全 文 ：健物杖术通报
· 技术与方法 · 丑了口百 付 口工口 年增刊
技术研究进展与展望
沈元月
北京农学院植物科学技术系 , 北京
摘 要 近年来 , 技术 , 即 末端快速扩增技术 , 是一种快速扩
增 。 的 ’和 ’末端 的有效方法 ,在扩增全长 。 方 面得到了广泛的应用 。 综述了 技术的研究进展 , 总
结 了优化 技术几个关健环节。 最后展望 了 技术的发展。
关键词 ! 全长 克隆 进展
刀印 材 耐 二 。爵归 , 访咭 卯 , 鳍
‘一 ’一
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, 罗 盯 ,
一
近年来随着生物技术的发展 , 出现了许多克隆
新基因的方法和手段 , 如图谱克隆技术 、转座子标签
技术 、 差异显示技术 、基因组减法技术以及
文库筛选技术等。 但上述方法大多具有实验
周期长 、技术步骤烦琐且工作量大等特点 。
末端 快速扩增技术
, , 是一种基于 从低丰度的转录本
中快速扩增 的 ’和 ’末端的有效方法 , 以其
简单 、快速 、廉价等优势而受到越来越多的重视 , 在
扩增全长 方面得到了广泛的应用 。 本文综述
了这方面的最新研究进展 。
技术的发展
经典的 技术是由 ! ∀ # ∃ % & ∋ ∋ (
发明的一项技术 , 主要通过 R T 一P C R 技术由已知的
部分 CDN A 序列来得到完整 的 cD N A 的 5 ’和 3 ‘
端[‘, J 。 包括单边 PeR [’6 ] 和锚定 Pe R [”」。 该技术
提出以来经过不断发展 和完善 , 克服了早期技术步
骤多 、时间长 、特异性差的缺点工’8 , ” , ’0,9 } 。 对传统
RA CE 技术的改进主要是引物的设计及 R T 一P C R 技
术的改进 :改进之一是利用锁定引物(loc k doc ki ng
prim er)合成第一链 eDN A , 即在 01190(dT )引物的 3 ’
端引人两个简并的核昔酸 [5 ’一0 1 1 9 0 ( d T ) 1 6 。。 M N 一3 ‘ ,
M
二 刀G/ C; N = 刀G/ C/T〕, 使引物定位在 pol y
(A )尾的起始点 ,
从而消除了在合成第一条 cD NA 链 时 。h go
( d T )与 po ly (A )尾的任何部位的结合所带来的影
响;改进之二是在 5 ’端加尾时 , 采用 po ly (C ) , 而不
是 po ly (A ) ;改进之三是采用 RN as e H 一莫洛尼氏鼠
白血病毒(M M LV )反转录酶或选择嗜热 DN A 聚合
酶可能在高温下 (60 ℃ 一 7 0 ℃ )有效地逆转录 m R -
NA ,从而消除了 5 ’端由于高 G C 含量导致的 m R N A
二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动
PC R (hot start PCR )技术和降落 PCR (toueh down
PC R )提高 PC R 反应的特异性 。
基金项目:北京市自然基金项 目(6082005 ) ;北京市属市管高校人才强教计划资助项 目(PX M 20 70 14207 ) ;北京农学院引进人才项 目
(99 7116038 )和重点项目(20260 16(X) 5 )
作者简介:沈元月 , 男 , 江苏 , 徐州 ,教授 , 研究方向为果树发菌分子生物学
生物技术通报 B io te ch no to gy B ule 血 2008年增刊
随着 RA C E 技术 日益完善 , 目前已有商业化 PCR 循环 , 把目的基因 3 ’末端的 cD N A 片段扩增出
RA e E 技术产品推出 , 如 eLoN TEe H 的 M ara th on侧 来。
技术和 sM A RTT“ R A C E 技术术。 邢桂春等(20 1) SM A RT M S’一R A c E 的原理是先是利用 m R NA
先后使用上述两种试剂盒进行 RA CE 反应 , 结果发 的 3 ‘末端的 Po ly(A )尾巴作为一个引物结合位点 ,
现使用 M ara thon T“所得到的片断总是比采用 sM A R 一 以 01 190 (dT )3。M N 作为锁定引物在反转录酶 M M Lv
TT“ R A C E 试剂盒到所得到的片断短 。 其原因在于 作用下 , 反转录合成第一链 cD N A 。 该反转录酶具
M ara th on T“技术反转录反应往往不能真正达到 m R 一 有的末端转移酶活性 , 会在反转录达到第一链的 5 ‘
