全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
原核生物的 NHEJ修复途径
殷亮 宣慧娟 鲁琳 杨志伟
(首都师范大学生命科学学院,北京 100048)
摘 要: DNA双链断裂 ( DSBs)是严重的 DNA损伤形式之一,生物体对 DSB s的修复可通过同源重组 ( HR )或非同源末
端连接途径 ( NHE J)进行。长期以来, 人们普遍认为 HR是细菌 DSBs修复的惟一途径, 但在分支杆菌和其它原核生物体内
NHEJ途径的发现,使这一观念得以颠覆。最近的研究表明, 细菌 NH EJ修复系统是一个双组分系统, 包含一个多功能的 DNA
连接酶 ( L igD )和 DNA末端结合蛋白 Ku, 具有 DSBs修复所需的断裂末段识别、末端加工和连接活性。重点综述细菌 NHE J修
复系统的组成、结构以及生理功能。
关键词: DNA双链断裂 ( DSBs) 非同源末端连接途径 Ku蛋白 DNA连接酶
Nonhomologous End Joining Pathway in Prokaryotic Cells
Y in L iang XuanH uijuan Lu L in Yang Zh iwei
(Collage of L ife Science, CapitalN ormal University, Beijing 100048)
Abstrac:t DNA doub le strand breaks are one of themost letha l fo rm s of DNA dam age. Two m ajor pathw ay s, hom o logous recomb i
nation(HR ) and nonhom o logous end jo in ing ( NHE J), have evo lved to repa ir DSBs. It has been considered for a long tim e tha tHR is
the only pathw ay for DSB s repa ir in bacter ia. H owever, this notion has been ove rturned by the discovery of NHE J in mycobac teria and
o ther prokaryo tic organ ism s. Recen t studies have proved tha t bac teria lNHEJ com plex is a tw ocom ponen t sy stem, conta in ing a mu lti
functional DNA ligase( L igD ) and DNA term inal b inding prote in Ku, w hich possess a ll of the endrecogn izing, processing, gapfilling and
liga tion activ ities required fo rDSBs repair. The recent d iscover ies on the structure and physio log ica l functions o f bacter ia lNH EJ appara
tus w ere rev iewed br iefly.
Key words: DNA doub le strand breaks( DSBs) Nonhom ologous end jo ining Ku prote in DNA ligase
收稿日期: 20100121
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30670035) ,北京市教委科技发展面上项目 (KM200510028011)
作者简介:殷亮,男,硕士研究生,研究方向:微生物分子生物学
通讯作者:杨志伟,女,副教授,硕士生导师, Em ai:l yangzw@ m ai.l cnu. edu. cn
