全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
宏基因组技术在开发极端环境未培养
微生物中的应用
朱允华1，2，3 李俭1，2 方俊1，2 田云1，2 卢向阳1，2
(1湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128;2湖南省农业生物工程研究所，长沙 410128;
3南华大学药学与生命科学学院，衡阳 421001)
摘 要: 人类对自然环境中约 99%的微生物不能用传统的方法进行纯培养，对于极端环境中的微生物更是知之
甚少。随着宏基因组技术的出现，人们可对这一庞大的未知世界进行多方面研究。目前研究者利用这一技术已经对地
球上的多种极端生境进行了研究，并取得了很多新的成就。简要概述这一技术在极端环境未培养微生物研究中的
应用。
关键词: 宏基因组技术 极端环境 未培养微生物
Application of Metagenomic Technique in the Exploring of
Uncultured Microbial in Extreme Environments
Zhu Yunhua1，2，3 Li Jian1，2 Fang Jun1，2 Tian Yun1，2 Lu Xiangyang1，2
(1College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128;
2Hunan Agricultural Bioengineering Research Institute，Changsha 410128;
3College of Pharmacy and Life Science，Nanhua University，Hengyang 421001)
Abstract: It is known that about 99% microorganisms in natural environment couldn’t be obtained their pure culture by tradi-
tional culture methods，but for extremophiles of extreme conditions is poorly understood． With the emergence of metagenomic technolo-
gy，people could investigate the immense and unknown world of microorganisms in many ways． Investigators have studied many extreme
habitats of the earth by this technology and acquired many novel accomplishments． The application of metagenomics for investigation of
uncultured microorganisms in extreme environments has been briefly summarized in this paper．
Key words: Metagenomic Extreme environments Uncultured microbial
收稿日期:2011-04-11
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划(2008BADC4B08) ，科技部国际科技合作项目(S2010GR0966)
作者简介:朱允华，女，博士研究生，研究方向:微生物学;E-mail:yhzhu67@ 126． com
李俭为并列第一作者
通讯作者:卢向阳，教授，E-mail:xiangyangcn@ 163． com;田云，副教授，E-mail:tianyun79616@ 163． com
微生物世界是分子多样性最大的天然资源库，
基于菌株水平的传统分离培养技术为人们认识微生
物多样性提供了可能，但是传统的分离培养方法限
制了认识微生物世界的视野。目前已知的微生物资
源种类仅占实有总数的 1% － 10%，对于能在极端
环境中生存的微生物更是知之甚少。极端微生物经
长期自然选择，具有独特的基因类型，特殊的生理机
制和代谢产物。作为地球上的边缘生命现象，它在
生命起源、系统进化等方面将给人们许多重要的启
示，在生命行为的原理上也将拓展人们的概念。极
端微生物的存在，具有极大的应用价值。但是目前
自然环境中超过 99%的微生物不能用传统的方法
进行纯培养［1］，因而也不能对它们开展依赖于纯培
养的生物技术或基础方面的研究。近年来发展起来
的宏基因组学，利用分子生物学的研究方法绕过纯
培养技术来研究微生物的多样性及功能，提供了一
种探知微生物多样性结构和功能基因组的免培方
法，是一条寻找新基因及其产物的新途径。极端环
2011 年第 9 期 朱允华等:宏基因组技术在开发极端环境未培养微生物中的应用
境中存在着大量传统培养方法难以再现的特殊微生
物，通过宏基因组学技术不仅可以挖掘这些新物种，
而且有助于了解其耐受机理，帮助极端环境的污染
修复。
1 极端环境与极端微生物
极端环境(extreme environment)泛指存在某些特
殊物理和化学状态的自然环境，包括高温、低温、强
酸、强碱、高盐、高压、高辐射、高浓度重金属离子和低
营养缺氧等极端环境，如温泉、南北极地或高山冰川、
盐湖、碱湖、酸矿水、酸性热泉和深海底等。另外，还
