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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
荧光定量 PCR技术在植物研究中的应用
马月萍1 戴思兰2 马艳蓉3
(1东北大学理学院，沈阳 110004;2北京林业大学园林学院，北京 100083;3宁夏大学农学院，银川 750021)
摘 要: 荧光定量 PCR技术是近年发展起来的一种用于基因定量分析的 PCR方法，自问世以来在基础科学研究、临床
诊断、疾病研究及药物研发等领域应用较为广泛。在植物研究方面应用起步较晚，现已开始用于植物基因表达分析、外源基
因基因鉴定等方面的研究。介绍了实时荧光定量 PCR技术的原理、优缺点和试验中潜在问题和条件的优化，并对其在植物研
究中的应用及前景作了探讨。
关键词: 实时荧光定量 PCR技术 植物 基因表达
Application of Technique of Quantitative Real-time
PCR in Research of Plants
Ma Yueping1 Dai Silan2 Ma Yanrong3
(1College of Sciences，Northeastern University，Shenyang 110004;2College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，
Beijing 100083;3College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021)
Abstract: Real-time PCR as a technique to quantity the nucleic acid is widely used in basic biological and medical research as
well as for diagnostics and monitoring of the disease processes． Quantitative real-time PCR is employed recently in plants，and it has
been used to analyze gene expression and heterosis principle in plants now． The principle of quantitative real-time PCR technique is de-
scribed in this paper． Its procedure，advantage，and defect are also described． Its present and future application was discussed on the re-
search of plants． The theory，operating procedures，features and optimizing the experimental conditions of the real-time fluorescent quan-
titative PCR(FQ-PCR)and its applications in biological fields were introduced in this paper．
Key words: Real-time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR) Plant Gene expression
收稿日期:2010-02-15
基金项目:国家自然科学基金项目(30800885，30871726)
作者简介:马月萍，女，博士，研究方向:分子生物学，植物育种和基因工程;E-mail:mypluna@ gmail． com
通讯作者:戴思兰，E-mail:silandai@ gmail． com
对目的基因进行特异而准确的定量分析是目前
分子生物学研究的热点之一。聚合酶链式反应
(polymerase chain reaction，PCR)为基因定量表达提
供了快速而灵敏的途径，但其只能通过凝胶电泳检
测扩增的终产物来进行分析，定量的准确性受到影
响。实时荧光定量 PCR 技术是在 PCR 基础上发展
起来的，将核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测等
技术融合在一起的一项创造性技术。自产生以来，
在医学、检疫、国防军事及农业等各个领域得到了广
泛应用。该技术带来了方法学上的重要突破，在植
物学研究中具有广阔的应用前景。
1 实时荧光定量 PCR技术概述
多年来，研究人员一直致力于用 PCR技术进行
