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技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
蛋白质组学技术在植物类囊体膜蛋白研究中的应用
张晶  姚洪军  高荣孚
(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083 )
  摘  要:  类囊体作为植物光合作用光反应的重要场所, 在植物亚细胞蛋白质组学研究中倍受关注。介绍了植物蛋白质
组学相关技术, 包括双向凝胶电泳 ( 2DE)、高效液相色谱 (H PLC )、高效毛细管电泳 ( H PCE)、质谱 ( MS)和蛋白质组学数据库
在植物类囊体膜蛋白研究中的应用。同时对类囊体膜蛋白质组学的研究趋势进行了探讨。
关键词:  蛋白质组学  双向凝胶电泳  高效液相色谱  高效毛细管电泳  质谱  蛋白质组  学数据库  类囊体膜
蛋白
Technique of Proteom ics and ItsApplication to
Plant Thylakoid Proteom ics
Zhang Jing YaoH ongjun Gao Rongfu
(College of Biological Sciences and B iotechnology, Beijing Forestry University, Beij ing 100083)
  Abstrac:t  Thy lako id as an important location of photosynthes is has a ttracted grow ing atten tion in the subcellular proteom ics re

search This rev iew summ ar ized the techniques and re lated app lications to the research o f p lant pro teom ics, includ ing 2DE, HPLC,
HPCE, M S and databases correlated to the pro teom ics In addition, the prospects o f pro teom ics co rre la ted to the thy lakoid w as also dis

cussed
Key words:  P roteom ics 2DE H PLC  HPCE  MS Proteom ics Databases Thylako id membrane pro te ins
收稿日期: 2008
11
11
作者简介:张晶 ( 1982
) ,女,硕士,专业方向:光合生理; Te:l 010
62391637, E
m ai:l zh angjing19820929@ 163 com
通讯作者:高荣孚,教授,国务院参事;姚洪军,博士; E
ma i:l hong juny@ b jfu edu cn
1 蛋白质组学
继模式植物拟南芥和水稻基因组测序的完成和
高通量的蛋白质分析技术得以突破之后, 研究蛋白
质的表达模式和功能模式以及在转录组和蛋白质组
水平上系统地分析基因的功能亟待解决 [ 1] , 在此背
景下,蛋白质组学应运而生。蛋白质组学的概念最
先由W ilk ins和 W illiam s于 1995年提出,是指一个
细胞或组织的基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质
组学是以蛋白质组为研究对象,在注重新蛋白鉴定
和功能分析的同时揭示它们的表达和互作, 从整体
水平上探索生命活动的规律 [ 2]。蛋白质组学研究
主要包括蛋白质的表达模式和功能模式两方面。表
达模式的研究主要是探明某一细胞或组织所有蛋白
质的表征问题;功能模式的研究是蛋白质组学研究
的主要目标,因为蛋白质与蛋白质, 蛋白质与 DNA
之间的相互协调作用是细胞进行信号转导与代谢活
动的基础,对蛋白质结构的认识是揭示所有基因或
蛋白质功能及其互作模式的重要途径。亚细胞水平
蛋白质组,即在细胞器内表达的蛋白质组的研究将
蛋白质组学推向一个更广阔的领域。
2 蛋白质组学相关技术在植物类囊体蛋白
研究中的应用
类囊体膜系统主要包括 4种高丰度的多亚基膜
整合蛋白, 分别是光系统 ( PS )、光系统 ! ( PS
! )、细胞色素 b6 f复合物 ( Cytb6 f复合物 )和 ATP合
酶, 共含有约 70个蛋白参与光合反应。目前至少可
以确定有 100种蛋白 (多数为低丰度蛋白 )涉及到
这些复合体的调控 [ 3]。近年来, 随着各种电泳技术
的发展及其与质谱技术的结合, 植物类囊体蛋白质
组学的研究取得了一定进展。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2009年第 4期
21 双向电泳 ( 2DE)
2DE由任意两个单向聚丙烯酰胺凝胶电泳组
合而成,利用蛋白质的带电性和分子量不同,通过两
次电泳分离蛋白质群, 迄今为止仍然是分离细胞或
组织中蛋白质混合物的最有效方法之一 [ 4 ]。
211 等电聚焦双向电泳 ( IEF /SDS
PAGE )  IEF/
SDS
PAGE是以等电聚焦
聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( IEF

