全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-22
基金项目:项目支持国家自然科学基金(30371006),中法先进研究项目(PRABT-04-01)
作者简介:李季(1974-),研究生
通讯作者:李正国,教授,E-mail:zhengguoli@cql.ealu.cn,Tel:23-65120483
番茄 LeEIL1属于 EIN3/EILs(ethylene-insensitive3,EIN3;EIN3-like,EIL)蛋白家族,在乙烯信号通路中
的是一个重要转录因子[1]。EIN3/EILs蛋白能与下游基因上的启动子结合,参与这些基因的表达调控[2,3]。研
究表明,EIN3的突变会削弱乙烯应答反应,而过量表达 EIN3又会引起乙烯的超敏反应,或组成性的乙烯
反应[4]。EIN3在作用过程中能以二聚体的形式与乙烯应答基因的 28bp的 DNA顺式作用原件相互识别结
合[5]。近年来,人们发现EIN3的mRNA水平不受乙烯的影响,而EIN3的蛋白质浓度在乙烯处理下会增高[6,7],
同时发现EIN3蛋白受F-box蛋白质EBF1/2介导,通过泛素化途径进行降解同时达到翻译后调控的作用[8]。
番茄是一种跃变成熟型果实,乙烯在其成熟的生长生理过程中起着重要的作用,Tieman等人从番茄克
隆了 3个 EIN3-Like基因 LeEIL1、LeEIL2和 LeEIL3[9],其中 LeEIL1基因序列与烟草 TEIL基因的同源性为
79%,与拟南芥 EIN3、EIL1、EIL2和 EIL3的同源性分别为 59%、56%、52%和 46%[10],通过转基因分析结果
认为这 3个基因都可能参与了乙烯反应。
现代分子生物学研究趋势已从基因组学转向蛋白质组学,仅仅知道蛋白质的功能并不能满足研究需
求,人们希望更进一步的了解蛋白之间的相互作用、蛋白质的具体功能位点以及蛋白质是如何与相关因子
互相识别结合共同行使功能。前人对 EIN3/EILs的研究确认了其在乙烯信号通路中所扮演着重要角色,分
番茄LeEIL1基因的克隆分析及表达载体构建
李季 李正国 罗安才 杨迎伍 邓伟
(重庆大学生物工程学院基因工程研究中心 重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室,重庆 400044)
摘 要: 采用RT-PCR方法从番茄果实cDNA中成功克隆了番茄 LeEIL1基因,并测序验证序列正确;经数据库
检索等生物信息学分析方法,对番茄LeEIL1蛋白质与拟南芥、烟草、水稻、香石竹等的 EIN3/EILs蛋白质序列进行了同源
性分析,初步确定了番茄LeEIL1上的DNA结合功能域及其结合激活位点。并构建了LeEIL1的酵母表达工程菌pPIC9k-
EIL1/KM71,为该基因的功能研究奠定了基础。
关键词: 番茄LeEIL1 同源分析 DNA结合域 载体构建
CloningofTomatoLeEIL1GeneandConstructionofitsYeast
ExpressionVector
LiJiLiZhengguo LuoAncaiYangYingwu DengWei
(GeneticEngineeringResearchCenter,ColegeofBioengineering,ChongqingUniversity,KeyLaboratoryofFunctionalGene
andRegulationTechnologiesUnderChongqingMunicipalEducationCommission,Chongqing400044)
Abstract: TomatoLeEIL1genewasclonedbyRT-PCR from tomatofruitcDNA.Afterhomologyanalysisof
tomatoLeEIL1,ArabidopsisthalianaEIN3,Nicotianatabacum EIL,OryzasativaEIL1,DianthuscaryophylusEIL1,Musa
acuminateEIL2andVignaradiateEIL1proteinsinsomeproteinmodeldatabases,theDNAbindingdomainandbinding
activitysiteoftomatoLeEIL1proteinwereprobablyidentified.Then,LeEIL1wasclonedintopPIC9kexpresionvector,
theyeastexpresionstrainspPIC9k-EIL1/KM71weresuccesfulyselected.