有某些特殊环境，如油田、矿山、沙漠的干旱地带、地
下的厌氧环境和高卤环境等。适合在极端环境中生
活的微生物称为极端微生物(extremophiles)［2］。
目前，极端微生物已成为国际研究的热门领域，
这主要是极端微生物通过漫长的自然演化而拥有能
维持其在极端环境下生存的特殊生理和遗传功能。
这些特殊功能不仅吸引了研究者的重视，更激发了
工业界对其应用的潜在兴趣。运用极端微生物的特
殊代谢机制和产物，将使某些新的生物技术手段成
为可能，同时也是奠定高效率低成本生物技术新工
艺的基础。日本、美国及欧洲的许多国家都启动了
极端微生物的研究计划，在揭示生命形式的奥秘，并
利用其特殊机制和特殊方面的努力和竞争，已形成
了国际趋势。因此，极端微生物为更好地认知生命
现象、发展生物技术提供了新的机会，是微生物学科
发展的新生长点。近年来，在分子生物学、基因组学
和蛋白质组学等方面对极端微生物的研究已取得诸
多重要进展，主要研究工作包括新物种的发现、新产
物的研究与生产、极端酶的结构与功能及其基因的
克隆与表达、适应机理的分子基础及遗传原理、基因
组分析［3］。
2 未培养微生物
未培养微生物(uncultured microorganisms)是指
利用分子生物学技术能够检测到，迄今所采用的微
生物纯培养分离、培养方法还未获得纯培养的微生
物［4］。顾名思义，未培养微生物资源(uncultured mi-
crobial resources)即蕴藏于这类微生物中的可供人
类开发利用的直接的和潜在的生物资源。由于这类
微生物在自然环境微生物群落中占有较高的百分比
(约为 99%) ，无论是其物种类群，还是新陈代谢途
径、生理生化反应、产物等都存在着不同程度的新颖
性和丰富的多样性，因而其中势必蕴涵着巨大的生
物资源。
3 宏基因组学的发展历史
宏基因组(metagenome)是由 Handelsman 等［5］
提出的新名词，其定义为“the genomes of the total
microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物
遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的
微生物的基因，避开了微生物分离培养的问题，极大
地扩展了微生物资源的利用空间。目前主要指环境
样品中的细菌和真菌的基因组总和。也可指特定环
境或共生体内所有生物遗传物质的总和，是一种不
依赖于人工培养的微生物基因组分析技术。而所谓
宏基因组学(metagenomics)就是一种以环境样品中
的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选
和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结
构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之
间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
4 宏基因组学研究的技术途径
宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原
理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库
目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般包括从环
境样品中提取基因组 DNA，克隆 DNA 到合适的载
体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作(图 1)。
5 宏基因组技术在极端环境未培养微生物
研究开发中的应用
宏基因组技术充分利用了生物学和生物技术手段，
使研究人员能够分析占微生物种类 99%以上的传
统途径触及不到的基因资源。与核酸杂交技术和
DNA指纹图谱技术相比，宏基因组技术包含的信息
量更大，能够更加全面地研究微生物复杂群落结构
和功能基因多样性。尤为重要的是，研究人员可以
从宏基因文库中筛选得到大量来源于未培养微生物
的功能基因，因此构建极端环境微生物宏基因组文
库，如极地、冰川、热泉和深海等环境，鉴定极端环境
中存在的酶，将是一个前景非常广阔的开发工业用
酶的新途径。目前利用宏基因组技术构建的极端环
境微生物宏基因组文库以及筛选的目的基因，如表
1 所示。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
图 1 宏基因组学研究的技术途径
5． 1 宏基因组技术在高温、低温环境未培养微生物
研究开发中的应用
广泛分布在温泉、火山地、地热区土壤及海底火
山口附近的嗜热微生物，由于具有生长速率高、代谢
活动强、产物得率高和培养时不易污染杂菌等优点，
特别是由其产生的高温酶因作用温度高和热稳定性
好等突出优点，嗜热微生物在生产实践和科学研究
中有着广阔的应用前景。石琰璟等［6］为克隆温泉
菌中耐热的新型木聚糖酶基因，通过提取墨温泉样
品的基因组 DNA，构建了一个包括 1． 2 × 105左右克
隆的宏基因组文库。文库总容量约为 3． 0 × 105 kb，
插入所需大小片段的成功率达 87%。Kim 等［40］以
堆肥为材料构建起一个约 23 400 个克隆的 Fosmid
宏基因组文库，采用功能筛选法获得 19 个碱性酯
酶。Rhee等［13］从来自热泉的泥和沉积物 fosmid 宏
基因组文库中筛选到 4 个热稳定酯酶，过表达的重
组酯酶在 95℃下依然有较高的热稳定性。
