全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
酵母表面展示技术在蛋白质工程中的应用
张伟 1, 2 　郭钦 1 　阮辉 1 　张洪波 1 　何国庆 1
(1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 ,杭州 310029; 2 温州医学院基础医学院 ,温州 325035)
　　摘 　要 : 　酵母细胞表面展示技术目前已成为蛋白质工程研究的重要工具 ,利用此技术可以鉴定蛋白间的相互作用、提
高蛋白的亲和力和特异性、增加蛋白的稳定性和表达水平、绘制功能性抗原位图、固定化表达具有生物活性的蛋白和酶等 ,此
项技术的运用代表着蛋白质工程研究中的最新进展。
关键词 : 　蛋白质工程 　酵母细胞表面展示 　酶固定化 　亲和力 　蛋白表位
Application of Yeast Cell2surface D isplay for Prote in Engineer ing
Zhang W ei1, 2 　Guo Q in1 　Ruan Hui1 　Zhang Hongbo1 　He Guoqing1
(1 School of B iosystem Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029;
2 School of B asic M edical Science, W enzhou M edical College, W enzhou 325035)
　　Abs trac t: 　The technology of yeast cell2surface disp lay has been an important tool for researching p rotein engineering1 It can be
used to identify p rotein2p rotein interaction, imp rove affinity and specificity of p roteins, increase stability and exp ression level, map
functional p rotein ep itopes and immobilize p roteins and enzymes1 The utilization of yeast cell2surface disp lay for p rotein engineering re2
p resents a significant recent advance1
Key wo rds: 　Protein engineering　Yeast cell2surface disp lay　Enzyme immobilization　Affinity　Protein ep itope
收稿日期 : 2009203212
基金项目 :国家高技术研究发展计划 (“863”项目 ) (2006AA10Z316)
作者简介 :张伟 (19762) ,男 ,讲师 ,从事微生物代谢工程及分子生物学研究
通讯作者 :何国庆 ,教授 ,博士生导师 ; E2mail: gqhe@zju1edu1cn
　　蛋白质工程是以蛋白质的结构及功能为基础 ,
通过分子设计、基因修饰和定点突变等技术对蛋白
质性质进行改造 ,获得符合人类需要的“突变型 ”蛋
白分子。目前 ,蛋白质工程主要涉及到蛋白质稳定
性、亲和力 ,蛋白酶催化特性 ,蛋白定向进化等多个
方面 [ 1 ]。虽然利用随机突变和定向进化的方法在
获取特征蛋白的研究上取得较大成功 ,但对于蛋白
质序列与功能间关系的理解以及通过合理设计使蛋
白质获得理想的优化性能仍然存在很多困难。
酵母细胞表面展示技术是近年来发展较快的一
种真核蛋白表达系统 ,其基本原理是将外源靶蛋白
基因 (外源蛋白 )与特定的载体基因序列融合后导
入酵母细胞 ,利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的
