全 文 ：酶的定向进化及其应用
孙志浩，柳志强 !
（江南大学 生物工程学院生物催化研究室，工业生物技术教育部重点实验室，无锡 !"#$%&）
摘 要：综述了生物催化剂（酶）分子定向进化的产生、原理、方法及应用，深入阐述酶分子定向进化过程中的相关
问题，重点介绍了易错 ’()（*++,+-.+,/0 ’()）和 123改组（123 4567789/:）等几种典型的酶定向进化方法与成功实例，
展望了生物定向进化研究的发展前景。
关键词：生物催化剂；蛋白质工程；非理性设计；定向进化；易错 ’()；123改组
中图分类号：;"< 文献标识码：3 文章编号："&（!$$?）$% = $$$< = $<
!"#$%&’ ()& (**+,-(#,%) %. &,/"-#"& ")012" "3%+4#,%)
@A2 B59-5C,，DEA B59-F9C/:
（DCG,+CH,+I ,7 J9,KCHC8I494，@K5,,8 ,7 J9,H0K5/,8,:I，@,6H50+/ LC/:HM0 A/9N0+49HI，O50 P0I DCG,+CH,+I ,7 E/Q64H+9C8 J9,H0K5/,8,:I，
R9/94H+I ,7 *Q6KCH9,/，S6T9 !"#$%&，(59/C）
56’#/(-#：O50 594H,+I，.+9/K9.80，U0H5,Q4 C/Q C..89KCH9,/4 ,7 Q9+0KH0Q 0/MIU0 0N,86H9,/ C+0 +0N90V0Q 9/ H594 C+-
H9K80，C/Q H50 F604H9,/4 U0H 9/ H50 .+,K0Q6+0 ,7 Q9+0KH0Q 0/MIU0 0N,86H9,/ C+0 76+H50+ Q94K6440Q W @0N0+C8 +0.+0-
40/HCH9N0 U0H5,Q4，46K5 C4 0++,+ .+,/0 ’() C/Q 123 4567789/:，C/Q 46KK044768 4CU.804 C+0 9/H+,Q6K0Q W R0C/-
V5980，H50 Q0N08,.U0/H ,7 Q9+0KH0Q 0/MIU0 0N,86H9,/ 94 C84, .+,4.0KH0Q W
7"1 8%/&’：G9,KCHC8I4H；.+,H09/ 0/:9/00+9/:；9++CH9,/C8 Q049:/；Q9+0KH0Q 0N,86H9,/；0++,+ .+,/0 ’()；123 4567-
789/:
由于绝大部分生物催化剂———酶是蛋白质，因
此生物催化剂的分子定向进化又称为酶的定向进化
（Q9+0KH0Q 0/MIU0 0N,86H9,/）［"］。在不需事先了解生物
催化剂的空间结构和催化机制的条件下，通过各种
突变方法向编码生物催化剂的基因中引入突变，突
变的基因可以通过重组如 123 改组等方法进行重
新组装，提高基因进化的效率。这些被改造的基因
可以生产性能提高的生物催化剂，进而利用筛选或
选择的方法在较大的文库中获得具有目的性能的突
变株。
利用定向进化方法不仅为有机化学领域提供有
用的生物催化剂，而且利用该手段还可以改变生物
催化剂的性能，甚至可以使生物催化剂具备原本不
具有的催化活力和性能［!，%］。该方法是一种在生物
体体外（试管中）模拟达尔文进化的、快速的、具有一
定目的性的改造蛋白质的方法，相对于传统的蛋白
质的“理性设计（+CH9,/C8 Q049:/）”方法，该方法被称为
蛋白质的“非理性设计（9++CH9,/C8 Q049:/）”方法［#］。
定向进化方法可以在试管中以较短的时间（几
个月或几周内）完成自然条件下需要千百万年的进
化过程。酶的定向进化方法实用性较强，可以通过
对编码酶基因进行随机突变，进而改进酶的特性，也
可以改造整个生物合成和生物降解途径［?］。
美国 RCTI:0/公司的 @H0UU0+将 123改组（123
! 收稿日期：!$$?-$&-$>
基金项目：国家 X<% 项目（!$$%(J<"&$$>）、国家自然科学基金项目（!$#<&$%X）。
作者简介：孙志浩，男，教授，博士生导师，研究方向为微生物、酶与生物催化。
第 % 卷第 % 期
!$$? 年 > 月
生 物 加 工 过 程
(59/040 Y,6+/C8 ,7 J9,.+,K044 */:9/00+9/:
36: W !$$?