最适生长温度低于 15℃、最高生长温度低于
20℃和最低生长温度 0℃以下的细菌、真菌和藻类
等嗜冷微生物，主要分布在极地、深海、高山、冰窖和
冷藏库等处。嗜冷微生物产生的低温酶在低温环境
下具有较高的催化活性，因而在生命冷适应机制研
究、低温洗涤用酶及低温发酵等生物技术领域具有
广阔的应用前景。张宇宏［41］从中国新疆一号冰川
土壤中直接提取微生物宏基因组 DNA，使用引物
CLF和 CLR扩增脂肪酶基因片段，扩增产物连接载
体转化大肠杆菌构建了冰川土壤低温脂肪酶基因片
段文库。赵晶等［9］直接提取南极中山站排污口土
壤样品微生物总基因组 DNA，以黏粒(SuperCos1)
为载体构建了宏基因组文库，通过差异性 DNA修复
试验法对文库筛选，获得 13 个具有抗肿瘤活性的克
隆子。Zhang 等［16］从南极普利兹湾深海 900 m深的
沉积物中提取获得宏基因组 DNA，并通过设计引
物，从中克隆到全长为 948 bp 的低温脂肪酶(lip3)
开放阅读框完整序列，该基因编码一个由 315 个氨
基酸残基组成、预计分子质量为 34． 557 kD 酶蛋白
(Lip3)。
5． 2 宏基因组技术在强酸、强碱及高盐环境未培养
微生物研究开发中的应用
生活在高盐浓度环境中的嗜盐微生物以及在极
端 pH值下能够生存嗜酸 /碱微生物，它们产生的各
种碱性酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等在洗涤剂、
造纸、食品、医药、环境整治及其他化学工业中的应
用潜力极大。孙栋［10］以高盐极端环境下的土壤为
研究对象，构建了 Cosmid 宏基因组文库，通过高通
量的淀粉酶筛选，共筛选到 12 个阳性克隆。蒋承建
等［25］采用 β-葡萄糖苷酶的活性筛选策略，从构建的
碱性土壤宏基因组文库进行筛选，得到一个表达 β-
葡萄糖苷酶活性的阳性克隆。生物信息学分析表明
该克隆所包含的外源 DNA片段编码一个由 151 个
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2011 年第 9 期 朱允华等:宏基因组技术在开发极端环境未培养微生物中的应用
表 1 已构建的极端环境宏基因组文库特征及其目的基因筛选应用实例
环境样品 目的基因 宿主 载体 克隆子数 插入片段大小(kb) 参考文献
温泉水 耐热新型木聚糖酶 E． coli DH5α pUC18 120 000 ［6］
深海沉积物 低温脂肪酶 E． coli EPI300-T1R pCC1FOS
8 823
7 000
21 － 40
24 － 39
［7，8］
南极土壤 抗肿瘤活性物质 E． coli Cosmid 27 000 35 ［9］
高盐土壤 淀粉酶 E． coli DH5α pLAFR3 15 600 15 － 23 ［10］
深海土样 β-内酰胺酶 E． coli EPI300 Plasmid 8 823 32． 3 ［11］
地热沉积物 亚铁血红素合成酶、磷酸二脂酶 E． coli TOP10 pCR-XL-TOPO 37 000 1 － 10 ［12］
嗜热泥和沉积物 热稳定酯酶 E． coli EPI300 Fosmid 5 000 20 － 40 ［13］
沼气池 β-葡萄糖苷酶 E． coli EPI100 pWEB:TNC 30 000 21 － 60 ［14］
北极深海沉积物 适冷性酯酶 E． coli EPI300-T1R pCC1FOS 60 132 2 － 3 ［15］
南极深海沉积物 适冷性脂肪酶 E． coli BL21(DE3) pUC118 28 000 1 － 5 ［16］
荷斯坦奶牛瘤胃 淀粉酶、纤维素酶 E． coli EPI300 pCC1BAC 15 360 40 － 70 ［17］
奶牛瘤胃 脂肪酶 E． coli EPI300 pCC1BAC 15 360 54． 5 ［18］
牛瘤胃 β-葡萄糖苷酶 E． coli EPI100 pWEB:TNC
12 000
21 000
31． 5 － 45． 5;
20． 5 － 48． 0
［19，20］
牛瘤胃 多酚氧化酶 E． coli XL1-Blue MRF λ噬菌体 ［21］
兔盲肠 β-葡萄糖苷酶 E． coli DH5α pUC18 9 000 1． 5 － 4． 5 ［22］
极端环境 漆酶 E． coli DH5α pGEM-T ［23］
碱性污染土壤 脱羧酶、β-葡萄糖苷酶 E． coli DH5α pGEM-3Zf(+) 30 000 3． 5 ［24，25］
堆肥 纤维素酶 E． coli EPI100 pWEB:TNC 100 000 20 － 50 ［26］
造纸废水纸浆沉淀物 纤维素酶 E． coli EPI100 pWEB:TNC 10 000 20． 7 － 45． 4 ［27］
深海沉积物 水溶性黑色素 E． coli EPI300-T1R pCC1FOS 39 600 24 － 45 ［28］
深海沉积物 蛋白酶 E． coli EPI100-T1 pWEB:TNC 7 000 35 ［29］
酸性水渗出液 羧酸酯酶 E． coli EPI100-T1R pEpiFOS-5 1 400 000 35 ［30］
土壤 耐盐纤维素酶 E． coli pWE15 1 700 22 ［31］
活性污泥 双加氧酶 E． coli EPI300 pCC1FOS 96 000 33 ［32］
活性污泥 酯酶 E． coli EPI300-T1R pCC2FOS 100 000 28 － 40 ［33］
堆肥 乳酸解聚酶 E． coli DH10B pUC18 40 000 2． 5 ［34］