机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面 ,在医药、
食品、生物燃料等多个工业领域都有广泛的应用前
景 [ 2 ]。目前 ,最常见的酵母表面展示表达系统包
括 :凝集素展示表达和絮凝素展示表达 [ 3 ]。凝集素
展示表达系统是将外源基因与酵母编码α2凝集素 C
端编码序列 (含 GP I锚定信号序列 )连接后插入质
粒载体的信号肽下游 ,融合蛋白诱导表达后 ,信号肽
引导嵌合蛋白向细胞外分泌 ,由于融合蛋白 C2末端
存在含 GP I锚定信号的凝集素多肽序列 ,可将蛋白
锚定在酵母细胞壁中 ,从而将蛋白分子展示表达在
酵母细胞表面。絮凝素展示表达系统利用絮凝素基
因与外源蛋白融合 ,并将融合蛋白展露表达在细胞
表面 ,此系统又包括两个子系统 : GP I锚定系统和絮
凝结构域锚定系统。GP I锚定系统是利用絮凝素
Flo1p的 C2末端含有的 GP I信号锚定外源蛋白 ,此
系统与凝集素展示相似 ;絮凝结构域锚定系统是利
用 Flo1p的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合 ,
通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖
链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
状物。
酵母表面展示表达系统的一个显著特点是酵母
是真核细胞 ,它有一套可以处理蛋白分泌途径的
“生物合成装置 ”,能够对新生蛋白进行有效折叠和
糖基化。目前 ,已有多种蛋白被展示在酵母细胞表
面 ,这些蛋白包括生长因子、抗体片段、细胞表面受
体如表皮生长因子受体 ( EGFR )等。此外 ,酵母表
面展示还有一些其它优点 ,例如 ,可以通过荧光激活
细胞分类技术对表达文库进行快速和定量筛选 ;由
于宿主细胞表达偏爱性可以使用共表达标记使假阳
性最小化 ;可以对展示在细胞表面的单个克隆的突
变特性 ,如亲和力和稳定性等进行方便地评价而无
需对其进行水溶性表达和纯化等 [ 4 ]。鉴于上述优
点 ,近年来酵母表面展示系统此技术已成为定向进
化工程蛋白研究的功能平台 ,利用此技术对目标蛋
白 (包括酶 )进行改造以提高其亲和力、特异性、表
达水平、稳定性和催化活性。主要综述近年来酵母
表面展示技术在蛋白质工程方面的一些新应用。
1　蛋白质的固定化
蛋白质的固定化技术是蛋白质工程的一项重要
内容 ,通过酵母表面展示表达技术 ,将目标蛋白或酶
固定化在酵母细胞表面 ,能够提高蛋白或酶的稳定
性和重复利用性 ,而无需对蛋白进行复杂的分离纯
化。Kuroda等 [ 5 ]将酵母金属硫蛋白与α2凝集素片
段融合后展示表达在酵母细胞表面 ,用于有毒重金
属镉离子的螯合和生物吸附 ,镉离子的吸附效果以
及酵母工程菌对镉的耐受性依赖于展示表达蛋白的
量。Shibasaki等 [ 6 ]将表面展示 ZZ2结构域酵母与含
融合 Fc片段的脂酶或绿色荧光蛋白的工程酵母共
培养 ,发现融合蛋白能有效地被展示在酵母表面的
ZZ2结构域所亲和回收。 Furukawa等 [ 7 ]利用 Flo1p
将链霉卵白素展示在酿酒酵母表面 ,此蛋白显示出
具有结合生物素化复合物的能力 ,因此展示表达的
酵母细胞可作为全细胞亲和剂广泛应用于免疫分析
和生物传感研究。此外 ,酵母表面展示抗原技术作
为预防性或者治疗性疫苗也有报道。
各种酶类包括脂酶、生物素连接酶、有机磷水解
酶、淀粉酶、纤维素酶等都已经被成功地展示表达在
酵母细胞表面且具有生物活性 (表 1) ,这些酶在生
物酒精、医药、食品等工业生产中具有广泛的应用前
景。可以预见 ,酵母展示技术必定会成为酶工程研
究的一个极具潜力的发展方向。
2　识别蛋白相互作用
探究生物体内蛋白间相互作用是蛋白质工程的
重要内容 ,也是揭示各种疾病发生机理乃至生命现
象的关键所在 ,酵母展示技术为人们研究天然蛋白
间的相互作用提供了研究平台。B idlingmaier等 [ 8 ]
通过将人 cDNA文库展示表达在酵母细胞表面 ,利
用磷酸化肽对酵母表面的蛋白库进行筛选 ,检测到