核酸精确定量。Holland［1］首次运用不可延伸的寡
核苷酸杂交探针与模板结合，利用 DNA 聚合酶的
5→3核酸外切酶活性将探针切断，破坏探针的能
量传递结构而发出荧光来定量 PCR 产物。Higuchi
等［2，3］最早报道了实时定量 PCR 方法，他们在 PCR
反应管中加入 EB，通过连续照相动态观察荧光强度
的变化定量 PCR 产物的多少。Heid［4］和 Gibson
等［5］首先报道了 TaqMan PCR 的原理及方法。同
年，美国 ABI公司推出商用实时定量 PCR 仪，使得
荧光定量 PCR得以广泛应用。之后，人们又设计出
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分子信标等不同荧光探针［6 － 8］，其他方法也相继报
道［9 － 12］。目前，该技术已广泛用于基因的表达分
析、基因组中目的基因的拷贝数鉴定、核酸多态性分
析及基因突变分析等多个领域的研究。
1. 1 实时荧光定量 PCR技术的基本原理
实时定量 PCR 是指在反应体系中加入荧光基
团，利用荧光积累实时监测整个 PCR 进程，最后通
过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在扩
增过程中，产物的数量与检测到的荧光强度成线性
关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线
应为 J 型，符合 2n方程(其中 n 为 PCR 的循环次
数) ，但由于在 PCR 反应早期，扩增数量比较少，所
以荧光的产生水平低，不能与背景明显区别，之后荧
光的产生才进入指数期、线性期和最终的平台期，因
此实时荧光定量 PCR的标准扩增曲线为 S 型，如图
1 所示。其中 Rn +表示每点测量的荧光强度，代表
反应管含有模板 DNA;Rn-表示荧光基线强度，代表
反应管不含有模板 DNA，其在理想情况下是一条平
线，只具有背景荧光数值;ΔRn 的值表示 PCR 过程
中荧光产生的量，也即 PCR 产物的量。基线(base-
line)是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧
光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要
超出但还未超出背景。
图 1 实时荧光定量 PCR的标准扩增曲线［13］
为了便于对所检测样本进行比较，在实时荧光
定量 PCR反应的指数期，首先须设定一定的荧光阈
值(threshold) ，一般是以 PCR反应前 15 个循环的荧
光信号作为荧光本底信号(baseline) ，荧光阈值的缺
省设置是 3 － 15 个循环的荧光信号标准差的 10 倍，
Ct值也称阈值循环(threshold cycle) ，指在 PCR 循
环过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈
值时所经历的循环数。
研究结果表明，每个模板的 Ct值与该模板的起
始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct
值越小。因此，利用已知起始拷贝数的标准样品作
出的标准曲线和未知样品的 Ct值，即可计算出该样
品的起始拷贝数［14 － 16］。
目前常用的检测模式主要有两种:荧光染料检
测和荧光水解探针检测。
1. 1. 1 双链 DNA 结合染料 SYBR Green I 技术
SYBR Green I是一种替代溴化乙锭能结合到 dsDNA
小沟部位的具有绿色激发波长的染料，它只有与 ds-
DNA结合后才会发出荧光。当 DNA 解链成为单链
时，它从链上释放出来，这时荧光信号急剧减落。因
此，荧光强度可以代表扩增产物的数量。其最大吸
收波长约为 497 nm，发射波长最大约为 520 nm。
SYBR Green I结合到双链 DNA后，荧光强度大大增
加，具有较强的敏感性，且不必因为模板不同而特别
定制，因此设计的程序通用性好，操作简便，且价格
相对较低，故广泛应用于实时定量 PCR研究中。但
由于 SYBR Green I非特异结合双链 DNA，引物二聚
体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳
性会影响定量的精确性。通过升高温度后测量荧光
的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由溶解曲
线分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I
得到的定量结果。此外，设计引物时避免引物二聚
体的出现，在 PCR 过程中建立不加模板的阴性对
照，在试验结束后，进行凝胶电泳分析等方法的实施
可以有效保证试验结果的可靠性。