沼泽地 4-羟基苯丙酮双加氧酶 E． coli DH5α pSuperCosI 30 000 38 － 40 ［35］
堆肥 多种水解酶 E． coli DH5α pJOE930 31 967 1． 2 － 6． 4 ［36］
海水 酯酶 E． coli EPI300 pIndigoBAC5 20 000 70 ［37］
海绵 酯酶 E． coli DH10B pHSG398 26 496 3 － 5 ［38］
深海沉积物 聚酮合酶 E． coli EPI300-T1R pCC2FOS 30 － 50 ［39］
堆肥 碱性酯酶 pCC2FOS 23 400 30 － 45 ［40］
氨基酸编码组成的多肽。Rashamuse［30］从酸性水渗
出液 Fosmid宏基因组文库中筛选到长为 1 281 bp
的羧酸酯酶基因，该基因编码一个由 427 个氨基酸
组成的蛋白质。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
5． 3 宏基因组技术在高压、缺氧环境未培养微生物
研究开发中的应用
嗜压微生物一般生活在深海底，能耐普通微生
物不能忍耐的高压。多数生长在 0． 7 － 0． 8 MPa 的
环境中，高的达 1． 04 MPa以上，低于 0． 4 － 0． 5 MPa
则不能生长。Huang［28］提取南海沉积物微生物基因
组 DNA，从构建的 Fosmid宏基因组文库中筛选到一
个水溶性黑色素基因。Jiao［39］以东海沉积物为材
料，通过核酸杂交从构建的 Fosmid 宏基因组文库中
筛选到一些聚酮合酶基因簇，并表明该文库中有许
多新的聚酮合酶基因簇。
由于肠道环境及其中微生物系统的复杂性，传
统的分析方法如平板培养法具有很大的局限性。近
年来国际学术界倾向于从环境微生物群体基因组的
角度来研究其多样性及功能，取得了许多新成果。
马淑华［22］采用宏基因组学研究手段，构建兔盲肠内
微生物宏基因组文库，从中成功筛选获得一个新的
与纤维素降解相关的基因 β-葡萄糖苷酶基因，并且
对其相应酶进行了酶学性质分析。赵圣国等［18］利
用含有三油酸甘油酯的脂肪酶选择性筛选培养基，
从奶牛瘤胃微生物元基因组文库 15 360 个克隆中，
筛选到了 18 个脂肪酶阳性克隆，其插入片段大约为
60 kb，并且各个克隆的插入片段各不相同。利用 p-
NPP法对脂肪酶克隆的脂肪酶活性分析，表明均具
有大小不等的脂肪酶活性。本实验室以食木白蚁肠
道微生物为材料，构建起白蚁肠道未培养微生物宏
基因组文库。经对文库的鉴定分析，该文库库容
32． 95 kb，共保存 9 061 个克隆。采用功能筛选法，
获得 4 个预测可降解木质素的活性克隆，目前已在
进行进一步的鉴定。
6 结语
长期以来，微生物学工作者们主要依赖于分离
培养的方法来研究微生物，但这仅仅涉及庞大的微
生物世界的 1%左右。宏基因组学的出现改变了微
生物学家研究问题的方法，它已经广泛应用于生物
学和生物技术领域，也将进一步加深人们对地球上
一些特殊生境的认识，如深海热流排放口、酸性热
泉、永久冻土、沙漠、南极冰湖、人类的口腔和内脏、
白蚁和毛虫的内脏、植物的根际和叶际及地衣共生
的真菌等，其潜力将是无限的。极端环境微生物是
一大类超越人们想象的丰富的生物资源，是极其珍
贵的科研素材，但极端微生物的某些特殊情况纯培
养难以实现。因此可以预计，今后通过宏基因组技
术发现的新基因和物种将会超过对单个的微生物进
行测序而鉴定的基因和物种。
但是，作为一项极具应用前景的新技术，宏基因
组技术仍然还有许多技术难点亟待解决，一是环境
样品基因组 DNA的提取与纯化，针对不同的样品并
没有统一的方法。构建一个成功的宏基因组文库，
样品是首要考虑的问题，极端环境中生态环境比较
复杂，微生物为了适应这种复杂的生境，必定会产生
一些较为特殊的物质来抵抗复杂环境下生存的压
力，根据基因和环境的相互作用，用极端环境下样品
构建宏基因组文库来筛选新基因具有较大的可能
性。但是环境中存在各种抑制物(腐殖酸、腐殖酸
样物、酚类化合物、鞣酸类和重金属铁离子等) ，尤
其是腐殖酸，它是影响提取 DNA纯度的主要因素之
一。腐殖酸与 DNA共提取并与之紧密结合，导致很
难与 DNA分离，随着近几年在这方面的研究发展，
目前已有多种方法能降低纯化 DNA 中腐殖酸的含
量，使其浓度达到不抑制聚合酶反应的浓度，但尚未
发现一条能完全去除提取中腐殖酸的途径，由于腐
殖酸对酶切和连接反应有抑制作用，且不同环境样
品中腐殖酸的成分和含量不同，这给人们寻求通用
的纯化方法造成了一定的困难。二是真菌文库构
建。真菌是很多工业化生产酶制剂的来源菌，未培
养真菌资源的开发将为生物技术领域提供广阔的发
展空间。然而由于真核基因存在大量内含子，现行
的环境宏基因组学技术尚不能应用于真核微生物资
源。三是宏基因组文库的构建和分析。如宏基因组
的代表性、文库的构建和适宜地存储与筛选手段、异
源表达等。功能分析法需要许多方法上的改进，其
中最重要的是提高异源基因的表达和从巨大的文库
中有效地筛选目标克隆。另外，宏基因组学研究涉
及领域广、工作量巨大，单个人员或实验室很难建立
起所有环境样本的取样、建库、筛选等一系列方法体
系，或在短期内获得环境样品基因库中的所有靶标。
因此，载体的设计和筛选、文库的构建、异源基因表
达等技术的提高将会促进宏基因组技术的发展，特
别是高含量、高质量 DNA的获得和表达宿主的选择
65
2011 年第 9 期 朱允华等:宏基因组技术在开发极端环境未培养微生物中的应用
是影响整个技术普及和应用的关键问题。
参 考 文 献
