全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
BM P2诱导 C3H10细胞成骨分化的
TGF2βⅠ型受体的体外分析
张燕　翁亚光　文巍　冯涛　罗进勇
(重庆医科大学检验医学教育部重点实验室 重庆市重点实验室 ,重庆 400016)
　　摘 　要 : 　筛选和分析与 BMP2诱导间充质干细胞 C3H10成骨分化有关的 TGF2βⅠ型受体。利用显性负性突变型 TGF2β
Ⅰ型受体竞争抑制配体功能的特性 ,运用碱性磷酸酶定量测定、Real time PCR等方法 ,初步筛选出可能与 BMP2诱导间充质干
细胞 C3H10成骨分化有关的的 TGF2βⅠ型受体 ,随后运用 RNA干扰的方法抑制相应 TGF2βⅠ型受体的表达 ,进一步证实相关
TGF2βⅠ型受体与 BMP2发挥诱导成骨活性的关系。结果证实 ,显性负性突变的 ALK3和 ALK6能够抑制 BMP2诱导的 C3H10
细胞成骨分化 ; RNA干扰抑制 ALK3或 (和 ) ALK6表达后 , BMP2诱导 C3H10细胞向成骨分化的趋势受到抑制。因此 , ALK3
和 ALK6是与 BMP2诱导 C3H10细胞成骨分化有关的 TGF2βⅠ型受体。
关键词 : 　骨形态发生蛋白 　TGF2β受体 　间充质干细胞 　信号转导 　RNA干扰
Analyses of TypeⅠTGF2βReceptors in BM P2 Induced O steogen ic
D ifferentia tion of C3H10 Cell in V itro
Zhang Yan　W eng Yaguang　W en W ei　Feng Tao　Luo J inyong
( Key Laboratory of M edical D iagnostics, M inistry of Education, Chongqing M edical University, Chongqing 400016)
　　Abs trac t: 　 It was to analysis the typeⅠ TGF2β recep tors in BMP2 induced osteogenic differentiation. The typeⅠ TGF2β recep2
tors involved in BMP2 induced osteogenic differentiation of C3H10 cell was identified by using ALP quantitative assay and Real time
PCR. The exp ression of BMP2 related typeⅠ TGF2β recep tors was knock down by RNA interference, to confirm the relationship be2
tween osteogenic activity of BMP2 and typeⅠ TGF2β recep tors. Results showed that dom inant negative form s of ALK3 and ALK6 can
inhibit BMP2 induced osteogenic differentiation of C3H10 cell, and ALK3 /ALK6 knock2down by RNA i can inhibit BMP2 induced os2
teogenic differentiation of C3H10 cell. It can p rove that ALK3 and ALK6 are the typeⅠ TGF2β recep tors that can involve in BMP2 in2
duced osteogenic differentiation of C3H10 cell.
Key wo rds: 　Bone morphogenetic p roteins　TGF2β recep tor　Meshenchymal stem cells　Signal transudation　RNA interference
收稿日期 : 2009201212
基金项目 :国家自然科学基金 (30800658)
作者简介 :张燕 (19822) ,博士生 ,研究方向 : BMPs诱导骨形成的分子机制
通讯作者 :罗进勇 ,讲师 , Tel: (023) 68485239, E2mail: luojinyong@ sina. com　　骨形态发生蛋白 ( bone morphogenetic p roteins ,BMPs)是属于转化生长因子 β ( transform ing growthfactor2β, TGF2β)超家族的成员之一 ,因其能促进成骨细胞、成软骨细胞的分化和诱导异位骨形成而得名。BMPs通过 TGF2β受体 2Smad信号途径发挥功能 ,其中 TGF2βⅠ型受体直接结合并磷酸化 Smad,是信号转导和功能发挥的决定因素 ,因此与 BMPs诱导成骨的活性息息相关。 目前已知有 7种 TGF2βⅠ型受体 (命名为 ALK～ALK7) ,它们在结构上都包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域 ,其中胞内结构域具有丝氨酸 /苏氨酸激酶活性 ,是促发信号转导的重要结构域。如果 TGF2βⅠ型受体丢失了胞内结构域而丢失激酶活性 ,虽可与配体结合 ,但不能触发信号转导 ,这类受体称为显性负性突变型 TGF2β型 Ⅰ型受体 ( dom i2nant negative recep tor, dn2recep tor) ,它们可以与野生