· < ·
万方数据
!"#$$%&’(）方法应用于定向进化过程中［)，*］，为定向进
化的理论及应用研究奠定了基础。目前，酶的定向
进化主要在以下几个方面开展工作：在非自然或极
端环境中（此时生物催化剂的活性和稳定性极低）生
物催化剂稳定性和功能的提高；对新底物催化活性
的提高，特异性的调节（尤其是对映体选择性）以及
在异种宿主中功能表达能力的提高［+］。引用加州理
工学院从事定向进化研究的生物化学家弗朗西丝·
阿诺德女士对定向进化的解释可以对该方法有进一
步的认识：“定向进化是物种进行选择的一个高技术
版本，是在分子水平上的繁育。研究的对象不是整
个机体，而是特定的基因或蛋白质”［,］。
! 定向进化的原理及目的
定向进化是利用 -./ 012多聚酶不具有 34!54
校对功能的性质，并结合基因工程现有技术手段，在
待进化酶基因的 678 扩增反应中，配合适当条件，
以很低的比率向目的基因中随机引入突变，并构建
突变库。凭借定向的选择方法，选出所需性质优化
的酶，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则
是：“获取所筛选的突变体”［9:］。简言之，定向进化
就是随机突变同选择或筛选相结合。与自然进化不
同，定向进化是人为引发的，起着选择某一方向的进
化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全
是在人为控制下进行的。酶分子定向进化的目的在
于，人为地改变天然生物催化剂的某些性质，增强在
不良环境中的稳定性，创造天然生物催化剂所不具
备的某些优良特性甚至创造出新的活性，产生新的
催化能力，扩大生物催化剂的应用范围。
" 定向进化中突变文库的构建方法
突变体的量、突变基因文库建立的简便性、建立
突变基因文库方法的可操作性在很大程度上影响着
进化研究的效率，随着定向进化技术在酶分子改造
领域所展现出的其他方法不可取代的优势，研究者
设计了多种用来建立突变基因文库的方法，根据创
建突变基因文库方法的不同可将它们大致分为非重
组型和重组型，简介如下。
; <9 易错 678［99，9;］
易错 678 是指在扩增目的基因的同时引入碱
基错配，导致目的基因随机突变。然而，经一次突变
的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错
678（=>/#>’?&.% >@@A@BC@A’> 678）策略。即将一次 678
扩增得到的有用突变基因作为下一次 678 扩增的
模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小
突变累积而产生重要的有益突变。7">’（陈克勤）等
人用此策略使在非水相（二甲基甲酰胺，0DE）溶液
中定向进化枯草杆菌蛋白酶 F 的活性获得成功，所
得突变体 673 在 ):G的 0DE中，催化效率比野生酶
高 H*9 倍［9H，95］。
易错 678（F@@A@BC@A’> 678）是非重组型构建突
变文库的方法。由于普通的 -./ 012聚合酶不具有
34!54 外切酶活力，在扩增过程中不可避免的发生
一些碱基的错配。在扩增体系因素发生改变如改变
D(; I浓度或使用 D’; I 代替了 D(; I 作为 012 合成
酶的激活剂时可以使错配率提高。易错 678 方法
由 J>#’( 等于 9,+5 年首次设计并报道，9,,; 年由
7%.KL>%% 和 MANO>对其进行完善［93］。
在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，
属于无性进化（.=>P#.% >QA%#?&A’）。使用该方法易出
现同型碱基转换。易错 678 只能使原始蛋白质中
仅有很小的序列空间发生突变，因而一般适用于较
小的基因片段（ R +:: SC）。但对于初涉定向进化的
研究者，易错 678 不失为一种有效、实用的进化方
法［9)］。
; <; 012改组和外显子改组［)，*］
012改组又称有性 678（=>P#.% 678），是基因在
分子水平上进行有性重组（=>P#.% OATS&’.?&A’）。该
方法由 =?>TT>@于 9,,H 年引入到蛋白质的定向进化
过程中，并成功地改造了数十种具有工业用途的蛋
白质。该方法通过改变单个基因或基因家族（(>’>
$.T&%N）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达
产物以新功能。012 改组策略的目的是创造将亲
本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的
