全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
稳定高表达人 ERP57基因 A549细胞株的建立
及其对 CRT表达的影响
杨建林 韩钰 王艳林 张伟
(三峡大学分子生物学研究所, 宜昌 443002)
摘 要: 建立稳定高表达人 ERP57蛋白的 A549细胞株,并观察对 CRT表达的影响。采用巢式 RTPCR从人非小细胞
肺腺癌 A549细胞总 RNA中克隆人 ERP57 cDNA,构建 ERP57真核表达质粒 ( pcDNA3. 1( + ) / ERP57)脂质体转染 A549细
胞。经 G418筛选,获得高表达人 ERP57蛋白的 A549细胞株。通过W estern b lo tting检测细胞中 ERP57及 CRT蛋白表达情
况。成功获得稳定高表达 ERP57蛋白的人 A549细胞株, CRT表达量无明显改变。成功获得稳定高表达 ERP57蛋白的人
A549细胞株,证实细胞中高表达 ERP57对 CRT表达量无明显影响。
关键词: ERP57 钙网蛋白 ( CRT ) 真核表达 A549细胞
Cloning and Eukaryotic Expression ofHuman Recombinant ERP57
Yang Jianlin H an Yu W ang Yanlin ZhangW ei
( Institute of M olecularB io logy,M edical Co llege, Three Gorges University, Yichang 443002)
Abstrac:t The research w as to c lone, express and purify hum an recomb inant ERP57. H um an ERP57 cDNA was amp lified from to
ta lRNA of hum an lung cancer ce ll line A549 cells by RTPCR. Then, PCR product was sub c loned in to eukaryo tic expression vec to r
pcDNA3. 1( + ). The vector w as then transfected in to A549 ce lls by using liposom e and the s ing le clones w ere selected w ith G418. The
ce ll line tha t is successfu l in transfection and secretory expression of ERP57 w ere identified by W estern B lo tting assay. Eukaryo tic ex
pression plasm id o f ERP57 was constructed successfu lly. A fter transfec ted into A549 ce lls, ERP57 cou ld be expressed.
Key words: ERP57 Calreticu lin( CRT ) Eukaryotic expression A549 ce ll
收稿日期: 20100612
基金项目:国家自然科学基金 ( 30973445 ),校级青年科学基金 (K J2008A039)
作者简介:杨建林,女,硕士,讲师,研究方向:抗肿瘤免疫等; Em ai:l mm gbb2002@ 12. com
ERP57蛋白属于内质网上的伴侣分子, 为蛋白
质二硫化物异构酶 ( PDI)成员之一, 是由两个无催
化作用的结构域连接两个分别位于氨基和羧基端具
有二硫氧还原蛋白催化作用的功能域组成的蛋白
质,主要与钙网蛋白 ( ca lret iculin, CRT)紧密结合存
在于细胞内质网腔中。其生物学功能包括催化细胞
内糖蛋白的二硫化物氧化、异构化,同时是主要组织
相容性复合物 ( MHC )的肽运载复合体的重要组
分 [ 1, 2]。在新近抗肿瘤研究中发现, ERP57蛋白与
CRT介导的抗肿瘤免疫关系密切, 凋亡细胞胞内的
CRT移位至细胞膜表面决定着 CRT介导的凋亡细
胞清除和特异性抗肿瘤免疫效应 [ 3, 4 ] , 而 CRT的这
种移位与 ERP57蛋白存在与否有直接的联系。本
试验旨在利用基因重组与质粒转染稳定筛选细胞株
技术,建立高表达 ERP57蛋白的 A549细胞株,观察
稳定高表达细胞株中 CRT表达量的变化, 为进一步
研究 ERP57与 CRT介导的抗肿瘤免疫相关性研究
奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
人非小细胞肺腺癌 A549细胞株、菌株 E. coli
DH5、质粒 pcDNA 3. 1( + )为本研究所保存。TR
Izo l总 RNA纯化试剂 ( Invitrogen公司 ) ;限制性核酸
内切酶、T4 DNA连接酶、dNTP、RTPCR及 PCR试剂