1. 1. 2 荧光探针检测技术 荧光探针检测技术是
根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence
resonance energy transfer，FRET)原理而实现的［17］。
该技术是在探针的 5端标记 R基因，3端标记 Q 基
因，当两者距离较近时构成能量传递结构，Q基团可
吸收或抑制 R 基团发出的荧光;当两者距离较远
时，R基团发出的荧光不能被 Q基团吸收或抑制，R
基团发出的荧光得到释放，荧光信号增强，荧光检测
系统可接收到荧光信号。常用的有 TaqMan 水解探
针、分子信标等。
1. 1. 2. 1 TaqMan 技术 TaqMan 技术主要是利用
Taq酶的 5→3外切活性，并在 PCR 反应体系加入
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2011 年第 7 期 马月萍等:荧光定量 PCR技术在植物研究中的应用
一个荧光标记探针。常规 TaqMan 探针的 5端标记
荧光发射基团 FAM(6-羧基荧光素) ，3端标记荧光
淬灭基团 TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。该探针
在 PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3
端淬灭基团抑制 5端发射基团的荧光发射。在
PCR的退火期，探针与模板发生特异性杂交，当合
成的新链移动到探针结合位置时，Taq 酶发挥 5→
3外切活性，将探针切断。FAM 与 TAMRA 分离，荧
光信号得到释放。模板每复制 1 次，就有 1 个探针
被切断，同时伴有 1 个荧光信号的释放。因此，荧光
信号的强度与扩增产物是直接成比例对应关系。
TaqMan探针是 Real-time PCR 试验中用的最广泛的
检测技术，用于各种不同的研究领域和研究目的［13］。
但 TaqMan也存在一定不足，主要表现在:由于
采用荧光和淬灭基团双末端标记，相隔较远，因此常
存在淬灭不彻底的情况;报告基团的水解利用的是
Taq酶的 5→3外切活性，因此定量时容易受酶活
性影响;探针标记成本较高，不便普及应用。
TaqMan MGB(minor groove binder)探针是 Taq-
Man探针的基础上改进的，在探针的 3端增加了
MGB分子，这种物质能够结合在双链 DNA 小沟部
位;当 TaqMan探针与目标序列杂交时，MGB稳定地
退火掺入到在探针和目标序列之间形成的 DNA 双
螺旋小沟内，增强探针与目标序列的结合和识别能
力，升高探针 Tm 值，因此可以设计更短的探针(一
般 13 － 20 个碱基) ，提高结果的精确性，使 TaqMan
MGB探针能够分辨 1 个碱基的差别:完全配对，有
荧光信号;1 个碱基不匹配，则没有信号。而且探针
越短，荧光基团与淬灭基团靠得更近，淬灭效果更加
彻底，加之连在 MGB分子后的是非荧光物质的淬灭
基团，使这种探针无背景荧光，因此能够提高荧光信
号的信噪比。因此，TaqMan MGB 探针可以用于单
个核苷酸多态性监测［18，19］及等位基因甲基化定量
分析［20］。
1. 1. 2. 2 分子信标 分子信标(molecular beacons，
MB)是 TaqMan探针的衍生形式。它是一种呈发夹
结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环形部分的碱基
可与目标核苷酸序列互补，一般为 15 － 30 个核苷酸
长;茎部是由互相配对的碱基组成，不能与目标基因
相配对结合，一般 5 － 7 个核苷酸长;在 3和 5端分
别接上发光基团和淬灭基团。当形成发夹结构时，
荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，发生 FRET，当
热循环温度达到分子信标的解链温度时，其构象发
生改变，能与模板结合而完全伸展成线性分子，使
FRET消失，报告基团发出荧光信号。与探针互补
的模板数量越多荧光信号越强，以此达到定量的目
的。分子信标特别适用于检测点突变［21］，能区分只
有一个核苷酸差异的不同 DNA序列，而且其敏感性
远比同等长度的寡核苷酸探针要高。它的主要缺点
是杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较
差;探针合成时标记较复杂，成本较高。
与 TaqMan探针工作原理相同的还有锚定核苷
酸探针(locked nucleic acid，LNA) ，其探针中包含一
种核酸类似物，与目标序列结合时，可以降低核糖结
构的柔韧性，增强杂交稳定性和特异性，提高探针的
Tm值，该探针产生的荧光属于积累荧光。一般每
增加 1 个 LNA 分子可将探针的 Tm 值提高 8℃，探