变异，最终获取最佳突变组合的酶。在理论和实践
上，它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易
错 678”。通过 012 改组，不仅可加速积累有益突
变，而且可使酶的两个或更多的已优化性质合为一
体。在 012改组过程中能以较低的和可控制的几
率引入了点突变，同时它允许发生单一突变和较大
的 012片段的突变（图 9）。
外显子改组（>PA’ ="#$$%&’(）类似于 012 改组，
两者都是在各自含突变的片段间进行交换，与 012
改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的
同源性带动，而 012 改组不受任何限制，发生在整
个基因片段上。外显子改组更适用于真核生物，并
· + · 生物加工过程 第 3 卷第 3 期
万方数据
可获得各种大小的随机肽库。
图 ! "#$ 改组原理与流程图［%，&，’］
()* +! ,-)./)012 3.4 0-5/246-2 57 "#$ 896771).*
随着研究的不断深入，"#$ 改组技术也在不断
的改进［!’］。目前，利用 "#$ 改组已成功进化了编
码!:内酰胺酶、!:葡萄糖苷酶、绿色荧光蛋白、烷基
转移酶、苯甲基脂酶和 ;:<#$ 合成酶单一基因以及
编码砷酸盐或阿特拉津降解酶的整个操纵子。
"#$改组的两个最主要的缺点是：!非改组背
景克隆子恢复成亲本克隆子；"亲本基因序列的同
源性要求较高（常常不小于 =>?）。现已发展了家
族改组［!’ @ !=］以及使用单链 "#$ 作为改组模板的
"#$重组技术，以弥补传统 "#$改组方法的缺点。
A +B 定向进化的其他方法
随着酶分子定向进化的发展，在常规的定向进
化方法的基础上，又相继开发出了一些定向进化的
新方法，如体外随机引发重组（-3.45C 0-)C).* !" #!$%&
-2/5CD).3;)5.，<,<）［A>］、不依赖于同源性的蛋白质重
组方法（82E62./2 95C515*F:).4202.42.; 0-5;2). -2/5CD):
.3;)5.，GHI,
/9)C2-3*2.28)8 5. ;-3.8)2.; ;2C013;28，<$KHIMM）、渐增
切割产杂合酶方法（ )./-2C2.;31 ;-6./3;)5. 75- ;92 /-2:
3;)5. 57 9FD-)4 2.NFC28，IMKHO）［AB］以及酶法体外随机
:定位诱变（ -3.45C:8);2:4)-2/;24 C6;3*2.28)8）［A% @ A&］等
方法，应用这些新方法已经有相当一部分成功的例
子，但仍没有易错 ,K<和 "#$改组等传统方法应用
得普遍。
将生物信息学以及统计学等学科引入到蛋白质
的定向进化中来，并结合计算机技术进行合理化设
计，将此作为定向进化的辅助方法，能够有效的降低
定向进化过程的操作强度和提高蛋白质定向进化成
功的几率［A’，AP］。$-.514 等［A=］用计算的方法，限制了
突变库的大小，减小了筛选正向突变体的工作量。
利用统计学方法并结合构建的突变模型，对有限突
变文库中发生的有益突变的位点分析发现，突变库
中有益突变常常集中发生在那些对替换容忍程度大
的氨基酸残基上。
! 突变基因的筛选和选择
筛选方法在定向进化中显得极其重要，人们常
引用这句短语“你要获得你所要筛选的（F56 *2; Q93;
F56 8/-22. 75-）”，有效的筛选方法是进行定向进化操
作成功的关键。
筛选方法可分筛分（8/-22.).*）和策略选择（82:
12/;)5.）两大类［B>］。筛选是在一个文库中有其它成
员存在的条件下确认一个目的成员的过程，是将库
中的每个个体进行活性调查，如果从表型上不能区
分活性，则只能随机进行逐个测试。“选择”是在文
库中仅仅有目的成员表现出来，如一个可见的目的
微生物克隆，因为它仅仅允许含有的编码一个特殊
酶基因的微生物生长，这种所谓的体外选择通常是
很有效的。
在定向进化中，尽管突变具有随机性，但通过选
择特定方向的突变限定了进化趋势，同时控制实验
条件来限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容
量，这不仅减少了工作量，也加快了生物催化剂在某
一方向的进化速度。筛选方法必须灵敏，至少与目
的性质相关。生物催化剂改造中常用的筛选方法如
表 !。
高通量筛选为从基因改组和杂交实验得到的众
多突变体中找到性能改良的生物催化剂提供了可
能，这些高通量筛选方法包括细胞表面展示技
术［BA］、噬菌体表面展示系统［BB，B%］、核糖体展示技