盒 ( Fermentas公司 ) ; DNA回收试剂盒 ( Om ega公
司 ) ; L ipofectam ineTM 2000( Inv itrogen公司 ); 兔抗人
2010年第 10期 杨建林等:稳定高表达人 ERP57基因 A549细胞株的建立及其对 CRT表达的影响
CRT抗体、兔抗人 ERP57抗体和兔抗人 Action抗
体 ( Santa Cruz生物工程公司 ), 羊抗兔 IgGHRP(北
京中杉金桥公司 ) , 预染蓝色中分子量蛋白 Marker
( fermentas公司 ) ; G418等其它化学试剂均购自 S ig
ma公司。PCR引物合成及 DNA测序由上海生工公
司完成。
1. 2 pcDNA3. 1( + ) / ERP57真核表达载体的构建
以 TR Izo l试剂法提取 A549细胞总 RNA。以此
总 RNA为模板, O ligo ( dT)为引物, 经逆转录酶 M
MLV催化将 mRNA反转录为 cDNA第一链。首先
用外侧人 ERP57 PCR引物从 cDNA第一链中扩增
包含人 ERP57 cDNA序列的 1 700 bp左右序列。随
后,以上述 PCR产物为模板, 利用内侧特异性人
ERP57引物 ( 5 端分别引入限制性内切酶 H ind III
和 Xho I酶切位点 )扩增人 ERP57 cDNA序列。外
侧上游引物: 5 TATACCTTCCGGCCGTCC3 , 外侧
下游引物: 5 TACAAAGTGGTGTTTGGC3 , 内测上
游 引 物: 5 ATATAAGCTTATGCGCCTCCGCCGC
CTAGC3 , 内测下游引物: 5 GGATCTCGAGGCTT
TAGAGATCCTCCTGTGCC3 ,以限制性内切酶 H in d
III和 Xho I消化 PCR产物, DNA纯化试剂盒回收目
的片段, 然后将此 DNA片段插入经相同酶消化、回
收的真核表达载体 pcDNA3. 1( + )。连接产物转化
E. coli DH5后涂布氨苄青霉素琼脂平板 37! 过夜
培养, 次日挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素
( 50mg /L )的 LB培养基振荡过夜培养, 提取细菌中
的质粒经双酶切鉴定后, 送上海生工公司测序。成
功构建真核表达载体 pcDNA 3. 1( + ) /ERP57。
1. 3 pcDNA3. 1 ( + ) / ERP57质粒转染、筛选及
W estern b lo tting法鉴定
将对数生长期 A549细胞以 1 ∀ 108 /L接种
100mm细胞培养板, 37! 培养过夜后, 用脂质体转染
pcDNA3. 1( + ) / ERP57和空载体 pcDNA3. 1( + ) ,转
染 24 h后使用含有 G418( 200 g /mL)的 1640培养
基筛选培养, 3周后,挑选耐受 G418生长的单克隆细
胞,将其依次转移至 24孔、12孔、6孔细胞培养板中
继续培养。对 6孔板中长满的细胞中每孔加入
300 L细胞裂解液,收集细胞冰上放置 30 m in, 4! 高
速离心后保留上清,考马斯亮蓝法检测上清中的总蛋
白浓度。加入上样缓冲液沸水中水浴 5m in使得蛋
白变性, 100V电压下 12% SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直
电泳分离蛋白,常规电转法将蛋白转移到 PVDF膜上
( 60 V, 60m in)。电转后的 PVDF膜首先用 50 g /L脱
脂奶粉 TBST液封闭非特异蛋白结合位点 (室温, 2
h),接下来用兔抗人 ERP57抗体 ( 1#1 000)结合目的
蛋白 (室温, 2 h); TBST缓冲液洗涤 3次后,加入辣根
过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG抗体 (室温, 45 m in),
再次用 TBST缓冲液洗涤 3次后, 使用 ECL法 (增强
化学发光法 )显色。
1. 4 Western b lo tt ing法检测高表达 ERP57蛋白细胞
株的 CRT蛋白表达状况
同方法 1. 3, 使用兔抗人 CRT抗体 ( 1#1 000)
检测。
2 结果与分析
2. 1 pcDNA3. 1 ( + ) / ERP57真核表达载体的构
建、鉴定
以 A549细胞总 RNA为模板,通过巢式 PCR进
行 ERP57扩增, 所得约 1. 5 kb大小的特异性 PCR
产物 (图 1A )。重组质粒 pcDNA3. 1 ( + ) /ERP57
经 H ind III和 Xho I双酶切鉴定证实有 1. 5 kb
ERP57片段和 5. 35 kb pcDNA3. 1( + )载体两条特
异性条带 (图 1B)。对质粒中的插入片段进行 DNA
测序分析,结果与 ERP57编码区序列完全一致。
A: 1. ERP57片段扩增产物; 2. M arker; B: 1. M ark er; 2, 3.