几种未曾报道的能以酪氨酸磷酸化方式与 EGFR或
黏着斑激酶相作用蛋白分子。研究表明利用构建在
酵母表面的人蛋白库不仅可用于翻译后修饰分析 ,
还能鉴定目标靶分子以及确定与药物或小分子交叉
反应的未知蛋白。W adle等 [ 9 ]利用展示在酵母细胞
表面的肿瘤抗原评估特异肿瘤抗体在癌症患者体内
的反应 ,并筛选到了针对新型肿瘤抗原的 cDNA文
库 ,对酵母展示文库筛选揭示许多肿瘤抗原在原核
生物展示文库是检测不到的。需要注意的是 ,由于
移码多肽的表达可能会造成模拟表位被选出 ,因此
在筛选中使用与表达产物反应的抗血清确认十分
必要。
表 1　几种酵母表面展示表达的酶
酵母展示表达酶 酶基因来源 酶的应用
淀粉酶
葡萄糖淀粉酶 Rhizopus oryzae
α2淀粉酶 B acillus stearotherm ophilus 　　水解淀粉
环式糊精糖基转移酶 Saccharom yces cerevisiae
纤维素酶
内切葡聚糖酶Ⅱ Trichoderm a reesei
β2葡糖苷酶 Aspergillus aculea tus 纤维素降解
纤维二糖水解酶 Trichoderm a reesei
木糖降解酶
木糖还原酶 Pichia stipitis
木糖醇脱氢酶 Pichia stipitis 木糖降解
木酮糖激酶 Saccharom yces cerevisiae
脂酶 Rhizopus oryzae 生产酯
生物素连接酶 Escherich ia coli 生物素化蛋白生产
有机磷水解酶 Flavobacterium 机磷杀虫剂检测和灭毒
半乳糖差向异构酶 Escherich ia coli 转化半乳糖为葡萄糖
Yong Ku Cho等 [ 10 ]最近报道了一种酵母展示荧
光制备 ( YD IP)技术 ,利用此技术将 scFv展示在酵
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2009年第 8期 张伟等 :酵母表面展示技术在蛋白质工程中的应用
母细胞表面作为亲和剂用于可溶性和膜抗原的分离
和鉴定。他们利用 YD IP结合串连质谱技术法成功
地鉴定出神经细胞黏连分子 (NCAM )是结合脑内皮
细胞质膜抗体的抗原。结果显示 , YD IP结合流式细
胞技术能对抗原 2抗体的作用进行精确定量 ,同时优
化的 YD IP法能与 W estern bloting、银染、质谱等常用
的蛋白质研究工具相适用。此外 ,一些研究小组利
用酵母展示技术已从免疫或非免疫的的 scFV文库
中分离出能和多种目标蛋白相结合的新抗体 [ 11 ]。
3　改变蛋白亲和力和特异性
亲和力和特异性是蛋白的重要性质 ,也是对诊
断和治疗用蛋白作用控制的关键参数 ,酵母表面展
示技术可用于提高或者改变蛋白的亲和力和特异
性。近来有研究报导了一些关于 scFV亲和力成熟
的研究 ,而酵母表面展示也可被用来选择性扩展或
限制蛋白的结合特异性。当某些 scFV对肉毒杆菌
神经毒素 A1的亲和力成熟后 , Marks等 [ 12 ]使用双
重选择策略拓宽某些克隆的特异性 ,使其在保持对
A1的高亲和力的同时具有对 A2 的高亲和力。
W eaver2Feldhaus等 [ 13 ]则通过改变结合钙调蛋白的
scFV构象特异性 ,获得了一些只能够识别无 Ca2 +或
结合 Ca2 +的钙调蛋白的克隆。
除了抗体外 ,酵母表面展示也可用于其它一些
蛋白的亲和力成熟。两个研究组报导了对人第 10
个纤维连接蛋白类型 II结构域 (10 Fn3)进行改造使
其获得对模式抗原如麦芽糖结合蛋白和溶菌酶等高
亲和力 [ 14, 15 ]。J in等 [ 16 ]应用酵母表面展示对αL整
联蛋白插入结构域进行定向进化 ,从而使其配体结
合亲和力增加了 200 000倍。通过酵母表面展示提
高亲和力的其它一些分子还包括 EGF和单链 T细
胞受体 ( scTCR s)等。
利用酵母表面展示改造蛋白亲和力的一个最大
的优点是无需对单个克隆进行水溶性表达和纯化 ,
就能将被分离的突变体展示在细胞表面并直接表征
化。对展露表达的蛋白进行分析发现其平衡解离常
数与通过其它方法测定的数值基本吻合。