术［BR］等，其中噬菌体展示技术是一种进行体外选择
的有效的方法，在研究中已有很多成功应用的例
子［B& @ BP］。用噬菌体展示技术，核糖体展示技术或
细胞展示技术通量高但是通用性差，只能对结合能
力进行筛选。目前最好的筛选方法是基于生色底物
或荧光显色［B=］，以及产物的一些物理化学性质
等［%> @ %A］，筛选的数目大概是 !>R。<2FC5.4 等建立
A>>R 年 P 月 孙志浩等：酶的定向进化及其应用 · = ·
万方数据
了一种通用的水解酶荧光底物测活方法。由不同前
体水解产生氨基和二醇，高碘酸钠原位氧化，再以牛
血清白蛋白催化!!消除反应，产生荧光产物。这种
方法的用途可以很广，各种酰胺水解酶、磷酸酯酶、
脂肪酶、酯酶和环氧化物水解酶都可以用这种方法
检测［"#］。
策略选择是高通量筛选的首选方法。“选择”仅
仅允许含有编码一个特殊酶基因的微生物进行生
长，在文库中仅仅有目的成员表现出来，没有活性或
者活性不够高的个体无法存活，因此真正模拟自然
进化，体现了物竞天择，适者生存的道理。选择的主
要优点是不符合要求的个体根本不出现，可以同时
分析多得多的库中个体。例如高温下一个可见的嗜
热微生物克隆。由于特定选择系统控制的微生物细
胞是极其多样的，因此建立一个通用的选择系统往
往是不那么容易的，而且有可能产生假阳性或假阴
性。当这种现象很严重时，就需要建立更有效的筛
选方法。酶分子定向改造中常用的策略选择方法简
介如表 $。
表 % 酶定向进化中常用的筛选方法［#%］
&’()* % +,--*./ 01-**.2.3 ’.4 0*)*1/25. 6*/7540 ,0*4 2. /7* 42!
-*1/*4 *.896* *:5/’/25.
方法类型 终 点 动态分布图
产色素 ;荧光 薄层色谱法 有色
物质或产物 产物
染色
产色素!荧光 反应
物 ;生成物 <= 指
示剂
附配试剂 >?@A& 酶联免疫吸
附测定
间质片层反应物
分析工具 高压液相色谱 质
谱仪 +@ 鸟嘌呤
和胞嘧啶
=5653*.*5,0 1’/ B !
@CDAE 红 外 线 温
度记录仪 FGH 折
叠基因报告
表 $ 酶分子定向改造中代表性的选择方法［#%］
&’()* $ C4*./2I21’/25. 6*/7540 -*<-*.0*./’/2:* 2. /7* 42-*1/*4 *.896* *:5),/25.
方法 选择策略 特征
生长的选择性物质 能够降解化合物 降解物质成为生长需要的元素如 J、+、A
自养互补作用 恢复代谢功能 强阳性选择
噬菌体展示 结合 展示病毒表面的肽或蛋白质，依据结合亲和性来分离
+E&折叠报道基因 抗生素抗性
通过氯霉素乙酰转移酶融合标签，正确折叠的蛋白质对有机体产生抗
生素抗性
! 定向进化的应用
定向进化在其出现的短短的十几年内已发展成
一门相当成熟的蛋白质及多肽的改造技术，它的应
用极大地促进了酶工程、代谢工程以及医药等其他
相关领域的发展。在众多研究者的共同努力下，蛋
白质定向进化领域取得了卓著成绩，定向进化应用
于工业生物催化剂改造的成功例子已经很多。以下
列举几个典型实例。
" B% 易错 H+K 的应用：在 LMG 中枯草杆菌蛋白酶
的激活
枯草杆菌蛋白酶（0,(/2)202.）在 LMG 浓度较高时
也很稳定但催化活性不高。即使枯草杆菌蛋白酶分
子在一个或两个位点上发生突变，突变酶活力也不
会很高。通过易错 H+K建立 LJE突变文库，在每一
代中挑选出单个突变体作为下一代的母本。突变基
因被连接到质粒上，并转化到大肠杆菌中，用酪素平
板法测定其在 LMG中枯草杆菌蛋白酶活，进行突变
蛋白质粗筛：在琼脂平板上的菌落周围，枯草杆菌蛋
白酶被分泌到培养基中，由于分解酪素而形成了透
明圈，透明圈较大的菌落产生的酶活较高。
在第一代中尽管只有 # 个氨基酸被取代，第 "
个氨基酸通过已知的定点突变体进行互换，在 NOP
的 LMG中，酶活提高了 "O 倍。另外六代中每一代
筛选上百个菌落，考察的 %O"个菌落中与野生型比
较，发现酶的进化一代代降低，这种简单的获得新枯
草杆菌蛋白酶的方法并不能保证得到最好的酶。
+7*.（陈克勤）等［%"，%Q］用易错 H+K 改造枯草芽
孢杆菌蛋白酶 @，变异体在 NOP和 RQPLMG 中的催
化效率 !1’/ ; !6 比野生酶分别提高了 $QN 和 %#%
倍，比活力提高了 %QS 倍。在此基础上再进行两轮
易错 H+K，筛选得到的突变体在 NOP二甲基甲酰胺
中又提高了 # 倍，比野生酶高 "S% 倍。
" B$ LJE改组的应用：对硝基苯酯酶基因重组
@)2 C2))9公司利用对硝基苯酯酶水解 LMG 中!!