针可以设计得更短，具备更高的信噪比、灵敏度和准
确性［22］。Alvi等［23］设计了一个 8 bp 的 LNA 探针，
检测转基因玉米 Mon810，发现 LNA 探针可以检测
到 5 个拷贝的模板 DNA，显示其有良好的灵敏度和
准确性。
Allglo探针是美国 AlleLogic Biosciences 公司推
出的最新一代荧光定量探针，它具备 TaqMan、Taq-
Man MGB和 MB 的所有优点。该探针的荧光基团
可以互为报告基团和淬灭基团，可以标记在探针的
两端也可以标记在探针的中间，还可以标记两个以
上的荧光基团，未杂交时其几乎没有背景荧光。其
染料上含有可以提高探针 Tm 值的化学基团，极大
提高了杂交的特异性和稳定性。杂交后其探针水
解，所有荧光基团都成为荧光报告基团，荧光信号大
大提高，信噪比高于 TaqMan 和 MGB 很多，而该探
针的合成成本只有 MGB的一半，该探针产生的荧光
属于积累荧光。现在有多种荧光染料可以用于 All-
glo探针，如 MAR、JUP、SAT、URA和 NEP等，它们的
激发波长和发射波长与 TaqMan 探针的常用染料的
波长相似，所以该探针的使用不需要特殊仪器设备，
而且可以用于多重定量 PCR。Allglo 探针具备极高
的灵敏度，不仅在基因定量中具备极大的优势而且
可以用于 SNP分型。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
1. 1. 3 定量方法 在实时荧光定量 PCR 中，根据
试验的目的不同常采取相对定量和绝对定量两种方
法。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另
一参照样本的量的变化;绝对定量指的是用已知的
标准曲线来推算未知的样本的量。
标准曲线的绝对定量。用一系列已知浓度的标
准品制作标准曲线，质粒 DNA 和体外转录的 RNA
常作为绝对定量的标准品。标准品的量可根据 260
nm的吸光度值并用 DNA 或 RNA 的相对分子质量
转换成其拷贝数来确定。它的优点是稳定、准确。
将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行
PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以
测得的 Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品
进行定量时，根据未知样品的 Ct 值，即可在标准曲
线中定出样品的拷贝数。绝对定量也具有相应的缺
陷，标准品的稳定保存很难获得成功。目前广泛使
用的在 260 nm波长下定量的方法与众多因素有关，
如水、缓冲液、仪器性能，核酸的质量都会影响到结
果的稳定性。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须
用绝对定量的方法。
标准曲线的相对定量。使用标准曲线以确定某
个靶在样本中的表达相对于相同靶在参考样本中的
变化。用一系列已知外参物作标准曲线，根据该标
准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基
因同管家基因的比值作为定量的最后结果。此种方
法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而
言，因此对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。
在整个试验中，待测样品的量来自于标准曲线，最终
必须除以参照基因的量，即参照基因是 1 ×的样本，
其他的样本为参照基因的 n倍。任何含有相应靶的
储液 cDNA、RNA或 DNA均可用于准备标准品。
比较 Ct的相对定量，即 ΔΔCt值法，该方法是同
时扩增待测靶基因片段和一个作为内参照的内源性
管家基因片段。这两个扩增反应可在两管中分别进
行，也可在同一反应管中进行，测得两者的 CT 值之
差，即 ΔΔCT。比较 Ct法的前提是假设每个循环增
加一倍的产物数量，在 PCR 反应的指数期得到 Ct
值来反映起始模板的量，即一个循环(Ct = 1)的不
同相当于起始模板数 2 倍的差异。比较不同待测标
本 DNA的 ΔCT 值与正常标本 DNA 的 ΔCT 值的变
化，即可对未知标本靶基因的原始拷贝数做出判断。
但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基
本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的
估计。Pfaffl 和 Vandesomlele 等［24，25］分别提出了在
靶基因和看家基因扩增效率不一致情况下的单个看
家基因和多个看家基因的相对定量计算方法。相对
