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·22· 生物加工过程 第4卷第1期
个带有0一糖基化的连接肽(Linker)连接‘1J。纤维素
酶的吸附结构域和催化结构域之间有着密切的联
系。去掉吸附结构域的纤维素酶，催化降解纤维素
的活性明显降低怛，3I。虽然目前已揭示了CBD有引
导纤维素酶到纤维素表面和破坏纤维素结晶结构的
作用[4]，并且对吸附结构域点突变的研究结果表明，
吸附结构域对纤维素吸附特性的改变将影响整个酶
的催化活性15j，但是目前纤维素酶的酶活性和吸附
特性之间相互关系的机制并不清楚。
过去的十几年中，噬菌体表面展示技术在抗体
工程和肽的亲和性筛选方面取得了极大的成功怕’71。
道。为研究吸附特性和催化活性之间的关系，并进
而通过定向进化技术对酶性质进行改造，本研究首
次构建了瑞氏木霉内切葡聚糖酶及其吸附结构域的
噬菌体表面展示系统。该系统的建立将为利用噬菌
体展示系统可进行高效亲和筛选的特点，来研究纤
维素酶吸附和催化之间的关系及进行酶分子改造打
下基础。
1材料和方法
1．1材料
近几年该技术也开始应用于酶分子改造的研究领 1．1．1菌株和质粒
埘8，9|，但该技术在纤维素酶工程中的应用还未见报 本实验所用菌株和质粒见表1。
表1本研究所用的菌株和质粒
rI址le1 StIainsa11dplasrnidusedintIlisresearch
1．1．2酶和试剂
限制性内切酶靳I、Ⅳ0f工，连接试剂盒，
dN’I髑，ATP和凝胶回收试剂盒购自Tak锄公司；
AB偈购自上海生物工程中心；HRP／Anti．M13Mono．
c10nalConiugate购自Ame璐h锄Phannacia公司；其它
常规试剂采用进口分装或国产分析纯。
1．2 PCR扩增EG工及其CBD序列
根据EG工的DNA序列，设计了3个PCR引物，
用以得到EG工基因和EGI的CBD基因。
EG工引物序列为：
P1：5’rrI．；GACCACGGCCCAGCCGGCCATllG3
7
P2：5’GTCAGCGGCCGCAAGGCATrGCGAGTAG3’
反应条件：94℃3IIlin预变性，94℃1rIlin，65℃
1 rnin，72℃1．5min，35个循环。
CBD引物序列为：
P3：5’rIT】阢GGCCCAGCCGGCCllGCACGCAGACTCA3
7
P2：5
7GTCAGCGGCCGCAAGGCA，r：盼CGAGTAG3’
反应条件：94℃3min预变性，94℃1min，
68℃1IIlin，72℃20s，3 个循环。
扩增后的目的片断经限制性内切酶靳I、Ⅳ0t
I酶切，经T4DNA连接酶作用定向连接到噬菌粒
展示载体pcANr】rAB5E上。
1．3噬菌体制备及其计数
根据fuPAsE)【pressmoduleⅪt操作指南制备噬
菌体。噬菌体的滴度是指1mL培养液中所含活噬
菌体的数量，滴度测定的方法采用双层琼脂平板法。
因为有少数活的噬菌体可能未引起感染，所以为了
准确地表达噬菌体悬液的浓度，本实验采用了噬菌
斑形成单位(Plague．fbnningunit，pfu)而不是克隆形
成单位(colony—f0ⅡninguIlit，cfu)。
1．4酶联免疫反应测定亲和性
为确定噬菌体展示的EG工及其CBD的吸附特
性，本实验的EuSA方法是以纤维素滤纸黏附于96
孔板底部作为固定相。用含脱脂牛奶的封闭缓冲液
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·24· 生物加工过程 第4卷第1期
(a)1：egI的PCR产物；2：DL2000marker；
(b)1：DL2000marker；2：cbd的PCR产物
图2 PCR反应扩增EG工基因及EGI—CBD基因的凝胶电泳图
Fig．2蹦qu龃titationofPCR砌pljIiedegIan茎1妻耋．i萋
：§i主l雾+纵驯蠹妄；垂矗；!!刑；!蔷羹i雾羹塞雩耋襄鍪囊恺至薹；萋!篷
霎；雩；剂蠢珏誊囊
ov释n(Wisconsin，USA．)；菌种
E．c0如DH5a购自于Clontech(Heidelberg，G m锄y)；
吲哚，靛蓝购自于nug公司；色谱级别。
1．2 易错PCR构建P450BM．3突变体库
根据易错PCR定向进化的原理HJ，对P450
BM．3的单加氧酶的基因进行随机突变，然后将该突
变基因 片段连接到具有同样酶切的线性质粒中并且
转化到具有高转化率的感受态细胞E．co丘DH5a
中，涂布到含有30肛∥mL卡那霉素的LB琼脂平板
上，37℃过夜培养。在上述得到克隆的平板上加
2mL的LB液体培养基用刮布器轻轻地刮取并收集
细胞，然后提取质粒并转化至E．co如BL21中，涂布
到含有30叫n1L卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃
过夜培养，获得具有表达突变酶的突变文库。
1．3 饱和定点突变构建突变文库
根据易错PCR定向进化的结果，利用Stmtagene
公司的 QuikChangeKit_5J，对模板质粒pET28a(+)
P450BM-3进行PCR扩增，然后转化到大肠杆菌
E．c如Novablue(DE3)，涂布到含有30皑／mL卡那霉
素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到突变文库。
1．4 突变文库的筛选
从平板上挑取蓝色的克隆，并接种到200姐含
有30弘∥mL卡那霉素的LB液体培养基的96微孔
板中，37℃过夜培养，取20血该过夜培养液加入到
一个新的200皿、含有30肛∥mL卡那霉素LB液体
培养基的96微孔板中，在37℃培养∞锄为0．5～
0．7时加入IPTG(终浓度0．5眦ml／L)诱导并在30℃
继续培养48h，得到蓝色的细胞，用DMSO提取该蓝
色物质bj，在630啪处测定其吸收值，将活力高于
亲本酶 的菌株挑选出来并提取质粒进行全自动
DNA；!贝9序。
1．5 P450BM．3含量的测定
采用co．差示光谱分析，按参照文献[6]进行。
2结果与分析
2．1 易错PCR定向进化的结果
通过对三千多个克隆的多次96微孔板筛选，最
终挑选 3个克隆进行全自动DNA测序，并将其序列
翻译到氨基酸水平，发现这3个克隆都具有有义突
变位点 (1433MK434G，D168NA225VK440 ，E435D)，
从而在基因水平上表征了突变酶的获得，进一步用
蛋白质模拟技术对新突变位点在蛋白质三级结构中
的位置进行模拟，发现突变位点具有无规性，有些突
变是位于活性中心空穴内，有些突变是远离活性中
心(图1)。
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