DNA在复制过程中或在内外源其它因素的影
响下可能发生 DNA双链断裂 ( DNA doublestrand
breaks, DSB s),如果不加以修复,将会严重影响细胞
的存活。DSBs的修复机制主要有两种, 即同源重组
途径 ( homo logous recombinat ion, HR )和非同源末端
连接途径 ( nonhomo logous end jo ining, NHE J) ,二者
修复机理明显不同。在 HR中, 断裂的基因组以另
一条完整的姐妹染色单体作为修复模板来填补缺口。
而 NHEJ不依赖同源染色体 DNA模板, 即在只有一
个染色体拷贝的情况下也能正常进行修复。在 NHEJ
中,末端结合蛋白 Ku首先使断裂的 DNA链彼此靠
近,然后再由专一性 DNA连接酶封闭缺口。与高保
真的 HR修复相反, NHE J可以是高保真的 如果
缺口被直接封闭;也可以带来突变 如果断裂部位
被核酸酶或 DNA聚合酶进行重塑 (图 1)。
在真核细胞中发现 NHEJ后, 利用生物信息学
的手段很快检测到细菌中也存在同样的修复途径。
在细菌基因组中, 经常观察到在 Ku基因附近有
ATP依赖型 DNA连接酶的编码序列。通过对分支
杆菌 (Mycobacterium )、假单胞菌 (P seudomonas)、芽
胞杆菌 (Bacillus)和农杆菌 ( Agrobacterium )的 Ku蛋
白及 ATP依赖型 DNA连接酶的生化性质、结构特
征的研究,揭示了原核生物 NHEJ途径的独特机理
和酶学成分 [ 1, 2]。就细菌 NHEJ途径的研究进展做
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
一综述,重点阐述 NHEJ主要组分 Ku和 DNA连
接酶的组成和结构, 以及 NHEJ修复的分子机制和
生理意义。
图 1 双链 DNA断裂的同源重组和非同源
末端连接修复途径 [ 1]
1 细菌 NHEJ修复途径的组成
1. 1 Ku蛋白
细菌 Ku蛋白大小约为 30- 40 kD, 形成同型二
聚体, 而真核生物 Ku蛋白要大得多, 约为 75 - 85
kD,形成 Ku70 /Ku80异二聚体。真核 Ku蛋白还具
有保守的 vWA结构域和 SAP结构域, 这两个结构
域分别介导蛋白质与蛋白质相互作用以及蛋白质与
DNA相互作用,与真核生物 NHEJ系统的高度进化
相一致。此外, SAP结构域还维持端粒的稳定性
有关 [ 3, 4]。
对人类 Ku70 /80的晶体结构分析表明, Ku蛋
白具有相似的折叠特征。Ku蛋白形成一个开环状
结构, 将 DNA固定在其中。真核和原核生物 Ku蛋
白具有保守的核心区域,长约 234- 280氨基酸,形
成两个结构不同的亚结构域, 其中 N端 85个氨基
酸保守性较差,以 链为主, 其余部分具有很强的
保守性,形成 /结构。核心区域参与 Ku蛋白的
二聚化以及与 DNA的结合 [ 4 ]。
在细菌 NHEJ修复途径中, Ku蛋白可以识别并
稳定 DSBs双链末端, 保护末端不被核酸酶降解。
当 Ku与 DSBs结合后, 招募 L igD进行断裂末端的
修复。
1. 2 DNA连接酶
根据连接酶 腺嘌呤核苷酸形成所需要的底物,
把 DNA连接酶分为两类:依赖 NAD +的连接酶 ( L i
gA )和依赖 ATP的连接酶。依赖 NAD+的连接酶存
在于所有细菌种属中, 是细菌生长所必需的, 参与
DNA复制中冈崎片段的连接。包括一个核心连接
酶结构域和一些与 DNA结合等有关的辅助区域 [ 5]。
在多个细菌种属中已发现 ATP依赖型连接酶,
依次命名为 L igB, L igC, L igD [ 5- 7] (图 2)。 LigB首先
在结核分枝杆菌中发现, 这是一种高效的缺刻连接
酶,包含一个核心连接酶结构域和一个 DNA结合结
构域 ( DBD )。L igC连接酶存在于分枝杆菌和根瘤
农杆菌中,仅具有核心连接酶活性,没有辅助区。离
体试验表明, L igC在体外有较弱的缺刻封闭能力。