定量常用于比较基因差异表达分析方面的研究。
1. 2 实时荧光定量 PCR的优缺点
相对于其他定量方法而言，实时荧光定量 PCR
有着显而易见的优点:(1)灵敏性高:荧光定量 PCR
技术综合了 PCR 技术、荧光标记技术、光谱技术和
计算机技术为一体，大大提高了检测的灵敏度。
(2)精确性高:由于荧光信号的产生和每次扩增产
物成一一对应关系，通过荧光信号的检测可以直接
对产物进行定量，定量范围可在 0 － 1010拷贝 /mL。
(3)特异性好:使用特异性探针对定量分子进行识
别，具有很高的准确性，同时把序列由引物和探针双
重控制，特异性好，假阳性低。(4)操作简单、安全、
自动化程度高和防污染。扩增和检测是在全封闭状
态下实现的，不易污染。扩增和检测一步完成，不需
要后期处理，不需要担心放射性污染。(5)速度快，
高通量可在 2 － 3 h完成多个样品的定量分析，有效
减少了劳动量。
实时荧光定量 PCR 技术的缺点是需要特殊的
热循环仪和试剂，这些相对普通的定量方法来说比
较昂贵。
同时其精确性容易受操作时一些因素的影响，
如基因组 DNA，寡核苷酸杂交特异性、TaqMan 探针
比例、mRNA 的部分降解，SYBR Green I 的浓度大
小、PCR产物的长度长短等因素，这些都可能会引
起实时荧光定量 PCR反应在定量上的偏差，因此在
操作时需要进行条件的最优化研究。
1. 3 实时定量 PCR应用中的问题及优化方案
虽然荧光定量 PCR 技术在生物学领域得到了
广泛的应用，但在试验过程中，仍存在很多问题，如
RNA的质量、反转录和扩增效率等。Udvardi 等［26］
提出 qRT-PCR在植物研究中需注意的 11 个黄金法
则。因此，优化试验的各个环节是成功实施定量
PCR分析问题的前提。
1. 3. 1 样品准备和核酸的质量 样品准备和核酸
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2011 年第 7 期 马月萍等:荧光定量 PCR技术在植物研究中的应用
提取是整个试验的第一步，以相同体积或相同重量
的样品组织提取核酸，使样品量保持一致，这是减少
试验误差的第一步［27］。在实时 RT-PCR 研究中，
RNA必须具有相当高的质量，因此反转录前要必须
对 RNA 进行精确定量和完整性检测，从而保证
RNA的量一致［26］。以 DNA 为模板时，要对基因组
DNA进行定量分析，以相同方法提取不同组织基因
组 DNA时提取效率往往不同［28］。
1. 3. 2 反转录 实施 qRT-PCR 时，使用不同的引
物往往产生不同的结果。使用随机引物进行反转录
可能得到多个反转录产物，但在目标 mRNA 拷贝数
较低的情况下，可能无法被反转录。但在使用 rRNA
做内参时，该反转录方法比较适用。使用 oligo-dT
作为引物进行反转时，使用特异性引物，不反转
rRNA，同时不反转所有不具有 polyA 尾的 RNA，这
样组蛋白和病毒 mRNA 及 rRNA 无法进行反转录。
使用特异性引物反转可以得到最敏感的结果，但是
要求对不同的目标序列设计不同的探针，增加了试
验的复杂性和成本。因此，在实际研究时结合自身
的试验选择合适的方法。
1. 3. 3 内参基因的选择 qRT-PCR 是一项定量植
物转录本的极其高效和灵敏的技术［26］。试验通常
采用内参基因进行数据校正和标准化，以消除不同
样品在 RNA产量，质量及反转录效率上可能存在的
差异。由于管家基因在各种组织中是恒定表达的，
所以可以用管家基因的量作为某种标准，以比较来
源不同的样本目的基因表达量的差异。试验结果的
准确性很大程度上依赖于使用稳定表达的内参基因
精确标准化转录本［29］。通常选用的管家基因有
GAPDH、β-actin 和 rRNA 等。但近年来的研究发
现，目前常用内参基因均存在缺陷，在不同类型的组
织和器官发育的不同阶段、各种试验条件等不同情
况下，它们的表达量通常变异较大［30 － 38］。Gutierrez
等［39］认为错误内参的选择将导致研究结果的完全
改变。Dombrowski等［40］对逆境下毒麦的 9 个管家
基因的表达进行了分析，发现 EFF-1α和 UBQ5 对于
实时定量 RT-PCR分析是最稳定的内参因子。阙友
雄等［41］对甘蔗接种黑穗病菌后几种管家基因的变
化进行研究发现，其所选的 4 种内参基因表达稳定
性各异，25S rRNA 的表达稳定性最好，可以作为甘
蔗基因定量 PCR 中的内参基因。Lovdal 等［42，43］分
别对番茄叶子在弱光、低温和缺氮胁迫下和杨树的
几种内参基因的变化进行了研究发现，没有任何一
个内参基因在所有的试验条件下都是稳定表达的。
因此，不同的试验条件下，即便是同一基因的表达分
析也要用不同内参基因。此外，内参基因的表达量
也很关键。如果内参基因的表达量较高，目标基因