重组质粒 pcDNA3. 1( + ) /ERP57H ind III+ Xho I双酶
切产物
图 1 重组质粒 pcDNA3. 1( + )ERP57构建
(A )及酶切 ( B)鉴定
2. 2 W estern blotting法鉴定高表达人 ERP57的
A549细胞株
以兔抗人 ERP57特异性抗体进行 Western b lo t
ting鉴定,结果 (图 2)显示筛选出的转染 pcDNA 3. 1
( + ) / ERP57 A549高表达细胞株,其全细胞裂解液
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
中 ERP57蛋白含量显著高于对照组 A549细胞和转
染空载体 pcDNA3. 1( + ) A549细胞。证实获得了
稳定高表达人 ERP57蛋白的 A549肺癌细胞株。
2. 3 W estern blotting法鉴定 A549 / pcDNA3. 1
( + ) / ERP57细胞株 CRT表达
以兔抗人 CRT多克隆抗体进行蛋白表达量检
测, 发现蛋白总量相等的全细胞裂解液中, 转染
pcDNA3. 1( + ) / ERP57 A549细胞株、转染空载体
pcDNA3. 1( + ) A549细胞株以及对照组 A549细胞
株的 CRT蛋白表达量无明显变化 (图 2)。
1. A549细胞; 2.转染空载体 pcDNA3. 1( + ) A549
细胞; 3.转染 pcDNA3. 1 ( + ) / ERP57A549细胞
图 2 W estern blotting分析细胞中蛋白表达
3 讨论
鉴于 ERP57蛋白与 CRT介导的特异性抗肿瘤
免疫机制密切相关 [ 5] ,为了更进一步研究 ERP57蛋
白与 CRT的关联性, 本研究采用基因重组技术, 成
功获得了在人小细胞肺癌 A549细胞株中稳定高表
达 ERP57蛋白的细胞株。从 A549中克隆获得了全
长为 1 518 bp的 ERP57基因,其 DNA序列与
在 GenBank中注册的 ERP57序列 ( ID: NM 005313)
相同。构建 ERP57真核表达质粒 ( pcDNA3. 1( + ) /
ERP57)经过脂质体转染、G418筛选,获得高表达人
ERP57蛋白的 A549单克隆细胞株。经 Western
b lo tt ing鉴定, 分子量为 61 kD的 ERP57蛋白在高表
达细胞株中表达量显著高于对照细胞, 同时发现
CRT蛋白的量并不随 ERP57表达的升高而发生改
变。本研究通过基因重组技术成功构建了重组人
ERP57的真核表达载体,并获得稳定高表达 ERP57
的 A549细胞株, 它将为进一步深入研究 ERP57蛋
白与 CRT的相互关系及作用机制奠定基础。
参 考 文 献
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