全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
与真核生物 DSBs修复有关的 NHEJ途径研究进展
虞海燕 1, 2 　梁锋 1, 2 　杨志伟 1
(1首都师范大学 ,北京 100048; 2中国科学院微生物研究所 ,北京 100101)
　　摘 　要 : 　DNA双链断裂是真核生物最严重的 DNA损伤形式。如果断裂的 DNA双链无法及时修复 ,将可能导致细胞死
亡。非同源末端连接途径在真核生物 DSB s修复中起重要作用。综述了真核生物 NHEJ途径中核心蛋白质 Ku、DNA2PKcs、
DNA连接酶 IV、XRCC4、ARTEM IS和 X IF等因子的结构和功能 ,并简要介绍了 NHEJ修复途径的分子机制 ,其中涉及到 DSB s
位点蛋白复合体组装的两种模型。
关键词 : 　DNA双链断裂 (DSB s) 非同源重组连接 Ku蛋白
Recent Progress of NHEJ Pathway of
DSBs Repa ir in Eukaryotic Cells
Yu Haiyan1, 2 L iang Feng1, 2 Yang Zhiwei1
(1 Capital N orm al University, B eijing 100048; 2 Institu te of M icrobiology, Chinese Academ y of Sciences, B eijing 100101)
　　Abs trac t: 　DNA double strand breaks are the most harmful form of DNA damage in eukaryotic Cells. If not repaired in time, the
breakages can result in cell death. Non2homologous end joining pathway p lays an important role in eukaryotic DSB s repair. In this re2
view, an overview of the structure and functions of NHEJ core factors, encompassing Ku,DNA2PKcs, DNA ligase IV, XRCC4, ARTEM IS
and X IF was p rovided. A lso, a brief introduction to the molecular mechanism of NHEJ, involving two models regarding p rotein comp lex
assembly at DSB s was given.
Key wo rds: 　DNA double strand breaks(DSB s) Non2homologous end joining Ku p rotein
收稿日期 : 2009205225
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30670035) ,北京市教委科技发展面上项目 ( KM200510028011)
作者简介 :虞海燕 (19832) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向 :分子真菌学 ; E2mail: hyyu hyyu@yahoo. com. cn
通讯作者 :杨志伟 (19672) ,女 ,副教授 ,硕士生导师 ; Tel: 010268902327, E2mail: yangzw@mail1cnu1edu1cn　　DNA双链断裂 (DNA double2strand breaks, DSB s)是双螺旋 DNA分子的两条链在相对位置或相邻数个碱基处同时发生断裂的现象 ,是发生在真核生物基因组水平上最严重的 DNA损伤形式之一。在真核生物中 ,很多外源和内源的因素都会导致 DSB s,如电离辐射、诱变剂以及生物体在新陈代谢中产生的具有氧化性质的副产物如氧自由基等。DSB s也可在细胞分裂和增殖期间通过内源性的细胞事件 ,如 V (D) J重组或 DNA复制错误产生。