明
SCP-2作用的机制等,同时要以 SCP-2蛋白作为分子靶标,筛选该蛋白的抑制剂,为开发新的杀虫剂防治
棉铃虫提供理论依据。
参考 文献
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