在分枝杆菌中, 当 ligD基因缺失时, L igC在 NHEJ
修复途径中发挥了一定的作用。 L igD是一个分子
量较大的多功能酶,包括一个依赖 ATP的连接酶结
构域 ( L IG ), 一个聚合酶结构域 ( POL)和一个磷酸
酯酶结构域 ( PE) [ 16, 17, 23 - 25]。在不同细菌体内, 这 3
个组成部分的排布顺序有所不同。
图 2 细菌多种 DNA连接酶 [ 1]
从简单的 NHEJ复合体,例如,铜绿假单胞菌仅
含有 1个 Ku蛋白, 1个 L igD,没有 LigC,逐渐发展到
更加复杂的组成, 如结核分枝杆菌含有 1个 Ku蛋
白, 1个 L igD和一个 LigC; 包皮垢分枝杆菌含有 1
个 Ku蛋白, 1个 L igD和 2个 L igC;根瘤农杆菌含有
1个 Ku蛋白, 2个 L igD和 3个 LigC ), 证明了细菌
NHEJ修复途径的复杂性。
2 细菌 NHEJ修复途径的检测
关于细菌 NHEJ途径存在的最直接证据来自线
性化质粒 DNA转染结核分枝杆菌 [ 5]和包皮垢分枝
杆菌 [ 7]的试验。质粒中插入一个分支杆菌复制原
点序列,一个选择抗性基因和一个能编码 半乳糖
酶的 lacZ基因。用限制性内切酶对 lacZ基因单酶
切可产生线性化平末端或者特定的 5!黏性末端。
2
2010年第 5期 殷亮等:原核生物的 NHEJ修复途径
为了使转染 DNA 后的分支杆菌产生抗性, 质粒
DNA的末端必须连接成环才能进行复制并发挥作
用。由于分支杆菌基因组没有与质粒断裂末端侧翼
同源的 DNA序列, 因此这种修复不受 RecA依赖型
的同源重组修复的影响, 这是检测出 NHEJ的关键
性步骤。
试验结果表明,接近 50%的具抗生素抗性的转
化子是白色的,暗示出 lacZ基因已经在修复过程中
突变失活 [ 17]。通过测定多个独立的白色转化子被
修复的结合部序列, 确定了 NHEJ途径的致突变效
应。该分析表明,修复平末端的主要方式是在两个
末端之间插入一个非模板指导的单核苷酸, 然后连
接, 因此将导致 + 1移码突变 (图 3)。人们已经揭
示出单一核苷酸插入的所有可能性, 尽管大多时候
是 A∀T和 T∀A [ 7]。在 5!黏性末端的 DSB修复过程
中, 在连接之前首先填补未配对的碱基序列,然后再
延伸一个非模板指导的核苷酸。这些结果充分体现
了聚合酶在分支杆菌 NHEJ途径修复平末端或者黏
性末端中的作用。在野生型分支杆菌中,也观察到
NHEJ途径会在一个或两个 DNA断裂末端带来碱
基缺失,这暗示出在连接前外切核酸酶活性发挥了
修剪作用。
图 3 在平末端或 5!粘末端, DSBs的 NHEJ修复 [ 1]
3 细菌 NHEJ修复途径的分子机制
对分支杆菌来说, Ku蛋白和连接酶 L igD是
NHEJ修复的主要成分。Ku或 L igD缺失,可分别使
质粒 DNA平末端或黏末端的 NHEJ修复效率下降
几百倍和 100倍 [ 7]。细菌的 NHEJ修复模式是: 先
由 Ku结合在断裂的 DNA末端并招募 L igD结合,后
者直接催化断裂 DNA的封闭。L igD POL结构域是
L igD与 Ku直接接触的位点 [ 8]。在体外试验中, Ku
可激活 L igD, 提高其对断裂 DNA进行封口的能力。
目前尚不清楚 Ku只是连接酶 L igD的招募因
子,还是对 L igD具有别构效应,对于 NHEJ修复的
其它细节尚不清楚。例如, 在修复前后, 结合在
DNA双链断裂末端的蛋白质因子的数量;末端如何
接近并修复; 蛋白质 DNA如何在断裂双链间 #架
桥 ∃;影响 NHEJ忠实性的因素; 调控缺失型或插入
型修复的因子等。目前关于 NHEJ修复的机理大多
来源于对 L igD的生化特性和结构特点的研究, 概述
如下。
3. 1 L igD LIG的的结构与功能
L igD虽然由单一的多肽链组成, 但却有着多重
催化活性。L igD蛋白由 3个独立的结构域组成, 即
L IG、POL和 PE。L igD L IG具有连接 DNA末端、封
闭缺口的功能。对结核分枝杆菌 L igD的 LIG结构
域的 2. 3 晶体研究表明, 它具有典型的 ATP依赖
