全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-09-08
基金项目：福建省科技厅重大项目（2005Q007）
作者简介：黄钦耿（1984-），男，江西上饶人，硕士在读，主要从事土壤宏基因组学研究；E-mail：quenyhuang@163.com
通讯作者：黄建忠，男，教授，E-mail：hjz@fjnu.edu.cn
生物质是自然界中含量最为丰富的有机物质，
主要成分包括纤维素（40%~45%）、半纤维素 （25%
~35%）和木质素（15%~20%） [1]。 近些年，随着能源
危机的日益加剧，对化石能源储备终将耗尽的忧患
意识的日益增长，人们对利用生物质生产替代能源
的认识提高到一个新的高度。
天然生物质结构复杂，难于分解 [2]。 然而，自然
界中存在大量可以分解木质纤维素的微生物，包括
细菌、真菌和放线菌，主要是由来自土壤和动物消
化道的微生物菌群来组成 [3，4]，这些微生物与不具备
纤维素分解能力的微生物围绕木质纤维素的生物
降解构成一个复合的菌群，组成一个互利互惠的小
生境 [3，5~7]。 这种生境中的微生物类群随季节、地理
位置、植被、土质等的差异而不同，天然木质纤维材
料在不同生境中被微生物群落广泛利用，形成了多
元化的木质纤维素利用策略。通过研究微生物菌群
以及木质纤维素的利用速率和程度来理解有限养
分环境中木质纤维素利用是一条不错的途径。
福州森林红壤细菌的菌群结构及其功能分析
黄钦耿 田宝玉 江贤章 柯崇榕 徐燕 杨欣伟 黄建忠
（福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福州 350108）
摘 要： 福建地区是我国的第二大林区，土壤类型主要表现为红壤。对福州地区森林中因木材腐朽而形成的树洞
中的土壤样品进行筛选，构建了一份具有强木质纤维素降解能力的酸性红壤的细菌 16S rRNA基因文库，利用限制性片
段长度多态性（RFLP）对随机克隆进行筛选；对该生态环境下的细菌菌群进行了系统发育分析。结果表明土壤 pH 偏酸性
严重影响了细菌类群的多样性，酸杆菌门 Acidobacteria（71.5%）和变形菌门 Proteobacteria（24.1%）是该酸性土样中的优势
菌群，其中酸杆菌门在该生态系统中占有绝对优势。变形菌菌群中的主要类群为光合细菌，固氮细菌和溶菌细菌。研究表
明，在木质纤维素自然降解的过程中，存在于酸性树洞土壤中的细菌参与了碳素和氮素的固定与循环，并对其微生态的
稳定起到重要作用。
关键词： 木质纤维素分解 红壤生态系统 RFLP分析 细菌菌群结构 生态功能
Community Construction and Function of Soil Bacteria in A
Forest Decomposed-hollow Stump Environment
Huang Qingeng Tian Baoyu Jiang Xianzhang Ke Chongrong
Xu Yan Yang Xinwei Huang Jianzhong
（Enginedring Research Center of Industrial Microbiology，Ministry of Aducation，Fujian Normal University，Fuzhou 350108）
Abstract： In this study，bacterial community of an acid soil in hollow stump ecosystem from native forest at
Fuzhou was characterized by constructing and analyzing rRNA gene clone library. The clone library was screened by
restriction fragment length polymorphism（RFLP），and representative rRNA gene sequences were determined. Phylogenetic
sequence analyses revealed the soil pH have a significant effects on diversity of putative bacterial community. Members of
these bacteria mainly included Acidobacteria（71.5%） and Proteobacteria（24.1%）. Most proteobacterial clones belong to
members of Rhizobium，photosynthetic and bacteriolytic bacteria. This study indicated bacterial community of this acid
soil ecosystem played an important role in C，N cycles and maintaining integrity of the ecosystem.