Keywords: LeEIL1gene HomologyanalysisDNAbindingdomain Vectorsconstruction
2008年第4期
子遗传学的研究也同时让人们了解到 EIN3/EILs与不同因子共同作用下使植物产生相应的生理反应。
LeEIL1作为乙烯信号通路中的一个重要的下游应答因子[1],其结构、功能位点以及与其相关的调控模式并
不完全清楚,因此克隆番茄 LeEIL1基因并构建表达载体,对番茄果实发育成熟机理进行深入的研究具有
十分重要的意义。
1 材料与方法
1.1 实验材料
大肠杆菌 E.coliJM109、毕赤酵母 KM71、酵母表达载体 pPIC9k为本实验室保存;高保真 DNA聚合酶、
T4连接酶以及各种限制性内切酶购自 Takara公司;M-MLV逆转录酶购自 Promega公司;DNA凝胶回收试
剂盒、PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;卡那霉素购自北京鼎国生物技术有限责任公
司。
1.2 实验方法
1.2.1果实总 RNA的提取及 cDNA合成 取成熟番茄果实果肉 200mg,参考果实 RNA提取方法[11]提取番
茄果实总 RNA。以 2μg总 RNA为模板,按 M-MLV逆转录酶说明书,使用 Oligo(dT)引物进行逆转录。
1.2.2 番茄 LeEIL1基因的克隆 参照 GenBank中番茄 EIL1基因序列 AF328784,设计引物:前引物为 5-
TATGATGATGTTTGAGGAAATGG-3,后引物为 5-TCTAGTACCAAATAGGGAGCATG-3,通过 PCR扩增出番
茄 LeEIL1全长基因,并测序验证。
1.2.3 生物信息学分析 采用软件 DNAMAN对 EIN3/EILs蛋白质进行序列比对及进化树分析;采用软件
Antheprot对番茄 LeEIL1蛋白质二级结构进行预测分析;在网站 htp:/www.wwpdb.org/的蛋白质结构模型库
(ProteinDataBank,PDB)对 LeEIL1进行结构域的比对检索;在 htp:/www.expasy.org/prosite/在线 prosite分
析工具分析预测 LeEIL1蛋白质的功能及酶活位点。
1.2.4 表达载体 pPIC9k的构建 采用以下引物 PCR扩增番茄 LeEIL1克隆片段:前引物为 5-TTTGAATTC
CATCATCATATGATGATGTTTGAGGAAATGGGGTTCAG-3,后引物为 5-TTCGCGGCCGCTAGTACCAAATAGG
AGCATC-3,扩增产物回收后,经 EcoRI和 NotI酶切后连接到 pPIC9k载体上,并测序验证。
2 结果与分析
2.1 番茄 LeEIL1基因克隆及鉴定
设计特异性引物从番茄果实 cDNA中扩增番茄 LeEIL1基因,扩增产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴
定。结果如图 1所示,扩增片段(箭头所示)大小接近 2000bp,与实际片段大小相符,经测序比对分析,序列
正确。
2.2 LeEIL1蛋白质序列分析
LeEIL1蛋白质具有 610个氨基酸残基,使用 DNAMAN进行蛋白质序列比对 LeEIL1与拟南芥 EIN3、烟
草 EIL、水稻 EIL1、绿豆 EIL1、香石竹 EIL1及黑芭蕉 EIL2等的 EIN3/EILs蛋白质的同源性分别为 63%、
81%、65%、65%、51%和 49%,EIN3/EILs蛋白质的 N端具有较高的保守性。
Kazuhiko等已成功定位了拟南芥 EIN3(ArabidopsisthalianaEIN3,AtEIN3)的 DNA结合功能域(DNA
BindingDomain,DBD)[12,13]。结合氨基酸序列比对结果以及 PDB蛋白质结构数据库检索结果,研究发现,番
茄 LeEIL1的 N端有一段与 AtEIN3的 DBD区域性同源性极高的氨基酸序列(图 2),可初步确定该区域为
番茄 LeEIL1的 DBD功能域(图 2黑线标记,169AA-306AA)。