［1］Amann RI，Ludwig W，Schleifer KH． Phylogenetic identification and
in situ detection of individual microbial cells without cultivation． Mi-
crobiol Rev，1995，59:143-169．
［2］马延和．极端微生物———新的生命形式．微生物学通报，1999，26
(1) :80．
［3］林影，卢德． 极端酶及其工业应用． 工业微生物，2000，30(2) :
51-55．
［4］Colwell RR，Grimes DJ． Nonculturable microorganisms in the envi-
ronment［M］． Washington，D． C:ASM Press，2000:57-75．
［5］Handelsman J，Rondon MR，Brady SF，et al． Molecular biological ac-
cesses to chemistry of unknown soil microbes:A new frontier for nat-
ural products． Chem Biol，1998，5(10) :245-249．
［6］石琰璟，刘财钢，葛晓萍．温泉菌宏基因组文库的构建．科学技术
与工程，2009，9(17) :5097-5099．
［7］ Jeon JH，Kim JT，Kim YJ，et al． Cloning and characterization of a
new cold-active lipase from a deep-sea sediment metagenome． Appl
Microbiol Biotechnol，2009，81:865-874．
［8］Hardeman F，Sjoling S． Metagenomic approach for the isolation of a
novel low-temperature-active lipase from uncultured bacteria of ma-
rine sediment． FEMS Microbiol Ecol，2007，59:524-534．
［9］赵晶，杨祥胜，曾润颖．南极土壤微生物宏基因组文库构建及其
抗肿瘤活性初探．自然科学进展，2007，17(2) :267-271．
［10］孙栋．高盐极端环境土壤宏基因组文库的构建及一个新的淀粉
酶基因的克隆［D］．南宁:广西大学，2005．
［11］Song JS，Jeon JH，Lee HJ，et al． Molecular characterization of TEM-
type beta-lactamases identified in cold-seep sediments of Edison
Seamount(south of Lihir Island，Papua New Guinea)． J Microbiol，
2005，43(2) :172-178．
［12］Wilkinson DE，Jeanicke T，Cowan DA． Efficient molecular cloning
of environmental DNA from geothermal sediments． Biotechnol Lett，
2002，24(2) :155-161．
［13］Rhee JK，Ahn DG，Kim YG，et al． New thermophilic and thermo-
stable esterase with sequence similarity to the hormone-sensitive li-
pase family，cloned from a metagenomic library． Appl Environ Mi-
crobiol，2005，71(2) :817-825．
［14］唐咸来，车志群，李双喜，等．沼气池宏基因组文库中未培养微
生物 β-葡萄糖苷酶基因的克隆与鉴定． 广西植物，2008，28
(6) :790-794．
［15］ Jeon JH，Kim JT，Kang SG，et al． Characterization and its potential
application of two esterases derived from the arctic sediment met-
agenome． Mar Biotechnol，2009，11:307-316．
［16］Zhang JW，Shu L，Zeng RY． Cloning，expression，and characteriza-
tion of a cold-adapted lipase gene from an antarctic deep-sea psy-
chrotrophic bacterium，Psychrobacter sp． 7195． J Microbiol Biotech-
nol，2007，17(4) :604-610．
［17］朱雅新，王加启，马润林，等．荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组
BAC文库的构建与分析．微生物学报，2007，47(2) :213-216．
［18］赵圣国，王加启，刘开朗，等．奶牛瘤胃微生物元基因组文库中
脂肪酶的筛选与酶学性质． 生物工程学报，2009，25(6) :
869-874．
［19］Zhao GC，Duan CG，Pang H，et al． Cloning and identification aβ-