Key words： Lignocellulolysis Red soil ecosystem RFLP analysis Bacterial community Function analysis
2009年第 3期
以酸性红壤为主体的福建地区是我国的第二
大林区，其土壤微生物在木质纤维素的自然分解过
程中的作用尚未进行系统的研究。本研究从福州森
林腐朽的树木洞穴红壤生境出发，利用分子生物学
方法与技术，分析细菌菌群结构以及各菌群的生态
功能，了解细菌菌群在利用木质纤维素过程中的作
用，从而为进一步利用遗传工程，代谢工程和组合
的方法，发展有效的商业化木质纤维素的加工技术
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 样品采集与处理
采样点位于福建福州长安山森林公园 （海拔
600~1 000 m， 纬度 25°15~26°29， 经度 118°08~
120°31，全年平均气温 19.6°C，平均降水量 1 342.5
mm，平均湿度 77%，气候为亚热带海洋气候）；土壤
类型为红壤，土壤 pH 值为 4.0，含水量 47%。 采集
样品置于采样袋中， 并于 4℃保存， 在一个月内处
理分析。
1.2 主要菌株、试剂和培养基
感受态 Escherichia coli DH-5α，pMD 18-T 载体
以及限制性内切酶 HhaI 和 MspI、rTaq 聚合酶均购
自于 TaKaRa，氨苄青霉素购自于 Sigma，引物由上
海生工合成。 培养基配置参照分子克隆实验指南。
1.3 方法
1.3.1 土壤 DNA 的提取 取出 1 g 土样用土壤 DNA
提取试剂盒 （12800-50，Mo Bio Laboratories，Inc.，
USA） 按厂家的操作说明书进行土壤总 DNA 的提
取和纯化。
1.3.2 细菌 16S rRNA 基因的扩增及产物纯化 细
菌 16S rRNA 基因的 PCR 扩增采用通用引物 [8]：
1492r（5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）和 27f
（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）。 PCR 扩增
体系 ：10×Taq Buffer （2.5 mM）5 μl，dNTP Mix （2.5
mM）4 μl，正向引物（10 pmol/μl）1 μl，反向引物（10
pmol/μl）1 μl，DNA 模板 1 μl，r Taq（5 U/μl）0.2 μl，
ddH20 50 μl。 PCR 反应条件 ：95℃预变性 5 min，
94℃ 30 s，59℃ 40 s，72℃ 2 min，30 个循环；72℃ 10
min，4℃保存。
扩增得到的细菌混合 16S rRNA 基因经 1%的
琼脂糖凝胶电泳后， 用琼脂糖凝胶 DNA 纯化试剂
盒 （DV805A，Takara，Japan），按照厂家说明书的方
法进行的纯化。
1.3.3 16S rRNA基因文库的构建 纯化的 16S rRNA
基因通过 TA 克隆技术连接 pMD18-T 载体，转化感
受态的 Escherichia coli DH-5α， 蓝白斑筛选阳性克
隆子。 随机挑出平板上的白色菌落 380 个，划线接
种至新的含 Amp 的 LB 平板进行扩增，37℃， 倒置
培养过夜。 文库短期保存可以平板形式，长期保存
可以接种入 100 μl Amp+ LB 培养基 ，37℃ ，150 r/
min 振荡培养过夜 ，加入甘油至终浓度 20%，混匀
后于-70℃保存。
1.3.4 16S rRNA 基因文库的 RFLP 分析 采用载
体引物 M13RV-P（5′ -GGAAA CAGCT ATGAC CAT-
GA TTAC-3′）和 M13-20（5′-CGACG TTGTA AAACG
ACGGC CAGT-3′）进行菌落 PCR，扩增体系及条件
同前。
扩增产物经 HhaI 和 MspI 分别进行酶切，酶切
反应体系参照厂家说明书。 消化产物经 3%琼脂糖
凝胶电泳后，分析酶切谱型，将具有不同谱型的克
隆进行测序。 测序送交上海生工完成，测序结果为
自 1492r 一端起至少 750 bp 的 DNA 序列。
1.3.5 16S rRNA 基因数据的分析处理和系统发育