N A 的 5 ‘末端 。 所以认为 , 进行 R AC E 反应应当优 末端时自动加上 3 一 5 个 (dC) 残基 , 退火后 (dC )残
选 sM A R T翔 R A c E 试剂盒困 。 以下就 国内目前应 基与含有 sM A RT 寡核昔酸序列 01 109 。 ( d G ) 通用接
用最广的 sM A RTT“ R A c E 试剂盒为例 , 简要概述 头引物配对后 , 转换为以 sM A R T 序列为模板继续
R A CE 技术的原理和操作过程 。 延伸而连上通用接头(图 1) 。 然后用一个含有部分
sM A R TTM 3‘一 R A e E 的原理是 :利用 m R N A 的 3 ‘ 接头序列的通用引物 U pM ( univer一s a l p ri m e r m i x )
末端的Po ly(A )尾巴作为一个引物结合位点 , 以连 作为上游引物 , 用一个基 因特异引物 G S咫 (gen e
上含有 SM A R T 寡核昔酸序列通用接头引物的 01 190 spec ific pri m er , G S P ) 作为下游引物 以 , 以 SM A R T
(dT )30 M N 作为锁定引物反转录合成标准第一链 cD N A 第一链为模板 , 进行 PCR 循环 ,把 目的基因 5 ’
cD N A
。 然后用一个基因特异引物 G SP I (ge ne sP e一 末端的 cD NA 片段扩增出来 。 . 最终 , 从 2 个有相互
ci fic prim er , G S
P) 作为上游引物 , 用一个含有部分接 重叠序列的 3 ’巧 ‘ 一 R A C E 产物中获得全长 cD NA ,
头序 列 的通 用 引物 U PM ( un ive rsa l prim er m ix , 或者通过分析 RA CE 产物的 3 ’和 5 ’端序列 , 合成相
U PM ) 作为下游引物 , 以 cD N A 第一链为模板 , 进行 应引物扩增出全长 cD N A (图2)
5, 一一一一二{坐全里竺兰一一一一一一一 P‘, 1、A : ,
< 片= 门0119。, ( d T ) p r i n l e r
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在逆转录酶作用下合成第一链
并末端自动加 (.l C)
5’—pf一ly AC C C5 ’一GGG一 亡二二二二二纽{ 退火后 (dC )与SM A RT ()119。, ( d C )配对后以 SM A R T 序列为模板继续延伸而连上通用接头3 ‘es C C C一5图 1 SM A RT eDN A 合成机制2 R A C E 技术的关键环节近年来 , 国内应用 R A CE 技术已成功地分离出许多基因t‘, , ’, , , 2 ,5. 8,’] , 显 示出在新基因的克隆中所具有巨大的应用潜力 。 但是我们在实验中发现 , 要做好 R A CE 反应实验并不容易 , 实际操作中仍存在不少困难 , 因此 , 对 R AC E 反应条件进行反复摸索是实验必须要做地 。 要实现从低丰度的转录文本中快速扩增 cD N A 的 3 ’和 5 ’末端 , R A C E 技术要把握好 几个关键环节【7)2 . 1 合成高质量的 cD N A 是 R A CE 技术成功的前提基础这首先要求制备 出高纯度 、 完整的 RN A , 而R N A 在提取过程中很容易发生降解 , 这一直是困扰实验者很头痛的问题 。 为了防止 R N A 降解 , 除了尽量创造一个无 RN A as e 环境条件外 , 还要选择一个快捷 、简单 R NA 提取方案 。 例如 Sv Tota一n N A 150 -
年增刊 沈元月:RA CE 技术研究进展与展望 13 3
Poly刀 总R N A
SM A R I第一链 。 D N A ( 、 D N A 合成
5 ’ 一R A C E 一 R e a d y 一 。D N A 3 ’ 一R A C E 一R o a 一ly 一r D N A
扩’ 一R A C E P C R 士’ 一R “二E P ‘;R
现 sm ear 的现象 。 可以通过利用特定生物密码子翻
译的偏好性 、选择简并度最低的氨基酸 (有时受氨
基酸数量的限制) 、在密码子多意摆动位置使用脱
氧次黄昔 、选用 5 一 7 个氨基酸 (巧 一 21 个碱基 )的
长度等方法来降低引物库的复杂性 。 设计引物技术
参数除了要考虑较高GC 含量(50 一 70 % ) , 较高 Tm