即使在没有外界有害因素的情况下 ,一个哺乳动物细胞平均每天也会发生 10次左右自发的 DSB s[ 1 ]。如果这些断裂的 DNA双链无法及时修复 ,就可能导致细胞的死亡 ,若是错误修复 ,将导致基因突变或基因组不稳定。 因此 ,正确的 DSB s修复对维持生物体的基因组完整性和细胞稳定性起着重要的作用。真核细胞修复 DSB s主要有两条途径 :同源重组 ( Homolo2gous Recombination, HR )途径和非同源末端连接(Non2homologous end joining, NHEJ)途径。为有效地完成 DSB s修复 ,不同细胞类型有不同的修复机制。1　真核细胞 D SBs修复方式的选择一般认为 ,在低等真核细胞如酵母中 DSB s的修复主要依靠 HR, HR需要以姐妹染色单体的同源序列作为修复的模版 ,因此修复过程一般限制在 S后期到 G2期。而在多细胞的真核生物中 , NHEJ途径更为普遍。多细胞真核生物具有大量的重复DNA片段 ,例如 ,在人类的基因组中有 40%的重复
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DNA ,如果 DSB s修复以 HR的方式进行 ,那么同源
片段的联会过程将会非常混乱。而 NHEJ修复不需
要同源 DNA序列 ,只需要蛋白质 2DNA复合体把断
裂的两个 DNA末端连接起来 ,因而 NHEJ可以发生
在细胞的整个周期中。另外 ,还有一种因素可能决
定着两种修复机制的选择 ,即分别参与 NHEJ和 HR
的两种蛋白———Ku70 /Ku80和 Rad52,这两种蛋白在
DNA末端的竞争结合力 [ 2 ]。Ku70 /Ku80能结合到所
有 DNA末端 , Rad52则更易于结合到有长单链的
DNA末端。这可能是在多细胞真核生物中 HR和
NHEJ的比例受到了严格限制的主要原因 ,在哺乳动
物中 ,NHEJ的发生频率是 HR的 100至 1 000倍 [ 3, 4 ]。
2　参与 NHEJ修复的蛋白质因子
NHEJ是多种蛋白复合物相互协调、共同作用
的一个结果 ,途径在从细菌到人类进化中都是非常
保守的。主要包括以下几种蛋白质因子。
2. 1　DNA依赖的蛋白激酶
DNA 依赖的蛋白激酶 (DNA2dependent p rotein
kinase,DNA2PKs)是一种核内丝氨酸 /苏氨酸蛋白激
酶 ,属于磷脂酰肌醇 23蛋白激酶家族 ( P IKK) ,是参与
NHEJ修复的最重要的蛋白质因子。它具有 3个亚
基 ,分别为一个催化亚基 DNA2PKcs (DNA2dependent
p rotein kinase catalytic subunit)和两个 DNA 结合亚
基 ,即 Ku70 /Ku80异二聚体 [ 5 ]。
2. 1. 1　Ku70 /Ku80 Ku70 /Ku80异二聚体组成 Ku
蛋白 ,从酵母到哺乳动物高度保守。在人细胞内 ,
Ku是除组蛋白之外含量最丰富的核蛋白。研究表
明 , Ku蛋白能非特异地结合于 DNA断裂处 ,但是并
不直接与 DNA的碱基或核糖 2磷酸骨架结合 ,而是
与 DNA 双螺旋大沟小沟的空间结构发生作用 ,将
DNA严格地限制在 Ku二聚体形成的 Ku环中 ,这就
是 Ku 蛋白的结合不受 DNA 序列限制的原因
所在 [ 6 ]。
DSB s发生时 ,两个断裂的 DNA末端分别结合
一个 Ku70 /Ku80异二聚体 ,两个二聚体进一步结
合 ,在断裂处行成一个“桥 ”状结构 ( Ku环 ) ,招募
DNA2PKcs分子与 DNA结合。另外 , Ku环的内侧排
列着带正电荷的氨基酸 ,能够与带负电的 DNA链作
用 ,将 DNA双螺旋固定在一个特定的位置 ,有利于
DNA断裂端的靠近和再连接 [ 6 ]。Ku与 DSB s的结
合并不需要其它蛋白质因子 ,在 NHEJ中它最早感
应并结合到 DNA双链断裂末端 ,并为后续蛋白的结
合与组装提供支架 [ 7 ]。
2. 1. 2　DNA2PKcs DNA2PKcs具有丝氨酸 /苏氨酸
蛋白激酶催化活性 ,仅在脊椎动物体内发现。哺乳
动物 DNA2PKcs分子量约为 460 kD。DNA 2PKcs的
三维结构研究表明 ,该蛋白包括 2个开放的通道
(沟 )及 1个空腔 ,空腔在分子的两面具有 3个开
口。其中 ,开放的通道可与双链 DNA 结合 ,而空