采用 Antheprot软件 4种方式预测 LeEIL1蛋白二级结构,如图 3所示。其中黑框所示的区域为预测的
番茄 LeEIL1的 DNA结合功能域。
磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰,对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。蛋白质的磷酸
化修饰与多种生物学过程密切相关,如 DNA损伤修复[14]、转录调节[15]、信号转导[16]、细胞凋亡的调节[17]等。
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经 Prosite分析 LeEIL1蛋白质,发现它具有 12个酪蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶 C磷酸化位点以及
1个 cAMP/cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点(具体数据未列出)。其中 cAMP/cGMP依赖的蛋白激酶磷酸
化位点是一个高度保守的酶活位点,在拟南芥、烟草等植物中皆存在(除拟南芥中 EIL2和 EIL3为蛋白激
酶 C磷酸化位点替代),同时该磷酸化位点位于 EIN3/EILs的 DBD结构域 N端较近位置,推测其可能与
DNA结合激活有关[18],具有较大的研究意义。
2.3 pPIC9k-EIL1/KM71表达工程菌的构建
通过连接转化将扩增的番茄 LeEIL1基因插入 pPIC9k表达载体中,并转入宿主细胞大肠杆菌 JM109,
经酶切和测序鉴定确认 LeEIL1已成功插入 pPIC9k中,进行 PCR鉴定,结果见图 4。可以看出 2 000bp左右
有明显的条带,与 LeEIL1基因大小相符。
采用 Sac I酶切将 pPIC9k-EIL1表达质粒线性化,电转化 KM71酵母细胞,转化子均为 Muts型[19]。
图 1 PCR扩增目的基因
1为 DNA marker,2为 PCR产物,3为空白对照
图 2 番茄 LeEIL1与拟南芥 EIN3的 DNA结合功能域序列比较
图 3 Antheprot分析 LeEIL1蛋白质二级结构
图 4 pPIC9k-EIL1/JM109工程菌的 PCR鉴定
1:DNA分子标准;2:空宿主 JM109对照;3~5:筛选菌株
3 讨论
采用特异引物,成功克隆了番茄 LeEIL1基因,经测序分析序列正确。采用 PCR技术在 LeEIL1基因两
端引入 EcoRI和 NotI酶切位点,并将其插入酵母表达载体 pPIC9k中,成功构建了 pPIC9k-EIL1表达载体。
pPIC9k-EIL1线性化处理后,经电转化整合到毕赤酵母 KM71的基因组中,成功的构建了番茄 LeEIL1酵母
表达工程菌 pPIC9k-EIL1/KM71,并已从所构建的酵母表达工程菌中筛选出 LeEIL1高表达的菌株,通过扩
大诱导培养后,从诱导产物中纯化出了番茄重组 LeEIL1蛋白质(尚未发表)。
近年来,对于乙烯信号通路中的关键因子 EIN3/EILs蛋白家族的研究集中在模式植物拟南芥中,然而
在拟南芥中乙烯调控果实成熟发育的过程不明显,因此人们开始转入对另一种模式植物番茄的研究。番茄
是果实发育与成熟研究的一种重要模式植物,而关于番茄的 EIN3/EILs蛋白的研究大多浅止于基因转录水
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平,而对其蛋白水平的研究甚少。成功克隆了番茄 LEEIL1基因,采用生物信息学分析方法,经同源比对和
各类数据库的检索比对,对番茄 LeEIL1蛋白质在结构和功能位点进行了初步的描述和诠释;同时构建了
其酵母表达工程菌,对深入从蛋白水平上研究番茄 EIN3/LeEILs蛋白质的功能与结构的关系奠定了重要基
础。
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李季等:番茄LeEIL1基因的克隆分析及表达载体构建
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