的表达量较低，那么，对于目标基因来说，这样的内
参基因也不合适。原则是要选择与目标基因表达水
平类似的内参基因。因此，研究者应根据需要选择
合适的管家基因进行准确定量。
1. 3. 4 引物、探针和扩增产物大小设计 引物和探
针的特异性及产物大小对 Real-time PCR 试验至关
重要。ABI公司的引物、探针设计专用软件 Primer
express或免费软件 Primer 3 都可以用来设计引物和
探针。扩增产物长度尽量小，产物越小，扩增效率越
高［13］，通常杂交探针的产物长度是 50 － 150 bp，
SYBR染料法检测的产物小于 300 bp。此外，用于
TaqMan探针的引物退火温度应控制在 68 － 70℃左
右。用杂交探针进行 mRNA 表达分析时，探针要尽
可能跨越两个外显子区域以避免基因组 DNA 的污
染;扩增区在 3端的引物比扩增区在 5端的引物更
好，因为这样可以减少因反转录效率引起的误差。
探针的退火温度高于引物的 Tm 8 － 10℃以确保引
物延伸过程中探针能与模板充分杂交。TaqMan 探
针的 5端不能含有碱基 G，其与猝灭基团对报告基
团的猝灭效应相关［13］。
1. 3. 5 实时 PCR试验设计及数据的统计学分析
qRT-PCR试验中试验设计对于结果的准确性很重
要。Udvardi等(2008)提出每一个试验处理材料应
该取自 3 个不同的单株。Rieu 等［44］提出 PCR 反应
中每一个反应都至少应该包括 3 个重复，每一个样
品同时扩增目标基因和内参基因，以消除 PCR本身
和样品本身的误差。进行绝对定量则标准曲线需要
在 5 个点以上。标准曲线使用的标准品是浓度已知
的 DNA 样本，可以自己制备，也可以购买商品化的
试剂盒。其 PCR反应条件应当与未知样本的一致，
以便在同一反应板上同时定量。
实时 PCR最终分析的是阈值循环或 CT，CT值
通过 PCR信号的对数值和循环数来确定。因此，CT
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值是一个指数而非线性概念。在任何统计分析中都
不要用原始的 CT值来表示结果。实施 qRT-PCR 比
较基因表达分析时，选择一个有效内标基因，确定内
标的有效性，确保它不会受到试验处理的影响，通过
PCR扩增目标基因和内标基因 RNA或 cDNA的一系
列梯度稀释模板确保它们的扩增效率相同。最后，通
过 2 －△CT计算将统计数据转化成线性形式。Ct =
－ k* log2(X0)。k = 1 / log2(1 + E) ，其中 E 代表
PCR的扩增效率，如果扩增效率是 100%，则 E = 1，
k = 1。否则只要做个浓度梯度，就可计算出来。对
于相对定量 ΔΔCt 方法，是试验组目的基因的表达
相对于对照组的变化倍数。ΔΔCt =(Ct，目的基因
－ Ct，管家基因)试验组 －(Ct，目的基因 － Ct，管家
基因)对照组，使用这一方法可以直接得到的目的
基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线，
所以这一方法更为简便省时。统计学结果表明这一
方法的结果也相当可靠。
2 实时荧光定量 PCR在植物研究中的应用
实时 RT-PCR技术是当前最新的确定基因表达
的方法，其自问世以来在基础科学研究、临床诊断、
疾病研究及药物研发等领域取得了较大的成绩。虽
然在植物研究方面应用起步较晚，但是就其技术原
理来说，在植物研究中具有广泛的应用前景。
2. 1 基因差异表达分析
比较不同基因型，不同发育阶段或生长条件下
的细胞或个体在基因表达上的差异，是研究分子调
控机制的重要组成部分。在植物基因表达分析中，
传统的 RT-PCR、Northern blot 和基因芯片等半定量
方法对于低拷贝基因或基因表达的微小变化时很难
取得理想结果，实时定量 PCR不仅能实现对核酸快
速、灵敏、高效特异检测，还可以对目的基因的起始
量进行精确定量。Czechowski 等［45］使用 Real-time
PCR研究了 1 400 多个拟南芥转录因子在根组织和
茎组织的特异表达情况，认为荧光定量 PCR是研究
转录因子的优势方法。张中保等［46］应用实时荧光
定量 PCR对玉米在水分胁迫下诱导基因的表达模
式进行分析，结果与 cDNA Macroarray 的结果一致。
贾东升等［47］用实时荧光定量 PCR 技术对小麦转录
因子 TaMyb2s在幼苗期应答水分胁迫的表达模式
进行了分析，发现其表达模式不尽相同，TaMyb2-III
对渗透胁迫的应答最迅速，TaMyb2-I 次之，TaMyb2-
II 最迟缓。发育时空表达模式结果分析表明，
TaMyb2-I 和 TaMyb2-III 可能主要在生长发育的前
期调控下游基因，而 TaMyb2-II 主要在发育后期发
挥作用。祖元刚等［48］采用荧光定量 PCR 方法对干