腔只能容纳单链 DNA。因此 , DNA 2PKcs具有两个
不同的单链 DNA和双链 DNA结合位点 ,它们之间
可以相互作用。当 DNA 2PKcs与单链 DNA 结合
后 ,可通过构象变化 ,促进其与双链 DNA的结合 [8 ]。
在 DSB s处 , DNA2PKcs和 Ku蛋白通过 Ku80的
羧基端相互作用 ,形成全酶。Ku蛋白可加强 DNA2
PKcs和 DNA末端的结合 ,并进一步激活全酶的活
性。DNA2PKcs可发生自身磷酸化 ,并可磷酸化其它
NHEJ蛋白质因子 ,如 ARTEM IS等。DNA2PKcs的自
身磷酸化对于 NHEJ途径十分重要。在没有磷酸化
之前 , DNA2PKcs大分子可以阻挡核酸末端加工酶
和连接酶与双链 DNA末端的结合 ,以保护 DNA末
端免受错误降解和连接 ,直到双链 DNA断裂末端被
正确排列。之后 , DNA2PKcs通过自身磷酸化 ,构象
发生改变 ,使得末端加工酶和连接酶可以接近双链
DNA断裂末端 ,完成 NHEJ修复 [ 9 ]。
2. 2　DNA连接酶 Ⅳ /XRCC4复合体
XRCC4是核内磷脂蛋白 ,人类的 XRCC4含有
334个氨基酸 , N端的球状头部区域基具有 7条肽
链形成的 β2折叠片和螺旋 2转角 2螺旋 ( HTH )结构
域 ,可能与 DNA 的结合有关。头部后面连有一个
α2螺旋茎部 ,它们组成 XRCC4四聚体中的 α2螺旋
束 ,并与连接酶 Ⅳ相互作用 [ 10 ]。
DNA 连接酶 Ⅳ包含 911个氨基酸 ,催化区域位
于 N端 ,这与其它连接酶相类似。不同的是 ,其 C
端包括两个串联重复区域 (BRCT基序 ) ,该基序约
有 95个氨基酸 ,通常存在于 DNA修复和信号传递
相关蛋白中。但是 , DNA连接酶 Ⅳ与 XRCC4的结
合并不由 BRCT基序所介导 ,而是与两个 BRCT基
序之间的氨基酸序列有关 [ 11 ]。
XRCC4与 DNA连接酶 Ⅳ以 2∶1的比例形成复
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合体 , XRCC4可使 DNA 连接酶靶向结合在 DSB s
处 ,并可调节连接酶的稳定性和活性 [ 11 ]。
2. 3　ARTEM IS
ARTEM IS蛋白发现较晚 ,属于金属 2β2内酰胺酶
超家族 ,其功能缺失后细胞对电离辐射的敏感性增
加。该蛋白具有 5′→3′核酸外切酶的活性 ,但是必须
与 DNA2PKc结合并被磷酸化才能获得核酸内切酶活
性。ARTEM IS可切除 5′突出端、3′突出端和发夹结
构 ,主要功能是处理加工 DSB s的双链末端 [ 12 ]。
2. 4　X IF /Cernunnos
2006年 ,两个研究小组在一个具有免疫缺陷的
患者细胞中同时发现了 XLF (XRCC42like factor,也
叫 Cernunnos) [ 13, 14 ]。XLF基因突变可使 NHEJ途径
产生缺陷 ,引起基因组不稳定 ,患者表现出对电离辐
射敏感、V (D ) J重组缺陷和缺乏成熟的 T淋巴细胞
和 B淋巴细胞 [ 15 ]。XLF分子量为 33 kD,与 XRCC4
相比 ,在 DNA序列上具有同源性 ,在空间结构上相
似 ,也由一个 N端头部球形结构域和 C端卷曲螺旋
结构域组成。XLF可与 XRCC4 /DNA连接酶 Ⅳ复合
体相互作用 ,促进 DSB s的连接。最近的研究表明 ,
在 XLF存在时 ,平末端 DNA的一条链可与粘末端
突出的一条链连接在一起 ,而留下另一条链不被连
接 ,然后由 DNA聚合酶填补缺口 ,完成修复 [ 15 ]。因
此 , XLF /Cernunnos可避免单链突出末端被切除 ,有
利于保持原有 DNA序列 ,防止 NHEJ修复中核苷酸
序列的丢失。
2. 5 其它蛋白质因子
除以上主要因子外 , DNA 聚合酶 μ与 λ、PNK
(多核苷酸激酶 ) [ 16 ]、WRN (W erner’s Syndrome he2
licase) [ 17 ]等在 NHEJ中也起到非常重要的作用。例
如 , DNA聚合酶μ与λ参与缺口的填补 , PNK可在
DNA 5′端添加磷酸基团 ,以利于连接反应。NHEJ
中的必需成分 Ku和 DNA蛋白激酶可与 WRN相互