树图的构建 序列测出后经人工校对并在 RDP 进
行嵌合序列 （chimera sequence）的鉴定并除去嵌合
序列 [9]。 非嵌合的序列通过 Bioedit 软件进行 Local
Blast[10]相似性比较，将相似性为 97%的序列作为同
一序列型序列（phelotype），每一序列型序列只取一
序列为代表。 然后将序列型序列在 RDP 库中下载相
似序列， 依靠软件 ClustalX 1.83 进行多序列比对 [11]，
亲缘距离的计算和系统发育树的构建分别采用
MEGA（version 4.0）软件包 [12]中的 Kimura Two-para-
meter 矩阵模型 [13]和 Neighbor-joining 法 [14]，设自展
值为 1 000 次。 得到的非嵌合 16S rRNA 基因序列
全部已提交到 GenBank 核酸数据库 ， 登录号为
EU637647~EU637773。
2 结果与分析
2.1 土壤 DNA 的提取
利用土壤 DNA 提取试剂盒高效提取出土壤
DNA， 与 Marker 对比可知， 其纯度和浓度都较高
（图 1）。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
2.2 细菌 16S rRNA 基因的扩增及产物纯化
土壤 DNA 为模板，1492r 和 27f 为引物扩增 16S
rRNA 基因 ， 得到约 1.5 kb 的 DNA 片段 。 纯化的
DNA 片段和 Marker 对比，其纯度浓度较高（图 2）。
2.3 16S rRNA 基因文库的 RFLP 筛选
随机挑取 380 个阳性克隆（白斑），以载体引物
M13RV-P 和 M13-20 进行菌落 PCR，得到了插入片
段约 1.5 kb 的 16S rRNA 基因序列（图 3）。
酶切产物经 3%琼脂糖凝胶电泳后得到分离 ，
呈现多态性，产生 112 种不同的 RFLP 带型（图 4）。
2.4 16S rRNA 基因数据的分析处理和系统发育
树的构建
M.λ-HindⅢ DNA Marker
图 1 土壤 SD-1 总 DNA 的提取
M.DL2000 DNA Marker
图 2 SD-1 细菌 16S rRNA 基因扩增
M：DL2000 DNA Marker
图 3 阳性克隆 16S rRNA 基因的扩增
M.100 bp DNA Marker
图 4 16S rRNA 基因插入片段的 HhaI 酶切图谱 (部分 )
图 5 细菌的 16S rRNA 基因系统进化分析
（与酸杆菌门的亲缘关系）
1 000
2 000
M
bp
100
500
1 000
1 500
M
bp
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将这 112 条序列进行 Local Blastn，其中相似性
为 97%的序列作为一序列型序列 [15]，得到 66 条序
列型序列。 在 GenBank 和 RDP 数据库中下载最相
识序列，构建系统发育树（图 5、图 6）。
从细菌 16S rRNA 基因文库中得到的 66 条序
列型序列主要代表了 3 大类群，71.5% Acidobacter-
ia；24.1% Proteobacteria 和 0.9%的 Verrucomicrobia
类群；另外还有一个未知分类的细菌 （16S2~23），3
个完全未知的 16S rRNA 基因克隆 （结果未显示）。
Acidobacteria 是此腐朽树洞生境中的优势细菌类
群， 占细菌总数的 71.5%， 包含了 Gp1，Gp2，Gp3，
Gp10 以及 Gp13 等 5 个簇。 Acidobacteria 在此环境
中的绝对优势地位说明它们是这个酸性腐朽洞穴
生境生态循环的重要组成。
酸杆菌门（Acidobacteria）是新近被分出的一门
细菌，属于嗜酸菌，已有的研究表明在自然界的各
种环境中都广泛存在 [16，17]，在生态系统中具有重要
作用。 比如土壤中。 Barns 等通过对 43 种环境样品
的调查实验得出，酸杆菌门具有着丰富的遗传多样
性和代谢多样性，而且对生态的稳定性有着很大的
贡献。 但是，由于只有很少的 Acidobacteria 细菌可
以培养传代，所以目前人们仍不确切的知道这些细
菌所具有的生态学功能和它们对环境（包括对腐朽