旱胁迫下长春花叶片和根部 Crlea 基因的表达模式
进行监测，结果表明 Crlea 基因的表达没有组织特
异性，并且为干旱胁迫正调控。
2. 2 芯片数据的确定
基因芯片和 dd-RT-PCR 是传统检测植物基因
差异表达的技术，但只是定性而非定量分析。此外，
可靠性常受技术环节中多个因素的影响，如基因芯
片中 DNA 序列，RNA 质量，杂交条件等，差别显示
技术中的电泳分辨率，引物扩增效率，分析条带的人
为误差等都会影响结果，因而需要一个定量的方法
确认基因表达的差异。实时荧光定量 PCR 可以克
服这些缺点，对这些技术取得的结果进行证实。
Rider等［49］用 AffimetricTM芯片检测拟南芥 Pickel 突
变体种子，从 185 个基因池中挑出 12 个表达上调的
候选基因，经实时 PCR 证实有 10 个表达上调。
Wang等［50］的试验表明，实时 PCR 的数据比 Affime-
tricTM芯片有更高的诱导比，只是两者的相关性很
高。Rodrigues等［51］用实时 PCR 验证 cDNA 芯片结
果，表明二者结果高度一致。目前，实时 RT-PCR 被
认为是最可靠的用作比较不同芯片分析方法的参考
技术。
2. 3 外源基因拷贝数分析
植物转基因研究中，外源基因在植物基因组中
的拷贝数 1 － 2 个时能够较好表达，插入拷贝数较多
时会导致表达得不稳定，甚至发生基因沉默现
象［52］。因此，T0代转基因外源基因的拷贝数是研究
植物转基因分子特性的基础步骤之一。Southern
blot法是鉴定转基因拷贝数的传统方法，近年来，比
较基因组杂交，多重扩增探针杂交及芯片杂交技术
也应用于拷贝数的分析，但上述分子杂交方法的共
同缺点是操作繁琐，试剂昂贵，样品需要量大。实时
定量 PCR法是近年来迅速发展的定量技术，在克服
Southern blot 定量缺点的同时，已被广泛应用于
DNA和 RNA 的定量检测。Ingham 等［53］实时 PCR
检测了 37 转基因株系外源基因拷贝数，结果与
24
2011 年第 7 期 马月萍等:荧光定量 PCR技术在植物研究中的应用
Southern blot高度吻合。
2. 4 植物病菌及病原微生物检测
植物病菌或病原微生物常常直接危害农产品的
品质和经济效益。因此，快速准确的检测方法是病
害预警监测与及时控制的技术保证。程颖慧等［54］
用实时荧光定量法检测了小麦印度腥黑穗病菌。
Alaei等［55］用传统方法和实时 PCR法检测了菊花白
锈病，认为实时 PCR 不仅能够快速准确检测病原，
而且能够监测病原和预警病害。
2. 5 单核苷酸多态性(SNP)及等位基因分析
实时荧光定量 PCR 技术不仅用于基因定量方
面的研究，而且也用于对基因的本质所发生变化的
研究，可以用于检测基因突变和基因组的不稳定性。
基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变
位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂
交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序
列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探
针与靶序列不完全配对会降低杂交体的稳定性，从
而降低其熔解温度。利用 SYBR Green I 做溶解曲
线，可分析基因小片段上的碱基突变［56］。此外，还
可以根据荧光信号的强弱进行遗传分析，根据不同
荧光基团标记的探针的杂交效率区分杂合子和纯合
子。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种，说
明它是一个纯合子，如果两种荧光信号都增加则表
明是一个杂合子。
2. 6 转基因植物鉴定
全球转基因作物面积持续增加，在解决人类面
临的粮食和能源危机的同时，也带来了新的问题，如
生态问题，转基因食品对人类健康问题等，因此对转
基因产品的检测和定量是大家关注的焦点。荧光定
量 PCR技术可以为转基因产品的检测快速而灵敏
的技术途径。Wu 等［57］建立了转基因水稻 TT51-1
实时 PCR检测体系，为快速检测转基因植物成分提
供便捷方法。
3 荧光定量 PCR技术在植物中的应用前景
荧光定量 PCR技术是定量 PCR 技术的一次飞
跃，作为一种高效的核酸定量分析方法，已逐渐被广
泛接受用于基因表达的定量分析，并与微阵列等分
子生物学技术一起，在后基因组时代的生命科学研
究中发挥重要作用。随着 PCR 仪的不断完善和价
格体系的降低及试验技术的不断发展，荧光定量
PCR技术将成为未来分子生物学实验室必备的工
具，在植物研究上将会得到越来越广泛的应用。
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