型连接酶折叠特征,能使 LIG处于连接酶腺苷酸过
渡态, AMP通过 PN键与 481位的赖氨酸共价连
接。当用丙氨酸取代 481位的赖氨酸后, 则 L igD
AMP中间体就不能形成, 从而使得胞内 L igD失去
封口功能 [ 8, 9]。若 L igD缺失, NHE J功能几乎完全
丧失。当 L igD不能填补缺口时, 至少有一种其它的
DNA连接酶 ( L igA, L igB, L igC )起到重要的补充
作用。
3. 2 L igD POL的结构和功能
L igD的 POL可催化 DSBs平末端的非模板依赖
3
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
性单核苷酸的添加, 也可以催化双链 DNA 5!黏末
端的模板依赖性核苷酸的填补 [ 6, 7 ]。
铜绿假单胞菌 LigD的晶体结构分析表明, POL
是一个球状蛋白,由 11个 链形成两个折叠片,外
围有 7个 螺旋。这种折叠形式类似于古菌 DNA
引物酶的催化中心 [ 10] ,但不同于 Po lX聚合酶家族,
而后者被认为是真核 NHEJ修复的组分 [ 11]。通过
丙氨酸扫描法确定了铜绿假单胞菌 L igD POL的活
性必不可少的 5个氨基酸残基,即 A sp669, A sp671,
H is710, A sp759和 A rg776,它们都是 Mn2+ NTP结合
位点的组分 [ 12]。该位点包含 3个部分,可分别与两
个 Mn2+、核苷酸的三磷酸部分及核苷部分相作用。
这种结构回答了为什么 Mn1能够稳定解离产物 PPi
的构象,而 Mn2可活化 3!OH 引物末端以便对底物
核苷酸的 磷发生亲核攻击。双金属作用机制在
DNA聚合酶中高度保守。而水分子介导的 POL同
核糖 O2!或 O3!碳原子的直接作用, 可能解释了
L igD POL对 rNMP有更强亲和力的原因。
L igD的 POL可以 dNTP为原料, 以 5!端带有
18个核苷酸尾巴的 DNA作为引物模板, 在引物后
填补 DNA直至模板链的末端,并可继续添加一个非
模板依赖性核苷酸。L igD的 POL还能以 DNA为模
板,将核糖核苷酸加到 DNA引物,但是这种延伸最
多可引入 4个核糖核苷酸 ( rNM Ps)。因为随着核糖
核苷酸的增加, 引物 模板的活性在逐渐降低 [ 13 ]。
这些特性意味着封口前的核苷酸填补可能包括
rNMPs的引入。L igD以 rNTPs作为底物可能更有利
于静止期 DSB的修复, 因为在静止期复制不活跃的
情况下, dNTP库可能不够丰富。
脱碱基是常见的 DNA 损伤形式之一。 L igD
POL能在脱碱基位点对面添加一个核苷酸, 但核糖
核苷酸的加入速度要高于脱氧核糖核酸。当处在脱
碱基位点对面时, POL在引物末端的延伸活性较弱,
但是它可以将引物滑动 2个或 3个核苷酸, 从而绕
过 3!端损伤位点, 并在脱碱基位点的 5!端重新排列
到模板序列上。滑动和重新排列这两个过程可能使
DSB间架桥,因此可完成体内的断裂修复 [ 14]。
为进一步阐明活体内 LigD聚合酶在 NHEJ修复
中的作用,对包皮垢分枝杆菌 L igD基因进行了一个
等位基因置换,产生一个无聚合酶活性而具有连接酶
活性的 D136AD138A蛋白,该蛋白缺少 POL活性所
必需的 Mn2+结合位点。这种突变增加了体内双链断
裂 DNA平末端修复时的忠实性,减少了非忠实性修
复中非模板依赖性核苷酸的插入。因此, L igD POL
是体内致突变 NHEJ途径的催化剂 [ 12]。
3. 3 PE的新特性
铜绿假单胞菌 L igD PE区含有 187个氨基酸,
具有 3!核酸酶活性和 3!磷酸酶活性,需要 Mn2+作
为辅因子。当剧烈损伤,例如,核酸切割、电离辐射,
以及在碱基切除修复过程中都会产生带有 3!PO4
的 DNA断裂, 这些 3!末端既不能被聚合酶延伸也
不能被连接酶封口,此时 3!磷酸酯酶功能便可行使
修复活性。推测切除过程需要两步。首先, 3!末端
的核苷酸被核酸酶逐一切除,直至产生一个具有 3!