洞穴生境）的影响。 一些仅有的利用非培养方法对
这个门的细菌所进行的研究认为，这些细菌对许多
生态系统来说有着巨大的重要性 [18~20]。 酸性洞穴生
境中的 Acidobacteria 所占比例达到 71.5%， 明显超
出了其它土壤环境的 Acidobacteria 的比例 [21]，体现
了 Acidobacteria 在酸性腐朽洞穴生态的重要性。
Proteobacteria 是这个强降解木质纤维素土壤中
的第二大类群，占 24.1%，包含了 alpha，beta，delta 和
gamma 4 亚门。 其中 alphaproteobacteria 大多为光合
细菌和固氮细菌，例如 16s1~17 和 16s1~52（Rhodo-
spirillaceae bacterium）；16s1~35，16s2~15 以及 16s3~
2（Rhodoplanes sp.）；16s3~8（Hyphomicrobiaceae bac-
terium）；16s1~19 （Rhizobium）；16s3~26 （Bradyrhizob-
ium）等 [22~24]。 这些细菌为这个相对独立的生态系统
的提供部分的氮素和能量来源。 Beltaprot-eobacteria
包含了两种类型，一种 Burkholderia（16s-3-14，16s3-
20），一种为未知细菌（16s1-14）。 Gammaproteobacte-
ria 主要由 Enterobacter，Dokdonella 以及未知细菌克
隆等 6 类种系型组成。 Deltaproteobacteria 主要包括
像 Myxococcus fulvus 和 Bdellovibrio bacteriovorus 等
一些具有溶菌能力的细菌，这些细菌既能作用其它
细菌也能作用真菌细胞 [25，26]。 这在一定程度上昭示
着细菌与细菌之间、 细菌与真菌之间的相互作用，
以及系统稳定性的维持，同时也为系统提供了另一
个有机氮来源。
3 讨论
原始森林中，一些树木倒掉后留下的树桩在土
壤化学和物理环境因素以及微生物的作用下会形
成中空的的腐朽洞穴 [4，27]。 腐朽洞穴除了偶尔的落
叶飘进，其内部环境形成一个相对稳定和独立的生
态系统，在这个生态系统中，物质和能量循环保持
图 6 细菌的 16S rRNA 系统进化分析（与变形菌门 /
疣微菌门等的亲缘关系）
* Halococcus sp. ( X00662)为外类群
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相对的独立和完整，使之成为一个很好的研究生态
系统结构，循环以及功能的位点。 在这个生态系统
中，除了偶尔飘入的落叶外 ，很少有其他的碳源和
能量的输入，分解利用树木留下的树桩及根部是这
个系统主要的碳及能量来源。 因此，这些树洞生态
系统是研究自然环境中微生物利用木质纤维素的
理想对象，其生态特性在一定程度上决定了其微生
物菌群功能特性。
土壤中存在中各种细菌生理群，包括纤维分解
细菌，固氮细菌、氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌
等，在土壤元素循环中起着主要作用。 例如在这个
生态系统中有很大一部分是为系统提供氮素来源
的固氮细菌和具有溶菌能力的细菌。细菌活动强度
受土壤养分、水分、温度、酸度和通气等理化因素的
影响，从而形成不同系统中的不同细菌菌群组成和
结构 。 本研究中的树洞洞穴中的土壤呈酸性 （pH
4.0），这在很大程度上决定了该系统中独特的细菌
的种类和结构，生境中的 Acidobacteria 所占比例达
到 71.5%，明显超出了其它土壤环境的 Acidobacter-
ia 的比例 [21]，而且偏酸性的环境也直接影响了系统
中的功能微生物类群，例如通常纤维分解细菌适宜
中性至微碱性环境，所以在酸性土壤中纤维素分解
菌活性明显减弱。
利用分子生物学的方法研究福州腐朽洞穴森
林红壤细菌多样性，能真实充分地反映细菌类群在
腐朽洞穴土壤中的组成和结构，所提供基础的信息
有助于酸性腐朽洞穴森林土壤中的细菌功能以及
细菌菌群与真菌菌群之间相互作用等进行进一步
的研究。
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