值(60 一 70 ℃ )外 , 3 ’末端还要尽可能使用引发效率
高的碱基 , 如3 ‘末端为C C 、 G G 、 C G 、 G C , 最重要是应
避免引物 3 ’末端简并 , 因为末端单碱基错配会阻碍
延伸。 我们依据 A BA 结合蛋白7 个氨基酸序列设
计的4 条简并引物皆扩增出一条37Obp 清晰的特异
条带 , 其中一条引物还扩增出一条640 bp清晰的特
异条带(图 3) 。
图2 SM A R T R A CE 全长 eDN A 克隆过程
lat io 。 S ys te m 提取方法 , 用石英玻璃纤维柱子特异吸
附 R NA , 因无需酚/氯仿抽提及乙醇沉淀等步骤 , 所
以 , 不但快速 、简便 , 而且纯度高 、完整性好 。 然而一
些快速 、简便 RN A 提取方案 , 往往无法保证 RN A 的
纯度 , 常存在蛋白质和多糖的污染 。 在这种情况下 ,
一个值得推荐的实验策落是 , 先确定一套很容易控
制R N A 完整性的快速 、大量制备方案 , 不追求纯度 ,
然后再对总 R N A 中的 m RN A 进行分离纯化 , 从而
提高 RN A 纯度 , 满足逆转录对 RN A 要求。 其次 , 采
用 sM AR T R A cE 完善的逆转录技术 , 使高质量的cD NA 的获得成为可能 。 在反转录进行到 m R N A 的
5/末端时 , 反转录酶 SuP er sc ri Pt l 所具有的“模板跳
跃 ”功能会将一个特定的 SM A RT n 寡核昔酸接头添
加到 m R N A 的 5 ’末端 , 逆转录酶跳移并继续转录至
该接头的末端 。 由于这种跳跃常发生在真核生物的
的帽子结构 , 因此只有包含全长 m R NA 及 SM A RT l
寡核昔酸接头的模板才能在 PCR 反应中扩增出来 ,
确保高质量的全长 cDN A 的获得 。
2
.
2 引物设计是 R A CE 技术是否能够成功的决定
因素
引物设计是 R AC E 技术是否能够成功的决定因
素 ,尤其是基于氨基酸设计的简并引物更是如此 。
简并引物是由多条引物组成的引物库 , 更容易出现
RA CE 技术常见的问题 :无扩增条带或扩增条带出
图3 兼并引物3 ’一R A C E 扩增结果
M 为m ar ke r;l 为 C K ;24 为根据氮基酸序列
设计的4 条兼并引物组合。
2
.
3 优化的 P C R 扩增条件是 RA CE 技术能够获得
特异全长 。D N A 的关键因素
采用 SM A RT R A C E 热起动 PCR 和降落 PCR 方
法 ,确保 PcR 反应的特异性 、高效率和忠实性 。 降
落 PC R 是一种潜在的一步法找到最佳扩增条件的
简单方法 ,一般反应开始时退火温度选择高于估计
的 Tm 值 , 随着循环的进行 , 退火温度逐渐降低到
Tm 值 , 并最终低于这个水平〔11」。 基于氨基酸设
计的简并引物的退火温度不确定性 , 则非常适用于
生物杖术通报 B to tec hn oto gy B “le 血 2008 年增刊
降落 PCR 。 在本实验中我们进行一些改进 , 先推测
出简并引物可能的最高和最低退火温度 , 在降落
PCR 中先以最高退火一复性温度下进行5 个循环 , 再
以最高和最低退火温度中间值为复性温度进行 5个
循环 , 最后以最低退火一复性温度下进行 25 个循环 ,
这个策落有利于确保特异扩增占绝对优势 , 并且非
常有效地抑制了非特异扩增 。 在降落 PCR 中必须
使用热启动技术[” , ’4 ] 。 热起动 PcR 方法常通过使
用石蜡珠或手工操作来控制 PCR 反应的关键成分
(D NA 聚合酶或镁离子) , 在等温度升到超过反应物
的 Tm 值以后才允许它们进入反应体系 , 这样做大
大抑制 非特异性 扩增 , 优 化 了 目标扩增产 物 。
S M A R T 队CE技术采用了新的自动热起动 PCR 方
法 , 即在 Advantage 2 polym era se 混合液中加人了其
单克隆抗体 , 在温度升高到抗体变性失活前 , 抗体阻
碍聚合酶的活性 ,使实验不但更容易操作 , 也获得了
非常好的扩增效果 。 我们相信 , 随着 RA C E 的不断
改进和完善 , 优化条件下 PC R 扩增效率和忠实性的
提高及 PCR 产物克隆技术的迅速发展 , R A C E 必将
在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作
用 。
参 考 文 献
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