4　提高蛋白稳定性和表达水平
热稳定性和表达水平高低是衡量一种蛋白能否
在实际中应用的重要指标 ,蛋白的稳定性决定其储
藏的效力 ,而表达水平的高低则影响蛋白的生产成
本。Shusta等 [ 17 ] 将几种突变的单链 T细胞受体
( ScTCR)与凝集素 (Aga2p )融合并在酵母表面展示
表达 ,结果显示 ScTCR突变体的热稳定性与展示表
达和分泌表达水平相关 ,酵母展示技术可作为定向
进化工具用于突变蛋白稳定性和分泌特性的鉴定。
一些研究小组通过“随机突变 - 酵母展示诱导 - 高
展示筛选 ”策略提高某些蛋白 ,如 scTCR s[ 18, 19 ] ,MH2
C I H22Ld [ 20 ] , NY2ESO21[ 21 ] , EGFR[ 22 ]等的稳定性和
表达水平。在这些研究中 ,提高了稳定性的蛋白可
以在酵母和细菌中进行水溶性表达 ,而原始蛋白则
无法表达。事实上 ,这种稳定性改造可能并不适合
所有蛋白 ,对于那些具有异常高的热稳定性蛋白 ,其
稳定性可能与其展示表达的水平并不相关 [ 23 ]。
酵母表面展示可以在蛋白的基因型和相关表型
间建立联系 ,通过改造表达宿主而非蛋白质本身提
高水溶性表达水平。W entz等 [ 20 ]利用酵母表面展
示技术筛选酵母 cDNA文库 ,获得了一些过量表达
能提高 scFvs和 scTCR s产量的酵母基因。他们发
现 ,蛋白与 Aga2p融合后可以改变异源蛋白在酵母
中的分泌过程 ,使展露表达水平取决于异源蛋白而
不是 Aga2p。他们鉴定了某些基因 ,这些基因甚至
可以在没有 Aga2p的情况下通过过量表达提高分泌
水平。Rakestraw[ 21 ]报导了一种方法 ,这种方法能够
消除由于与 Aga2p融合导致的假阳性且仍然维持分
泌表型和基因型之间的联系。他将酵母与靶蛋白的
结合伴侣连接在一起 ,当靶蛋白被细胞分泌 ,这个结
合伴侣可以将其捕捉。数学模型和实验观察表明 ,
这种选择方法能够区分分泌水平之间微妙差异且拥
有与文库筛选相似的时间窗口 ,而且由于将蛋白结
合伴侣作为诱饵 ,只有那些能够分泌已经被完全折
叠好的蛋白的克隆才能够被选出。
5　绘制蛋白质表位图谱
识别介导蛋白间相互作用的关键氨基酸有助于
人们对生化过程理解和蛋白设计 ,而酵母展示技术
则能以系统性和大规模方式对这些关键氨基酸残基
进行鉴别。Chao等 [ 22 ]将 EGFR和一些抗 EGFR抗
体的抗原构建酵母表面展示文库 ,通过筛选得到了
能识别氨基酸的高分辨率表位图。利用此技术对抗
原 -抗体作用的表征化研究也较多 , D iamond等 [ 23 ]
将 BoNT/A (肉毒神经毒素 A型 )的 3个结构域展示
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
在酵母细胞表面 ,用于研究与毒素结合的 6个 mAB s
的表位图 ,结果表明利用酵母展示技术可在结构域
水平对 BoNT抗体表位构象进行作图 ,并发现了 3
个中和 BoNT/A表位。其它一些利用酵母展示进行
表位研究的抗体还包括抗西尼罗病毒 (W est N ile vi2
rus)蛋白 NS1[ 24 ]、抗 SARS冠状病毒的核壳体蛋
白 [ 25 ]和癌睾丸抗原 NY2ESO21[ 26 ]等。此外 ,这项技
术还能够识别非连续和构象型抗原表位 ,对于蛋白
间相互作用的研究也比丙氨酸扫描法更为灵敏。
6　展望
细胞表面展示技术已经成为蛋白质工程研究的
重要工具 ,利用此技术可定向改造目标蛋白 ,同时在
蛋白的分离纯化、蛋白固定化、蛋白间相互作用等方
面都有广泛应用。酵母是真核生物 ,利用酵母为宿
主展示表达的各种蛋白为人们研究和操作复杂真核
蛋白成为可能。尽管酵母和哺乳动物的糖基化结构
有所差异 ,发展人的细胞表面展示系统也势在必行 ,
但目前酵母系统仍然是最适合真核蛋白表达的系
统 ,对于那些糖基化差别不是很大的重要蛋白 ,使用
酵母系统表达来处理人体蛋白糖基化过程仍可作为
一种替代方法 [ 27 ]。
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