磷酸核苷的末端。接着,该 3!PO4被磷酸酶水解生
成 3!OH [ 15 ]。当 3!OH末端存在单个核苷酸时, 细
菌 LigD (或 L igC )的链连接功能被激活, 完成修复。
这一特征揭示了 POL, PE和 L IG活性协同作用的
机制。
PE磷酸酶和核酸酶的活性均依赖于引物 模板
5!单链的存在和长度。这些特征使 LigD PE与其它
已知的 3!末端处理酶不同, 被认为属于一个新的
3!末端修复酶家族 [ 15]。
4 细菌 NHEJ修复途径的生理功能
NHEJ途径并不是存在于所有细菌种属中, 例
如, 大肠杆菌就没有 NHEJ途径, 说明 NHEJ途径对
于细菌存活并不是必需的。但为什么一些细菌体内
保留了 NHEJ途径呢? 研究表明, NHE J途径对于静
止期细菌的 DSBs修复是至关重要的。在真核生物
中, HR和 NHEJ途径受到细胞周期的调控。在 S期
和 G2期, HR途径占优势,而在 G1期 NHEJ途径占
优势。由于在自然生境下, 许多细菌种群的长期处
于静止期,因此,细菌的 NHEJ途径也可能受到细胞
周期的调控。
4. 1 NHEJ途径与细菌胁迫响应
Ku和 LigD能保护静止期 B. sub tilis芽孢抵御
环境胁迫所造成的 DNA损伤。当 ykoV ( Ku)和 yk
oU ( L igD)基因缺失时, 芽孢对能造成 DNA损伤的
条件,比如干热,高真空,长波紫外辐射和 X射线等
相当敏感 [ 16, 17 ]。微阵列分析表明,在孢子形成过程
4
2010年第 5期 殷亮等:原核生物的 NHEJ修复途径
中, ykoV ( Ku )和 ykoU ( L igD )基因表达受到正调
控 [ 16]。根据 KuGFP融合蛋白的跟踪定位分析,发
现孢子萌发 30 h后 Ku在类核区大量集中, 这与其
保证孢子基因组完整性的角色相呼应 [ 16]。由于芽
孢只含一个基因组拷贝,因此, 通过 NHEJ途径来修
复染色体断裂无疑具有重要意义。
抗辐射动球菌 (K ineococcus rad iotolerans)可以抵
抗高剂量的电离辐射 ( > 3 000 Gy)和长期干旱 [ 18]。
已在抗辐射动球菌中分离出一个 Ku基因 ( Krad
DRAFT_1225) ,暗示出 NHEJ途径在抵抗电离辐射
和干旱中的作用。但需要指出的是, 其它一些抗辐
射细菌, 如耐辐射奇球菌 (D einococcus rad iodurans)
缺乏 Ku蛋白, 因此可能具有不同的 DSB s修复
途径。
4. 2 NHEJ途径与细菌病原性
人类肺结核 ( TB )感染一般首先经历一段急性
的分枝杆菌复制活跃期, 接着是长期的静止过程。
在这一过程中,分支杆菌不复制,潜伏在多细胞炎症
组织里面。而巨噬细胞和免疫细胞可产生氧化氮和
过氧化氢等抗菌性的基因毒物, 可导致 DNA断裂。
由于潜伏期细菌 DNA复制停止, 没有子染色体可作
为 HR的模板,因此分支杆菌 NHEJ途径将是 DSBs
修复的惟一方式。已有研究表明, 寄主基因毒物可
使 DNA修复失去忠实性,从而导致临床上结核分枝
杆菌对抗生素产生抗性。那么在人类肺结核分枝杆
菌感染中, NHE J途径到底扮演怎样的角色, 这需要
更多的研究来揭开结核分枝杆菌病原性与 DNA修
复关系的神秘面纱。
4. 3 寄主 NHEJ与病毒基因组环化