作用 ,使 WRN发生磷酸化 ,促进 WRN 3′→ 5′的核
酸外切酶活性。
3　NHEJ修复的分子模型
3. 1　典型的 NHEJ修复途径
典型的 NHEJ修复途径大体上可以分为以下步
骤 : (1) Ku蛋白识别并结合到 DNA的断裂末端 ,形
成 DNA2Ku70 /Ku80复合物。Ku蛋白的 Ku环结构
使其能够结合任何类型的 DNA末端 ; ( 2 ) Ku招募
DNA2PKcs聚集到断裂点 ,并与 Ku蛋白稳定结合形
成 DNA2PK复合物 ,这一复合物使 DNA两个断裂末
端相互靠近并且正确排列 ; (3) DNA2PKcs激酶活性
被活化 ,使 DNA2PKcs自身磷酸化并发生构象改变 ,
从而可使其它 NHEJ蛋白与 DSB s结合 ; ( 4 ) DNA2
PKc磷酸化 ARTEM IS,激活 ARTEM IS∶DNA2PKcs
复合体的核酸内切酶活性 , ARTEM IS对 DNA断裂
末端进行加工 ,一旦加工完成 ,核酸酶 ARTEM IS:
DNA2PKcs复合体便从 DNA2Ku70 /Ku80复合体上
分离 ; (5)由 DNA聚合酶μ或 DNA聚合酶λ来填
补缺口 ,最终由 DNA连接酶 Ⅳ /XRCC4复合体完成
连接。由于 DNA断裂末端结构的多样性 ,加工和连
接过程通常不是截然分开的 ,而是协同发挥作用
的 [ 18 ] (图 1)。
图 1 哺乳动物 NHEJ途径 [ 18]
近年来 ,随着实时图像和激光微束定点照射技
术的发展 ,可以对激光微束导致的 DSB s修复过程
进行动态检测。Yano等 [ 19, 20 ]提出了一种新的瞬时
动态 NHEJ蛋白装配模型。该模型主要包括两个过
程 :招募核心因子和蛋白复合体的组装。第一步 ,
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KU70 /KU80异二聚体最早感应并结合到断裂的线
性 DNA末端 ,之后 DNA2PKcs, XRCC4 /L igIV和 XLF
同时但独立地被招募到 DSB s处 ,这是新模型与前
面所述 NHEJ修复途径最大的不同之处 ;第二步 ,在
DSB s处 ,被招募在一起的蛋白质因子相互作用形成
具有功能的复合体 (图 2)。
图 2　D SBc位点 NHEJ蛋白组装的新模型 [ 19]
3. 2 非典型的 NHEJ途径
近几年来的研究发现 ,在真核生物中可能存在
着另一条由多聚 (ADP2核糖 )聚合酶 21 (poly (ADP2
ribose) polymerase21, PARP21)介导的 NHEJ修复途
径 ,当 NHEJ传统途径中的必需组分尤其是 Ku蛋白
缺乏时 ,由 PARP21和 XRCC1 / DNA连接酶 Ⅲ共同
参与的替代途径将在 DSB s修复中发挥作用 [ 21 ]。
PARP21普遍存在于高等真核细胞中 ,参与 DNA单
链和双链断裂修复 ,对基因组稳定性起重要作用。
抑制 PARP21能增加 DNA2PK野生型和缺失株对
DSB s损伤药物的敏感性 [22 ]。最新的研究证实 , PARP2
1能与 Ku蛋白竞争结合 DSB s的末端 [23 ]。当经典
NHEJ修复途径受到阻碍时 , PARP21的功能对 DSB s
的修复就有着重要的意义。
4　展望
生物体 DSB s修复是当前生命科学研究领域的
热点。近年来 ,对于 NHEJ分子机理的阐明已经取
得了一些突破性进展。新的 DNA损伤修复因子不
断被发现 ,丰富了人们对于 DNA修复机制及功能的
认识。此外 ,对真核生物 NHEJ修复途径的研究已
经应用到肿瘤治疗领域 ,对于 DSB s修复缺陷引起
免疫缺陷症机理的研究 ,也将为相关疾病的临床治
疗提供有益的思路。在基因功能研究方面 ,常用的基
因敲除手段主要基于同源重组的原理来设计 ,但由于
真核生物同源重组频率较低 ,限制了这一技术的成功
率。近年来 ,在丝状真菌中证实了阻断 NHEJ途径的
ku70 / ku80基因可以不同程度地提高同源重组频
率 [ 24, 25 ] ,因此采用阻断基因文库来转化 ku70 / ku80基
因双缺菌株 ,可使高通量的基因敲除成为可能 ,并为
基因功能的研究创造便利的条件。
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