glucosidase gene umbgl 3A of uncultured bacteria from bovine ru-
men． Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2005，18
(4) :472-476．
［20］郭鸿，封毅，莫新春，等．水牛瘤胃宏基因组的一个新的 β-葡萄
糖苷酶基因 umcel3G 的克隆、表达及其表达产物的酶学特性．
生物工程学报，2008，24(2) :232-238．
［21］Beloqui A，Pita M，Polaina J，et al． Novel polyphenol oxidase mined
from a metagenome expression library of Bovine Rumen． J Biol
Chem，2006，281(32) :22933-22942．
［22］马淑华． 兔盲肠宏基因组中 β-葡萄糖苷酶基因的分离研究
［D］．重庆:西南大学，2008．
［23］黄循柳，黄仕杰，郭丽琼，等．宏基因组漆酶基因片段的克隆与
分析．土壤学报，2009，46(4) :746-751．
［24］ Jiang C，Wu B． Molecular cloning and functional characterization of
a novel decarboxylase from uncultured microorganisms． Biochem
Bioph Res Co，2007，357(2) :421-426．
［25］蒋承建，李双喜，中佩弘，等．一种新型 β-葡萄糖苷酶基因的分
析．中国酿造，2009(5) :42-45．
［26］Pang H，Zhang P，Duan CJ，et al． Identification of cellulase genes
from the metagenomes of compost soils and functional characteriza-
tion of one novel endoglucanase． Curr Microbiol，2009，58:404-408．
［27］许跃强，段承杰，周权能，等．造纸废水纸浆沉淀物中未培养微
生物纤维素酶基因的克隆和鉴定． 微生物学报，2006，46(5) :
783-788．
［28］ Huang YL，Lai XT，He XC，et al． Characterization of a deep-sea
sediment metagenomic clone that produces water-soluble melanin in
Escherichia coli． Mar Biotechnol，2009，11:124-131．
［29］郭巧玲，杨祥胜，赵晶曾，等．深海沉积物宏基因组文库中产蛋
白酶克隆的筛选及性质分析． 应用与环境生物学报，2009，15
(4) :507-510．
［30］Rashamuse K，Magomani V，Ronneburg T，et al． A novel family VIII
carboxylesterase derived from a leachate metagenome library exhib-
its promiscuous β-lactamase activity on nitrocefin． Appl Microbiol
Biotechnol，2009，83:491-500．
［31］Voget S，Steele HL，Streit WR． Characterization of a metagenome-
derived halotolerant cellulase． Journal of Biotechnology，2006，126:
26-36．
［32］Suenaga H，Ohnuki T，Miyazaki K． Functional screening of a met-
agenomic library for genes involved in microbial degradation of aro-
matic compounds． Environmental Microbiology，2007，9 (9) :
75
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
2289-2297．
［33］Zhang T，Han WJ，Liu ZP． Gene cloning and characterization of a
novel esterase from activated sludge metagenome． Microbial Cell
Factories，2009，8:67-90．
［34］Mayumi D，Akutsu-Shigeno Y，Uchiyama H，et al． Identification and
characterization of novel poly(DL-lactic acid)depolymerases from
metagenome． Appl Microbiol Biotechnol，2008，79:743-750．
［35］Lee CM，Yeo YS，Lee JH，et al． Identification of a novel 4-hydroxy-
phenylpyruvate dioxygenase from the soil metagenome． Biochemical