有研究表明, 真核 NHEJ蛋白 Ku和 L ig4参与
真核病毒 DNA的转染过程。在逆转录病毒复制期
间, NHEJ蛋白能催化未整合的逆转录病毒互补
DNA的环化。NHEJ蛋白也在逆转录病毒整合到宿
主染色体过程的末期发挥作用, 可将宿主染色体
DNA整合位点出现的缺口修复 [ 19]。
在单疱疹病毒 (HSV )感染过程中, RNA干扰介
导的 L ig4剔除可使病毒的生成量减少 100倍 [ 20 ]。
人们推测 NHEJ途径导致 HSV基因环化, 因此生成
了可滚环复制的环状 DNA模板。
在包皮垢分枝杆菌中, 噬菌体 Omega和 Corn
dog的侵染依赖于寄主细胞 LigD的连接酶活性, 而
不是其聚合酶活性。显然, L igD需要对分枝杆菌噬
菌体基因组进行环化,使线性噬菌体 DNA具有 4碱
基互补序列的 3!单链末端封闭。该噬菌体末端的
封口应该是零错误的, 以使复制后的子代噬菌体
DNA能够定点切割,产生一个个具有基因组单位长
度的线性分子 [ 21]。
4. 4 NHEJ与细菌静止期突变
静止期突变 (或适应突变 )是研究微生物在静
止期或缓慢分裂期发生的可解除选择压力的突变,
对于人们了解自然界变异来源、进化过程及其机制
具有极为重要的意义。以酵母 lys2移码突变株为
实验系统, 发现 Ku70和 DNA Lig%参与了胁迫条
件下静止期突变的发生 [ 22 ]。在人类肿瘤细胞的发
生过程中, 缺氧导致 P130去磷酸化, 最终抑制 HR
途径,而不影响 NHEJ的活性, 暗示出肿瘤细胞基因
组的不稳定性与 NHEJ致突变效应有关 [ 23]。处于
环境胁迫条件 (如干旱、电离辐射等 )下细菌可能遭
受 DSBs损伤,因此研究 NHEJ途径在细菌 DNA修
复和静止期突变发生中的作用具有重要意义。
5 问题和展望
细菌的 NHEJ修复方式是一个新兴的领域, 在
过去的 5年中取得了长足的发展。对体内 Ku和
L igD功能的遗传分析方法的建立,已经令人们对细
菌 NHEJ途径的大致轮廓及独特性质有了一定了
解。目前对 NHEJ途径的结构和组分解析, 主要依
赖于将模拟的 DSB底物或反应中间物与 Ku, L igD
和 LigC相结合, 并对由此形成的晶体结构进行破
解。NHEJ修复途径可能尚需其它组分和调节物,
可通过双杂交筛选法和以 Ku和 L igD为配体的亲和
纯化等方法来鉴定。对于 DNA损伤产生后, NHE J
组成因子的表达及它们在细胞内的定位,也有待进
一步探索。
除分枝杆菌或芽孢杆菌之外,目前人们尚不知
NHEJ途径在其它细菌菌属中的作用。铜绿假单胞
菌是一种主要的人类病原体, 且是 L igD生化研究的
模式菌株。如果把铜绿假单胞菌的 NHEJ去掉将对
其毒力有何影响, NHE J修复与细菌在生物膜上的
存活是否有关,以及在根瘤农杆菌转染植物过程中,
NHEJ途径与细菌 DNA整合到寄主基因组是否有
5
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
关,对于上述问题的解释, 将对细菌生理学和病理学
的研究指明新的方向, 并有助于应用 NHEJ修复来
进行抗菌治疗。
参 考 文 献
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