内酰胺化合物中对硝基苯酯，而对有锌盐和纯粹的
有机途径不感兴趣。因此要寻找可以水解酯的酶。
由于在自然界中可以水解酯的酶不能在 LMG 中水
解抗生素，他们用已有的活性较低的酶作为定向进
·%O· 生物加工过程 第 # 卷第 # 期
万方数据
化的起始酶。
野生型酯酶并不能被分泌，也没有任何简单的
测量检验方法。为了避免用 !"#$ 筛选成千的菌落
的强度，首先寻找水解反应后可以产生对硝基苯酚
的对硝基苯酯酶，而对硝基苯酚在 %&’孔平板上可利
用比色测定。随机 "$( 突变后的四代中可筛选出
) ***个菌落，发现 )+,的 -./ 中酯酶的酶活提高
了 )+ 倍，第四代后，收集了 &0 个克隆子，用来考察
对硝基苯和对硝基苄酯酶酶活间的交互作用。利用
-12改组，在仅筛选的 0** 个菌落中有 3 个克隆子，
它们的活力至少比亲代基因的酶活提高了 4* 倍。
0 56 酶的稳定性和活力的提高
在微生物拆分泛解酸内酯的实际应用中发现：
随着催化反应的进行，反应体系中的中性 -’泛解酸
内酯被 -’泛解酸内酯水解酶水解成酸性的 -’泛解
酸，导致反应体系中的酸性增强，7! 下降迅速。由
于野生型的 -’泛解酸内酯水解酶最适催化 7! 为
8 5*，当 7!低时耐受能力差，因此酶的催化活力也随
之下降。为了使酶促反应能够顺利进行，必须向反
应体系中持续的流加氨水，以使反应体系维持在酶
作用的最适 7! 范围内，否则，酶促催化反应几乎不
再进行。另外，正常催化条件下，野生型 -’泛解酸
内酯水解酶的酶活力也需进一步提高。为了解决以
上问题，笔者研究小组利用易错 "$(和 -12改组组
合方法对 -’泛解酸内酯水解酶进行了定向进化研
究［00］。
经过三轮易错 "$(和一轮 -12改组，以酶活力
和 7!稳定性为指标，对约 8 5+ 万株突变体进行筛
选，最终获得一株酶活力高、且在低 7! 条件下稳定
性好的突变株 .9: ;’3&)。该突变株的酶活力是野
生型酶的 + 5+ 倍。对突变体和野生型酶在 7! & 5*
和 7! + 5* 条件下的残余酶活进行对比，在这两种
7! 条件下，突变体酶的酶活残留分别为 8+, 和
+*,，而野生型酶只能保持原来的 0*,和 4*,。通
过软件 -12.21对突变体 .9: ;’3&) 酶基因和野生
型酶基因进行分析对比，发现突变体 .9: ;’3&) 酶
基因发生了三处点突变，其中突变使两处氨基酸取
代，即 ))3 位的 <’= 和 40) 位的 >’?，另一处为沉默
突变，未引起氨基酸的变化。
0 50 对映体选择性的提高
用定向进化提高生物催化剂的对映体选择性是
解决手性物质纯度低的一个很有潜力的方法。乙内
酰脲酶 @氨基甲酰酶不能大规模地应用于生产对映
纯 #’氨基酸的一个主要原因是乙内酰脲酶没有足
够的对映体特异性，它的特异性随着底物上的 +A’取
代物而变化。当筛选不到较好的 #’型乙内酰脲酶
时，则采用定向进化改造乙内酰脲酶的对映体选择
性。4*** 年 .BC等用易错 "$(和筛选方法，提高乙
内酰脲酶转化底物的异构选择性，全部活性提高了
6 倍［%］。用这种方法，可快速实现对映体选择性的
转化。仅有两个有效氨基酸残基发生取代时，就表
现出对称选择性上的显著差异，一个突变体在对映
体过量值为 %*, ! 5 ! 5 时产生 -’型对映体，而另一
个 #’型突变体在对映体过量值为 0*, ! 5 ! 5 时则产
生 4*,的相反的对映体产物，尽管 #’型酶活力不显
著，但提供了进一步改造的空间，已经证明在吨级生
产规模上使用简单的间歇反应器和连续离心细胞分
离，使酶活得以提高。
! 酶分子定向进化的发展与展望
酶分子定向进化最初的尝试始于 4* 世纪 &* 年
代，DEF D7GHIHFJBK成功地再分子水平上定向改造了
(12噬菌体复制酶 =，模拟了自然进化过程，但当时
他们进行该实验的目的只是为了证明达尔文的自然
选择可以发生在生物体外，由于没有太大的实际应
用价值，因此该实验没有受到重视。