2009年第 7期 　　　　张燕等 : BMP2诱导 C3H10细胞成骨分化的 TGF2βⅠ型受体的体外分析
型受体竞争相应配体 ,从而起到抑制 TGF2β信号通
路的作用。因此 ,能抑制特定配体功能发挥的显性
负性突变型 TGF2β受体 ,其对应的野生型受体则可
以结合配体并激活信号通路。
BMP2是骨形态发生蛋白家族中的一种重要成
员 ,已经在临床中用于改善骨折术后愈合、促进脊柱
融合等多个方面 [ 1, 2 ]。本研究利用显性负性突变型
TGF2βⅠ型受体腺病毒体外筛选与 BMP2诱导间充
质干细胞 C3H10成骨分化成的 TGF2βⅠ型受体 ,用
RNA干扰的方法抑制相应 TGF2βⅠ型受体表达 ,观
察受体表达受抑制后 ,对 BMP2诱导 C3H10成骨分
化的影响。
1　材料和方法
111　材料
显性负性突变型 TGF2βⅠ型受体腺病毒体
( dnALK～dnALK7)由本实验室构建和制备 ; BMP2
腺病毒、质粒 pSES2HUS、鼠间充质干细胞株 C3H10
由美国芝加哥大学医学中心何通川教授惠赠 ; 293
细胞株、大肠杆菌 BJAdeasy (已转化腺病毒骨架质
粒 pAdeasy1的大肠杆菌 BJ5183)由本实验室保存。
各种限制性内切酶、T4 连接酶、RNA提取试剂
Trizo l、常规 PCR试剂盒、Real time PCR试剂盒购
自 TaKaRa公司 ; M 2MLV逆转录酶购自 Promega公
司 ; PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成 ;碱性磷酸酶 (ALP)定量检测试剂盒购
自 BD 公司 ; 其余试剂均为国产或进口分装分
析纯。
112　方法
11211　显性负性突变型 TGF2βⅠ型受体腺病毒对
C3H10细胞的感染及在 C3H10细胞内的表达 　将
实验室制备的高滴度显性负性突变型 TGF2βⅠ型受
体腺病毒 (命名为 dnALK1～dnAL2K7)感染 C3H10
细胞。在病毒感染 24 h后 ,首先利用荧光显微镜观
察细胞内红色荧光蛋白 RFP的表达情况。随后 ,提
取 C3H10细胞 RNA ,经逆转录反应制备 cDNA, PCR
扩增检测显性负性突变型 TGF2βⅠ型受体在细胞内
的表达情况 ,扩增用上游引物选用 TGF2βⅠ型受体
5′端特异性引物 ,下游引物选用腺病毒上 SV40
polyA的特异性引物 ,以排除内源性受体的干扰。
同时 ,以不加逆转录酶的逆转录反应产物作为对照 ,
排除 RNA提取过程中的 DNA污染和试剂污染。
11212　体外筛选与 BMP2诱导 C3H10细胞成骨分
化有关的 TGF2βⅠ型受体 　显性负性突变型 TGF2β
Ⅰ型受体腺病毒 (命名为 dnALK1～dnALK7)和 BM
P2腺病毒共同感染 C3H10细胞 ,在病毒共同感染
后 5 d和 7 d进行细胞 ALP定量检测 (操作按 ALP
定量试剂盒说明书进行 ) ,比较和分析 ALP活性的
变化情况。
将能抑制 BMP2诱导的 ALP活性的显性负性突
变型 TGF2βⅠ型受体腺病毒感染 C3H10细胞 ,在感染
后 12 d提取 C3H10细胞 RNA,经逆转录反应制备
cDNA, Real time PCR检测细胞骨桥素 (osteopontin,
OPN)和骨钙素 (osteocalcin, OC)的表达 ,采用 GAP2
DH作为内参照。骨桥素和骨钙素的表达根据标准曲
线得出 mRNA的分子拷贝 ,用 GAPDH的拷贝数作为
校正基数 ,即目的基因 mRNA相对表达量 =目的基因
拷贝数 /GAPDH拷贝数。ALP染色和 Real time PCR
实验均以空载腺病毒 RFP (仅带有红色荧光蛋白标
记 )作为对照。数据用 €x ±s表示 ,组间比较采用单因
素方差分析 ,两组间比较采用 q检验 ,统计学数据均
用 SAS8. 2软件包处理。
11213　RNA i腺病毒的制备 　在 Dharmacon公司网
页 ( http: / /www. dharmacon. com / sidisIgn / )上设计
出相应的小分子干扰 RNA ( small interfere RNA,
siRNA) ,克隆到质粒 pSES2HUS的 S fi I位点 , PCR
和测序筛选阳性克隆 ,在大肠杆菌 BJAdeasy内进行
同源重组 ,随后在 293细胞中包装和制备腺病毒。
制备出的 RNA i腺病毒用于感染 C3H10细胞 ,在感
