全 文 ：生物杖术通报
· 技术与方法 · 丑了口百付 口乙口 !! ∀ 年增刊
选择感染性噬菌体技术及应用
高荣凯 赵晓航 王淡
海军总医院中心实验科 , 北京 〕
摘 要 选择感染性噬菌体技术是在传统噬菌体表面展示技术的基础上发展而来的一种新方 法 , 通过将噬
菌体感染力的恢复与蛋白间的相互作用偶联起来进行筛选 , 有效提高了筛选效率 , 简化 了操作过程 , 降低 了本底 ,
为后基因组学的研究提供 了便利方法 ,特别是体 内法在理论上适合于库一库筛选 , 更具有应用价值 。
关键词 选择感染性噬菌体 噬菌体表面展示 库一库筛选
加 ,晓 彩少,
鳍 盯 ! 铭
盯 叮
, 一罗
侧 叮 ,
映 鳍 即 叮
随着基因组计划的不断发展 , 越来越多的基因
序列得到阐明 ,研究基因与蛋白质的对应关系 、蛋白
质的结构与功能以及蛋白质间的相互作用成了后基
因组计划的研究重点 , 与此同时也派生出许多新的
学科 , 如生物信息学 、蛋白质组学等等 , 为满足后基
因组研究和蛋白质组研究的顺利开展 , 发展和建立
与之相适应的研究方法是非常必要的 。 选择感染性
噬菌体 , 技术因此应
运而生[‘一’〕, 它是在传统噬菌体表面展示技术的基
础上发展而来 ,通过将噬菌体感染力的恢复与蛋白
间的相互作用偶联起来的筛选技术 , 简化了筛选过
程 , 降低了本底 , 有效提高了筛选效率 。
1 SI P 技术的机理
丝状噬菌体是一类仅感染具有 F 纤毛的革兰
氏阴性菌的单链 D NA 细菌病毒 , 其次要衣壳蛋白 P
1 位于噬菌体的一端 , 有 3 一 5 个拷贝 , 研究发现丝
状噬菌体对细菌的感染是通过噬菌体的蛋白1 与 F
菌毛结合来介导的 , 它是噬菌体感染所必需的结构 。
P l 蛋白由 406 个氨基酸残基构成 , 包含三个结构
域 , 即氨基端的 M 区和 NZ 区以及梭基端的 CT 区 ,
中间分别由富含甘氨酸的连接肤相连接 。 M 区参
与穿膜 , N Z 区参与 F 纤毛的吸附 , C T 区参与噬菌体
自身的包装 , 与噬菌体颗粒从细菌内的释放 、成熟有
关 。 目前在噬菌体表面展示体系中最常用的就是 P
1 展示 , 通过将外源蛋白或多肤与 P ln 的 CT 区的 N
端融合 ,从而将其呈现在噬菌体上 , 由于 N 区缺失 ,
蛋白班要由辅助病毒提供以满足感染力的需要 。 展
示有蛋白或多肤噬菌体库 , 通过与特定配基的亲和
结合进行筛选 , 常需要 3 一 5 轮的亲和结合 一洗涤一洗
脱 一增殖的富集淘筛过程 , 才能从 ro g 的文库中筛选
到目标基因克隆 。 在此基础上 , 如果展示外源蛋白
或多肤的噬菌体失去感染能力 , 也即在制备展示库
时 , 避免野生蛋白1 的存在 , 故而得到的重组噬菌体
颗粒没有感染力 ;而将配基与蛋白1 的 N 区融合表
基金项 目:国家自然科学基金资助项目( N O .302 0 156)
作者简介:高荣凯(1968 一 ) , 男 , 博士 , 副研究员 , 主要研究领域为基因表达调控和抗体工程
生物杖术通报 B to te ch no to舒 2008 年增刊
达或化学偶联组成衔接子 。 如果配基与展示蛋白或
多肤能特异结合 , 则通过这种桥联而形成类似天然
蛋白1 的功能性结构 , 从而恢复了感染能力 , 只要用
来感染细菌就可以进行筛选 , 这就是 SI P 技术的机
理〔4] 。
2 SI P 技术的分类
根据筛选环境的不同分为体外法和体内法 。
2
.