-12改组方法最初是 LEKH " " 在 )%33 年研究
小鼠同类株组织相容性基因时提出来的，)%%0 年
D:HJJHM将其引入到酶分子定向进化中［&，8］。利用
-12改组方法 D:HJJHM对!’内酰胺酶进行了改造以
向培养物中添加头孢氨噻为选择压力，经三轮 -12
改组和筛选得到了酶活力提高 64 *** 倍的突变体。
)%%0 年 D:HJJHM 在 1B:9MH［&］和美国科学院会刊［+］上
发表了自己的研究成果，随后他将 -12 改组在蛋白
质定向进化中的应用申请了专利，并以该技术为基
础平台建立了专业性的从事定向进化的公司
（N::7：@ @ OOO5 JBPCIHK 5 QEJ @ GKRHPB 5 7N7），据该公司称
目前他们已经完成了数十种蛋白质的定向进化，并
有部分实现了商业化。另一个在定向进化领域比较
突出的是加州理工学院弗朗西丝·阿诺德（/MBKQHS
!52MKEFR）研 究 小 组（ N::7：@ @ OOO5 QNH 5 QBF:HQN 5 HR9 @
IME97S @ TNB）。该研究小组最初利用易错 "$( 技术并
结合筛选实现了枯草杆菌蛋白酶 ; 在大肠杆菌中
的表达量和在有机溶剂反应体系中的酶活力的提
高，在随后的研究中该小组又对枯草杆菌蛋白酶的
热稳定性进行了改造。该研究小组还提出了一些其
他种类的定向进化的方法如体外随机引发重组［4&］、
4**+ 年 3 月 孙志浩等：酶的定向进化及其应用 ·))·
万方数据
交错延伸［!"］等。以上两个研究小组在定向进化领
域一直比较活跃，发表了大量的研究论文，为其他研
究者提供了很多有价值的经验和可借鉴的方法。
国内进行定向进化研究的起步较晚，最初进行
这方面研究的是吉林大学酶工程教育部重点实验室
张今研究小组［!#，!$］，他们以天冬氨酸酶为模型提出
了一种酶法体外随机%定位诱变的改造酶的方法，该
方法通过控制 &’( 合成的底物种类和浓度比例实
现碱基对的错配，对目的基因既采用随机突变增加
突变位点，以快速产生优质酶，又使其突变受到一定
限制，以减少筛选突变体的工作量。利用该方法他
们对天冬氨酸酶进行了成功的改造，提高了天冬氨
酸酶的活力。笔者研究小组用易错 )*+ 和 &’( 改
组组合方法，结合两步法筛选系统，对 &%泛解酸内
酯水解酶进行了定向进化，取得了很好的效果［##］。
国内许多高等院校与科研院所的研究小组也相继开
始了蛋白质定向进化方面的工作。
实验证明：定向进化不仅可以应用于生物催化
剂活性、热稳定和耐操作条件性能的显著提高而且
还可以应用到疫苗和制药领域，对疫苗和蛋白类药
物进行改造［#$，#,］，在各个应用领域，定向进化都取
得了显著成功［#-］。定向进化为生物催化剂从实验
室研究走向工业应用提供了强大的手段。目前，对
一些酶（或蛋白质）、砷酸盐解毒途径［#"］、抗辐射
性［#.］、生物合成途径［$/］、对映体选择性［$0］、抗体
库［$!］以及 &’(结合位点定向进化［$1］的可喜成果令
众多的相关领域的科学家为之振奋。可见，进化能
发生在自然界，也能发生在试管中，它与合理设计互
补，将会使分子生物学家更加得心应手地设计和改
造酶（或蛋白质）分子，将使蛋白质工程学更加显示
出强大的威力和诱人的前景［$#］。
参考文献：
［0］ +234567 &’ 8 )9:;<45 <5645<<9456 =9:> ? 34:45@2A;94?B C:45; := D4
I?@ MI4 PM(，0..-，.#：# $/#%# $/. 8
［1］ +?4BB?9@ M，Q9<33<9 (，*7<5 R，<; ?B 8 ’:D< ?I;4D4;4;4:5?B CB?A;4I4;O 9
［#］ 张红缨，孔祥铎，张 今 8蛋白质工程的新策略———酶的体外定
向进化［F］8科学通报，0...，##：0 0!0%0 0!- 8
［$］ M;<>><9 N)* 8T:B
0.%!/，1%0! 8
［,］ M;<>><9 N)* 8 &’( A72==B456 3O 9?5@:> =9?6><5;?;4:5 ?5@ 9%