染后 24 h后 ,提取 C3H10细胞 RNA,经逆转录反应
制备 cDNA, Real time PCR检测相应受体表达情况 ,
以确定 RNA i的有效性。组间比较采用单因素方差
分析 ,两组间比较采用 q检验 ,所有统计学数据均用
SAS8. 2软件包处理。
11214　TGF2βⅠ型受体表达变化对 C3H10细胞成
骨指标 ALP的影响 　RNA i腺病毒和 BMP2腺病毒
共同感染 C3H10细胞 ,在共同感染后 5 d和 7 d进
行细胞 ALP定量检测 (操作按 ALP定量试剂盒说明
书进行 ) ,比较 ALP活性的变化情况。组间比较采
用单因素方差分析 ,两组间比较采用 q检验 ,所有统
计学数据均用 SAS8. 2软件包处理。
741
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
2　结果与分析
211　显性负性突变型 TGF2βⅠ型受体腺病毒感染
C3H10细胞及其表达
病毒感染 24 h后 ,荧光显微镜观察发现 ,所有
显性负性突变型 TGF2βⅠ型受体腺病毒均能感染
C3H10细胞并在其中表达红色荧光 ; RT2PCR扩增
片段大小在 500～600 bp ,与预期相符。由于每组均
设不加逆转录酶的逆转录反应产物作为模板进行
PCR扩增 ,且结果均为阴性 ,表明没有 DNA和试剂
的污染 ,由此证实显性负性突变型 TGF2βⅠ型受体
腺病毒感染 C3H10细胞后 ,在细胞中表达相应的显
性负性突变型受体。
+. cDNA为模板的扩增结果 ; - . 不加逆转录酶的逆转录反应产物
为模板的扩增结果 ; 1. dnALK1; 2. dnALK2; 3. dnALK3; 4. dnALK4; 5.
dnALK5; 6. dnALK6; 7. dnALk7;M. 1 kb p lus ladder
图 1　RT2PCR证实显性负性突变型 TGF2β I
型受体在 C3H10中表达
212　BMP2诱导 C3H10成骨分化有关的 TGF2βⅠ
型受体
ALP定量发现 ,在显性负性突变型 TGF2βⅠ型
受体中 ,与对照组相比 , dnALK3和 dnALK6可以抑
制由 BMP2诱导的 ALP的表达 (图 2)。
1. dnALK; 2. dnALK2; 3. dnALK3; 4. dnALK4;
5. dnALK5; 6. dnALK6; 7. dnALK7; 8. RFP
图 2　dnAL K3和 dnAL K6抑制 BM P2诱导的
C3H10细胞 AL P的表达
dnALK3和 dnALK6腺病毒感染 C3H10细胞 12 h
后 , Real time PCR 结果发现与对照组 RFP相比 ,
dnALK3和 dnALK6可以 BMP2明显抑制骨桥素和
骨钙素的表达 (表 1, P < 0. 01)
表 1　dnAL K3和 dnAL K6抑制 C3H10细胞骨
桥素和骨钙素表达的影响
组别 骨桥素的相对表达 骨钙素的相对表达
dnALK3组 0. 48 ±0. 07 0. 24 ±0. 03
dnALK6组 0. 53 ±0. 04 0. 29 ±0. 02
RFP组 1. 62 ±0. 03 1. 25 ±0. 02
空白 C3H10细胞 0. 23 ±0. 03 0. 11 ±0. 02
由于碱性磷酸酶、骨桥素和骨钙素均是细胞成
骨分化的指标 ,以上结果显示 : dnALK3和 dnALK6
可以抑制 BMP2诱导 C3H10向成骨分化 ,结合显性
负性突变型受体与野生型受体竞争配体的特点 ,可
以推测 , 野生型 ALK3和 ALK6可能是与 BMP2诱
导 C3H10成骨分化有关的 TGF2βⅠ型受体。
213　RNA i腺病毒的制备
针对 ALK3的 siRNA (命名为 siALK3)序列 : 5′2
GAGGAATCGTGGAGGAATA23’,针对 ALK6的 siRNA
(命名为 siALK6)序列 ∶5’2GTTCAGAGAGACAGAAA2
TA23’。将 siALK3和 siALK6克隆到质粒 pSES2HUS
的 S fiⅠ位点 ,经测序检测发现结果正确 ,随后在 293
细胞包装制备相应的 RNA i腺病毒 , RNA i腺病毒感
染 C3H10细胞 24 h后 , Real time PCR检测发现 ,与
对照相比 , siALK3对于 ALK3表达的抑制率约为
55% , siALK6对 ALK6的抑制率约为 62% (图 3) ,
证明 siALK3和 siALK6可以抑制相应 C3H10细胞
内相应受体表达。
1. ALK3对照 ; 2. siALK3; 3. ALK6对照 ; 4. siALK6
图 3　siAL K3和 siAL K6抑制 AL K3和 AL K6表达
841
2009年第 7期 　　　　张燕等 : BMP2诱导 C3H10细胞成骨分化的 TGF2βⅠ型受体的体外分析
214　BMP2诱导的 C3H10细胞 ALP的表达
试验分为 4组 : BMP2 + siALK3,BMP2 + siALK6,