and Biophysical Research Communications，2008，370:322-326．
［36］Lammlea K，Zipper H，Breuer M，et al． Identification of novel en-
zymes with different hydrolytic activities by metagenome expression
cloning． Journal of Biotechnology，2007，127:575-592．
［37］Chu XM，He HZ，Guo CQ，er al． Identification of two novel estera-
ses from a marine metagenomic library derived from South China
Sea． Appl Microbiol Biotechnol，2008，80:615-625．
［38］Okamura Y，Kimura T，Yokouchi H，et al． Isolation and character-
ization of a GDSL esterase from the metagenome of a marine sponge-
associated bacteria． Mar Biotechnol，2010，12(4) :395-402．
［39］Jiao YL，Wang LH，Dong XY，et al． Isolation of new polyketide syn-
thase gene fragments and a partial gene cluster from East China Sea
and function analysis of a new acyltransfrase． Appl Biochem Bio-
technol，2008，149(1) :67-78．
［40］Kim YH，Kwon EJ，Kim SK，et al． Molecular cloning and character-
ization of a novel family VIII alkaline esterase from a compost met-
agenomic library． Biochem Biophys Res Commun，2010，393(1) :
45-49．
［41］张宇宏．冰川土壤低温脂肪酶基因多样性研究及其基因克隆
［D］．北京:中国农业科学院，2008．
(责任编辑 狄艳红
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 51 页)
［17］Lee SH，Walker DR，Cregan PB，et al． Comparison of four flow cyto-
metric SNP detection assays and their use in plant improvement．
Theor Appl Genet，2004，110:167-174．
［18］Hadd A，Laosinchai W，Novak C，et al． Microsphere bead arrays and
sequence validation of 5 /7 /9T genotypes for multiplex screening of
cystic fibrosis polymorphisms． J Mol Diagn，2004，6:348-355．
［19］Paradis FP，Simard R，Gaudet D． Quantitative assay for the detection
of the V617F variant in the Janus kinase 2(JAK2)gene using the
Luminex xMAP technology． BMC Medical Genetics，2010，11:54．
［20］Fulton R，Mcdade R，Smith P，et al． Advanced multiplexed analysis
with the FlowMetrixTM system． Clin Chem，1997，43(9) :1749-1756．
［21］Yang L，Tran D，Wang X． Beads Array for the detection of gene ex-
pression，a high throughput diagnostic bioassay． Genome Res，2001，
11:1888-1898．
［22］Fantozzi A，Ermolli M，Marini M，et al． Innovative application of flu-
orescent microsphere based assay for multiple GMO detection． Food
Anal，2008，1:10-17．
［23］刘思瑶，丁显平，朱一剑，等．液相芯片技术在人乳头瘤病毒检
测和分型中的应用．四川大学学报，2007，44(5) :1111-1114．
［24］夏骏，邓菲，胡志，等． 用液相芯片方法检测禽流感病毒 H5N1
亚型的研究．检验医学，2009，24(9) :682．
［25］詹爱军，王新卫，花群义，等．西尼罗热液相芯片快速检测方法
的初步建立．扬州大学学报，2010，31(1) :1-5．
(责任编辑 狄艳红)
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