1 体外法
按传统噬菌体展示库的制备方法制备噬菌体展
示库 , 只是在这个过程中去除野生蛋白1 的存在 , 因
而没有感染能力 ;而配基则可 以与蛋白1 的 N 区进
行交联或者与其融合表达构成衔接子 , 在体外环境
中两者温浴 ,特异结合配基的噬菌体颗粒恢复感染
力 , 通过感染细菌而筛选出来困 。 在体外法中 , 由
于可采用化学或物理的方法制备衔接子 , 因此可选
配基的范围扩大了 ,不光局限于蛋白或多肤 , 还包括
糖类及其它有机小分子 。
2
.
2 体 内法
V d . 在体内法中 , 根据配体配基表达方式不同
可分为同一载体上的共表达和不同载体上的共表
达[’, , , 6 〕。 要筛选的配基与噬菌体展示库在一个细
菌体内共同表达 , 蛋白间的相互作用在细菌周质腔
中进行 , 如果两者特异结合 , 那装配出的噬菌体颗粒
就恢复了感染力 , 感染细菌就可以筛选得到 。 其优
点就是简便 , 不需要体外蛋白操作步骤 , 只要有靶标
的基因就可以了 , 省却了体外操作的浓度 、稳浴温度
和时间等实验条件的限制 。 这种体内筛选模式适合
于两个文库的筛选 〔’〕, 有望用于二维水平的筛选 。
3 SI P 体系构成
3.1 体外法中SI P 体系构成比较简单 , 就是偶联或
融合表达有配基的衔接子和无感染力的噬菌体展示
库。 展示库的制备与常规噬菌体表面展示基本相
同 , 就是没有了野生蛋白1 的存在 , 因而包装得到的
库噬菌体没有感染力 , 详见下面的论述 。
3
.
2 体内法 SIP 体系构成稍复杂 , 根据呈现载体的
不同有所差别仁’, , , 6 〕。
3
.
2
.
1 以噬菌体基因组载体作为呈现载体 由于
载体本身携带有包装信号和可 以表达噬菌体包装所
需要的蛋白 , 只要与蛋白 1 的 CT 区融合表达就可
以得到呈现 , 而缺失了蛋 白1 的 N 区 , 则丧失了感
染力 , 这样包装得到的噬菌体展示库就是所需要的
无感染力的。 如果配基装人该载体内表达就是同一
载体上的共表达;配基也可以克隆到其它载体上 , 只
要与噬菌体呈现载体相容就可 , 在细菌内共表达也
可以进行 SI P筛选 。
3
.
2
.
2 以噬粒载体作为呈现载体 这种情况下噬
粒载体本身无法包装成噬菌体颗粒 , 必须利用辅助
病毒提供的衣壳蛋白完成 , 制备方法与传统方法基
本一致 , 就是所使用的辅助病毒是基因 1 缺陷的。
配基的表达同样可以在同一载体上或不同的载体上
进行 。
3
.
3 基因1 缺陷型辅助病毒 它的目的就是提供
噬粒载体包装所需要的衣壳蛋白 , 同时防止野生蛋
白1 的产生 , 从而保证感染力是通过蛋白间的相互
作用而恢复 。 制备缺陷型病毒的方法有以下几种
3.3.1 珑拍突变型辅助病毒 通过在基因 l 的适
当位置引人墟拍突变密码子 , 依据其在允许和非允
许菌株内的开启一关闭效应控制蛋白1 的表达 , 以满
足需要〔8川 。 缺陷是突变位置和周围核昔序列对关
闭效果影响很大 , 常发生渗漏[‘。〕。
3
.
3
.