BMP2 + siALK3 + siALK6, RNA i空载腺病毒 +
BMP2 (对照组 )。5 d和 7 d定量检测 ALP活性 ,发
现单独抑制 ALK3或 ALK6以及同时抑制 ALK3和
ALK6表达的情况下 ,由 BMP2诱导的 ALP活性明
显降低 ,其中同时抑制 ALK3和 ALK6表达的情况
下由 BMP2诱导的 ALP活性降低得最低 (图 4)。此
结果进一步证实 , ALK3和 ALK6是与 BMP2诱导
C3H10细胞成骨分化有关的 TGF2βⅠ型受体 ,在抑
制 ALK3和 ALK6表达的情况下 , BMP2诱导 C3H10
细胞成骨分化的能力减弱。
11对照组 ; 21BMP2 + siALK3; 31BMP + siALK6;
41BMP2 + siALK3 + siALK6
图 4　siAL K3和 siAL K6抑制 BM P2诱导的
C3H10细胞 AL P的表达
3　讨论
BMPs是具有多种生物学功能 (包括诱导成骨 )
的形态原 ,属于转化生长因子β ( TGF2β)超家族的
成员之一 ,目前共分离和鉴定了 20 余种 BMPs,
BMPs最重要的功能就是促进骨形成。BMPs主要
是通过经典的 TGF2β/BMPs信号转导通路传递信
号 ,发挥诱导成骨的功能 [ 3 ]。在信号转导的过程
中 , TGF2βⅠ型受体起着承上启下的作用 ,是 BMPs
发挥诱导成骨活性的关键节点 [ 4, 5 ]。
间充质干细胞 (meshenchymal stem cells,MSCs)
是属于中胚层的一类多能干细胞 ,主要存在于结缔
组织和器官间质中 ,以骨髓组织中含量最为丰富。
间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜
能 ,在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨
细胞 ,还具有分化为肌细胞、肝细胞、软骨细胞、基质
细胞等多种细胞的能力 [ 6, 7 ] 。作为种子细胞 ,间充
质干细胞可以修复、重建受伤或发生病变的多种
组织器官 ,例如 ,在骨再生研究中就常使用间充质
干细胞作为种子细胞 [ 11, 12 ] 。BM P2具有较强的诱
导间充质干细胞成骨的作用 ,目前已经逐渐应用
于临床 [ 1, 2 ] ,鉴定分析与 BMP2诱导间充质干细胞
成骨有关的 TGF2βⅠ型受体 ,有助于阐述 BM P2诱
导间充质干细胞成骨的机制 ,为 BM P2的临床应用
提供理论基础。
本研究首先利用显性负性突变型 TGF2β I型
受体竞争抑制配体功能的特性 ,运用 ALP定量测
定、Real time PCR 等方法 ,初步筛选出 ALK3 和
ALK6可能是与 BM P2诱导间充质干细胞 C3H10
成骨分化有关的的 TGF2β I型受体 ,随后运用
RNA I的方法抑制 ALK3和 ALK6的表达 ,进一步
证实了 ALK3和 ALK6是与 BM P2发挥诱导成骨
活性关系密切的 TGF2β I型受体 ,在抑制 ALK3和
ALK6表达后 , BM P2的功能发挥也会受到抑制。
这为进一步从信号转导的源头阐述 BMP2诱导成
骨的机制 ,以及 BM P2在临床的应用奠定了重要
基础。
参 考 文 献
1　 Burkus JK, Sandhu HS, GornetMF, et al. J Bone Joint Surg Am,
2005, 87 (6) : 1205～1212.
2　 Khosla S, et al. J Clin Invest, 2008, 118 ( 2) : 421～428.
3　 Cao X, Chen D. Gene, 2005, 357 ( 1) : 1～8.
4　 Chen D, X. J iMA, et al. J Cell B iol, 1998, 142 (1) : 295～305.
5　 Zou H, W ieder R, Massague J, et al. Genes Dev, 1997, 11 ( 17) :
2191～2203.
6　 Deng ZL, et al. Frontiers in B ioscience, 2008, 13: 2001～21.
7　 Cap lan A I, B ruder SP. Trends in Mol Med, 2001, 7 ( 6 ) : 259
～264.
8　 He TC. Journal of Musculoskeletal Neuronal Interactions, 2005, 5
(4) : 363～366.
9　 Luo J, Sun MH, et al. Curr Gene Ther, 2005, 5 (13) : 167～179.
10　Luu HH, Song WX, Luo XJ, et al. Journal of O rthopaedic Re2
search, 2007, 25 (5) : 665～677.
11　Peng H, Huard J. Curr Op in Pharmacol, 2003, 3 (3) : 329～333.
941