3BO——— !" #!$%& 9
［-］ M;<>><9 N)* 8 +?C4@
［"］ F?<6<9 QU，+<<;S TV 8 &49
［.］ (95:B@ L9:2C N<3 C?6<［UH W GX］8 7;;C：W W EEE 8 I7< 8 I?B;
［0/］R:2 X，(95:B@ YK 8 &49
U56，0..,，.：--%"1 8
［00］X<256 &N，*7<5 U，L:<@@<;7:@ =:9 9?5@:> >2;?6<5
［0#］*7<5 Q，(95:B@ YK 8 U5SO>< <5645<<9456 =:9 5:5?Z2<:2A A:BD<5;A：9?5%
@:> >2;?6<5
@4?［F］8 H4:;
9:5><5;A：A
,!! 8
［0,］吴梧桐 8蛋白质工程技术与新型生物催化剂设计［F］8药物生物
技术，!//#，00：0%, 8
［0-］ Q4\2I74 T，G754A74 Q，K?9?O?>? M 8 (5 <==
><;7:@ 2A456 A456B<%A;9?5@<@ &’(［F］8 L<5<，!///，!#1：011%01- 8
［0"］*9?><94 (，+?4BB?9@ M(，H<552@=9:> &4D<9A< MC
［0.］Q4\2I74 T，G754A74 Q，K?9?O?>? M 8 ’:D4BO M72==B456 T<;7:@A =:9
;7< 45 [4;9: UD:B2;4:5 := U5SO>
;4:5：?5 <==
［!0］M4<3<9 [，T?9;45
@4A;?5;BO 9
［!1］K2 NM，H:E>?5 UK，&
45 ? @4A;45I; 9<;9:D49?B A23C:C2B?;4:5 ?5@ <^7434;A 7467 5<6?;4D< 45;<9=<9%
<5I<［F］8 F [49:B，0..-，-0：, /!"%, /1, 8
［!#］张 今，李正强，张红缨 8人参多肽基因的酶法体外随机%定位
诱变［F］8生物化学，0..!，"：00$%00. 8
［!$］张红缨，李正强，张 今 8酶法体外建立天冬氨酸酶基因的随机
突变库［F］8科学通报，0..0，1,：0 $//%0 $/! 8
［!,］张 今，张红缨，王晓平，等 8天冬氨酸酶的研究和应用［F］8自
然科学进展，0..-，-：!,,%!-/ 8
·0!· 生物加工过程 第 1 卷第 1 期
万方数据
［!"］ #$%&’$( )*，+’,-., /* 0 1$%234-35& 67-8’98:%;7%54% <%.,,%=>?( 35
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［MF］*.5%, C，1?74Z-B75 A 0 W5 S3-$’ ,%?%4-3’5 .52 %S’?7-3’5 ’9 9754-3’5.? J$’8
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［M!］V.$$%5 *:，*.$’?%],Z3 AL，D%7Z’S34 :C 0 A $.J32 ,4$%%5 ’9 .4-3S% ,3-%
=7-.5-, 35 &?(435.=32% $3>’574?%’-32%［C］0 D3’4B%=，FGGN，O[：H H[[8H
HN! 0
［MO］V.B?%$ /，<%(=’52 C) 0 @’S%? =%-B’2, 9’$ >3’4.-.?(,- ,4$%%535&［ C］0
+7$$ 6J35 +B%= D3’?，!EEF，[：F[!8F[H 0
［MM］柳志强，孙志浩，郑 璞，等 0 /8泛解酸内酯水解酶的定向进化
［C］0生物工程学报，!EE[，!F（[）：GO8FEF 0
［M[］)%% 1+，*’=%5 AU<，*3^-, D@，%- .? 0 D3’,(5-B%,3, ’9 ,-$74-7$.??( 5’S%?