2 基因1 缺失的辅助病毒 通过改造将基因
1 全部缺失 , 为使其具有感染力用于展示库的制备 ,
蛋白1 由质粒共表达或包装菌株染色体上的表达来
提供 ,这样的辅助病毒包装有蛋白1 但基因缺失 , 因
而只具有一次感染力 。 由质粒表达提供蛋白1 方式
虽可以满足需要 , 但常常由于质粒与缺陷病毒基因
组共包装而产生一定的本底 , 影响筛选效率。 将基
因1 插入细菌染色体上构建包装菌株来提供蛋白1
是一条可行途径 [川 。 我们利用噬菌体 R ed 重组系
统构建了包装细胞并用来制备基因1 缺失的缺陷型
辅助噬菌体也取得了成功[” ] 。
4 SI P 技术的应用
4.1 传统噬菌体展示技术的替代和补充
由于 SIP 技术操作更为简便 , 而且配体一配基的
相互作用是在液体环境中进行的筛选过程 , 效果更
佳 , 可用来代替传统的噬菌体展示技术 , 而且对于难
以获取的蛋白配基更为有效 , 在知道基因的情况下
就可以完成 , 省却了体外蛋白纯化等操作 , 弥补了传
统噬菌体展示体系的不足 。 在噬菌体抗体库的筛选
上应用实例较多 , 采用 SI P 技术对单链抗体的连接
年增刊 高荣凯等:选择感染性噬菌体技术及应用 14 3
肤进行了探讨 , 筛选出了非重复序列的连接肤 , 在工
程抗体研究上有很大意义[”〕。 此外 , sI P 技术还用
来模拟重建蛋白结构特征的自然进化〔‘4 ) , 对蛋白质
工程研究很有价值和意义 。
4
.
2 SI P 技术用于库一库筛选
体内SIP 技术在理论上适合于库一库筛选 , 这对
于后基因组学的研究和蛋白质组学的研究意义重
大 , 利用抗原 一抗体作为蛋白对进行了库一库筛选的
探讨。 同一个载体上的表达进行库一库筛选有很大
弊端 , 理论上可行 ,但实际操作性很低 。 共包装的聚
噬菌体是一条可行的途径 , 通过将抗体和抗原分别
克隆在噬菌体呈现载体和 N 一抗原融合表达载体上 ,
这种抗原表达载体必须满足如下的条件:( 1) 与噬
菌体呈现载体相容 ,通过选择合适的复制起始解决;
(2) 可供筛选的标志 , 利用携带不同的抗性进行筛
选;(3) 与呈现载体能共包装 , 将包括噬菌体包装信
号的基因间隔区克隆人载体的适当位置 , 以提高共
包装效率;(4 )感染力恢复 , 将抗原融合在蛋白1 的
M NZ 区后面 ,并加上合适的连接肤 , 使融合蛋白能
功能性表达 , 抗原 一抗体的桥联而恢复感染力 。 我们
根据这些原则成功构建了抗原表达载体并进行了功
能性表达[”〕。 采用这种方式可行 , 但效率不是很
高 , 因筛选过程中噬菌体库对另一个库的感染的随
机性是筛选体系本身的缺陷 , 需要改进体系来完善 ,
我们在考虑采用细菌展示结合噬菌体展示的筛选体
系来克服非特异性感染的缺陷 。 另外 , 蛋白间的非
特异性结合也是产生背景感染的一个因素 , 这种结
合强度多高会影响筛选也是值得探讨的一个问题 。
5 结语
SI P 技术为研究分子的相互作用提供了一种简
便高效可行的新方法 , 而体内 SIP 技术可用于两个
文库间的筛选 ,更具有吸引力 。 虽然还存在着一些
缺陷 , 但可以通过对体系的进一步改进来完善 , 必将
在后基因组学和蛋白质组学的研究中发挥巨大作
用 。
参 考 文 献
1 Gra mat ikof K , Ce o rgi e v O , S e h a i h l er W . N u e l e i e A e i d s R e s , 1 9 9 4 ,
2 2
(
2 5
)
:
5 7 6 1
一 5 7 6 2
.
2 D u e n as M , B o 二baeek C. Bioteehnolo群 , 1 9 9 4 , 1 2 ( 1 0 ) : 9 9 9 -
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:
2 2 7
一 2 3 1
.
4 S p ad a S
,
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(
6
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:
4
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4 5 6
.
5 G ao C
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, 肠 C H et al . P roc N ail A ead sei U SA , 1 9 9 7 , 9 4
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)
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1 1 7 7 7
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.
6 R u d e rt F , W o l t e ri n g C
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.
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1 1 R o n d o t S , K o e h J
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1 3 H e n ne e k e F , K r e b b e r C , P l u e k t h u n A
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一 4 0 7
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巧 高荣凯 , 王淡. 生物化学与生物物理进展 , 2 0 6 , 3 ( 3 ) : 2 82 -
2 8 6
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