4.$’-%5’32, 35 L 0 4’?3［C］0 +B%= D3’，!EEO，FE：M[O8MN! 0
［MN］)%’5& :<，+B.5& C++，65& <，%- .? 0 6J-3=3K%2 %_J$%,,3’5 .52 ,J%43934
.4-3S3-( ’9 W)8F! >( 23$%4-%2 =’?%47?.$ %S’?7-3’5［ C］0 1$’4 @.-? A4.2
:43 T:A，!EEO，FEE：F FNO8F FNH 0
［M"］P.,,%$’- A1，/34Z35,’5 +/，\.5& X，%- .? 0 6J-3=3K.-3’5 ’9 J$’-%35 -B%$8
.J%7-34, >( 23$%4-%2 %S’?7-3’5［ C］0 \B%$.J%7-34 Q’47,，!EEO，H：FFH8
F!N 0
［MH］/.?>( 1A 0 6J-3=3,35& %5K(=% 9754-3’5 >( 23$%4-%2 %S’?7-3’5［C］0 +7$8
$%5- 6J353’5 35 :-$74-7$.? D3’?’&(，!EEO，FO：F8N 0
［MG］+$.=%$3 A，/.]%, #，<’2$3&7%K LC$，%- .? 0 *’?%47?.$ %S’?7-3’5 ’9 .5 .$8
,%5.-% 2%-’_3934.-3’5 J.-B].( >( /@A ,B799?35&［C］0 @.-7$% D3’-%4B5’?，
FGG"，F[：MON8MOH 0
［[E］L]35& / 0 \B% 23$%4-%2 %S’?7-3’5 ’9 $.23.-3’5 $%,3,-.54% 35 L 0 4’?3［C］0
D3’4B%= D3’JB(, <%, +’==75，FGG[，!FN：[MG8[[O 0
［[F］<34B.72 +，*%5&358)%4$%7?_ /，1’4B%- :，%- .? 0 /3$%4-%2 %S’?7-3’5 ’9
>3’,(5-B%-34 J.-B].(, 0 <%4$73-=%5- ’9 4(,-%35% -B3’%-B%$, 9’$ 4’5,-$74-8
35& -B% 4%?? ].?? ’9 L,4B%$34B3. 4’?3［ C］0 C D3’? +B%=，FGGO，!NH：!N
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［[!］*.-4B.= #V，D’]%5 A<: 0 D3’4.-.?(,3, 9’$ 4B3$.? 35-%$=%23.-%,：=%%-8
35& 4’==%$43.? .52 -%4B534.? 4B.??%5&%,［ C］0 +B%= \’2.(，FGGN，FM：
!E8!M 0
［[O］ +$.=%$3 A，+]3$?. :，:-%==%$ V，%- .? 0 +’5,-$74-3’5 .52 %S’?7-3’5 ’9
.5-3>’2(8JB.&% ?3>$.$3%, >( /@A ,B799?35&［ C］0 @.-7$% *%2，FGGN，!：
FEE8FE! 0
［[M］林章凛，曹竹安，邢新会，等 0工业生物催化技术［C］0生物加工
过程，!EEO，F：F!8FN 0
!EE[ 年 H 月 孙志浩等：酶的定向进化及其应用 ·FO·
万方数据