PAGE)为第一向, 根据蛋白质等电点 ( pI)的不同在
pH胶中将其分离;以十二烷基磺酸钠
聚丙烯酰胺凝
胶电泳 ( SDS
PAGE)为第二向,根据蛋白质的分子量
不同将其分离成单个的亚基。电泳后的凝胶经染色
呈现二维分布图,水平方向反映蛋白质在 pI上的差
异,垂直方向反映它们在分子量上的差异。因此利
用 IEF /SDS
PAGE可以有效地分离大量的可溶性蛋
白及一些类囊体膜周蛋白。 Pelt ier等 [ 5]利用双向凝
胶电泳、质谱分析和 N端 Edman测序法,结合数据
库检索,对豌豆类囊体可溶囊腔和外周蛋白进行系
统分析比较,表明至少形成 200~ 230种蛋白。在鉴
定的 61种蛋白中,有 33种确定了功能或功能域,发
现了 9种蛋白携带囊腔转运肽。
IEF /SDS
PAGE的分辨率较高, 是其他单向和
双向电泳无法比拟的。但是对某些极酸性和极碱性
蛋白、低丰度蛋白和疏水性膜蛋白的分离较困难,而
且染色技术的灵敏度和线性范围不足以呈现所有分
离的蛋白质。另外某些基因的表达产物在胶中呈现
多点或不同基因的表达产物共点,使数据的比较、定
量更加复杂 [ 6]。
212 蓝绿温和胶电泳 ( BN
PAGE )  随着电泳技
术的发展, 有研究者发明了 BN
PAGE来代替 2DE
中的第一向 IEF
PAGE,起初用来分离线粒体膜蛋白
和分子质量在 10 kD ~ 10MD的蛋白质, 后来用于
分离类囊体膜疏水蛋白 [ 7]。此法首先将膜蛋白复
合物溶解于非离子性去污剂,这种使膜蛋白复合物
处于低聚状态的方法对于研究蛋白质之间的相互信
息交流具有重要作用。对非离子性去污剂的选择取
决于去污剂对目标蛋白复合物的稳定性, 常用的非
离子性去污剂有 DM、洋地黄皂苷、TritonX
100
等 [ 8]。待样品增溶和离心之后,加入阴离子考马斯
亮蓝染色剂,使蛋白质带上负电荷,减少了蛋白质的
聚集,电泳时均向阳极移动。考马斯亮蓝染液代替
阴极电极液,使电泳和染色同时进行,最大限度地保
持了蛋白质的完整性, 以便直观快速地反映结果。
电泳时结合叶绿素的蛋白复合物呈绿色,而不含叶
绿素的呈蓝色。李贝贝等 [ 9]利用 BN
PAGE研究了
豌豆叶绿体基质和基粒类囊体膜的色素蛋白复合物
组成, 在同一块胶上将 PS 、PS!、Cytb6 f复合物、
ATP合酶和 RUBP羧化酶等分开。Kugler和 S ingh
等 [ 10, 11]利用 BN
PAGE分析了菠菜、烟草和马铃薯
类囊体膜中的 PS!和 PS 单体、Cytb6 f复合物二聚
体和 LHC 三聚体结构。
BN
PAGE对膜蛋白复合物的分离效果较好, 尤
其与 SDS
PAGE、BN
PAGE和 MS等方法联用时具
有更大作用 [ 12]。
BN /SDS
PAGE能够研究细胞处于特定发育状
态时蛋白质之间的相互作用信息。第一向 BN

PAGE在得到蛋白复合物分子量的同时使其保持天
然状态,是进一步分离蛋白复合物的基础; 第二向
SDS
PAGE可以得到组成蛋白复合物的各个亚基及
其分子量以及单个蛋白之间的相互作用信息。张立
新等 [ 13]利用 BN /SDS
PAGE并结合免疫印迹法研
究了菠菜叶绿体转运通道蛋白 cpSecY, 证明了此蛋
白特异性地参与叶绿体基因编码的 D1蛋白的转运
和类囊体膜的插入以及 D 1蛋白在翻译的同时组装
成 PSII复合物的同步翻译组装机制。
BN /BN
PAGE可以较好地分离由多种蛋白复
合物组成的一些超分子膜蛋白复合物。蓝细菌中的
PS!以三聚体形式存在, PS 以二聚体形式存在,
二者均与不同的捕光色素蛋白相结合。目前对于这
类复合物结构的研究方法较少,除了 X射线晶体衍
射结构分析以外, BN /BN
PAGE是比较可靠的分离
方法。 Jesco等 [ 14]利用 BN /BN
PAGE并结合 MS分
离了拟南芥叶绿体的 9个分子量在 600~ 3 200 kD
之间的光系统超分子复合物。通过第一向 BN /
PAGE得到了 14个不同分子量的蛋白复合物, 通过
第二向 BN
PAGE将低丰度的 PS!超分子复合物分
成了单体的 PS!, 由此推断出这些复合物分别代表
了 PS!复合物的二聚体和三聚体形式。
BN /SDS
PAGE与各种 MS的联用是分离和鉴定
植物疏水性膜蛋白的有效方法之一。膜蛋白约占基
因组翻译的所有蛋白总量的 30%, 在细胞能量转换、
56
2009年第 4期 张晶等:蛋白质组学技术在植物类囊体膜蛋白研究中的应用
信号转导和代谢产物运输等方面具有重要作用 [ 15] ,
然而一些低丰度的膜内在蛋白重现性差,甚至在胶中
无法显现。双向 BN /SDS
PAGE是已报道的能够分
离活性膜蛋白复合物及其亚基的有效方法之一。对
于第二向胶上特定蛋白质亚基的精确鉴定不应单凭
视觉来观察胶中亚基的分子量,而应该借助于各种质
谱技术。植物类囊体疏水性膜蛋白的分离目前已成
为现代分离技术的一个挑战。Rexroth等 [ 16] 利用
BN /Tricine
SDS
PAGE并结合多肽指纹质谱和基质
辅助激光解吸附离子化时间飞行质谱 (MALD I
TOF

MS)研究了绿藻的类囊体膜蛋白复合物。
213 无色温和胶双向电泳 ( CN /SDS
PAGE)  CN

PAGE由 BN
PAGE演变而来, 近年来已成为分离和
研究超分子复合物的有效方法之一。由于 BN
PAGE
中使用的考马斯亮蓝干扰了胶内活性测定和荧光检
测,因此在 CN
PAGE过程中去掉了考马斯亮蓝。然
而在电泳过程中蛋白质的聚集和条带的变粗降低了
CN
PAGE的分辨率。W itt ig等 [ 17]将 BN
PAGE中的
考马斯亮蓝换成了阴性和中性去污剂的混合物,与蛋
白质结合后增加了蛋白质的可溶性,蛋白质带上负电
荷后在电场中不断向阳极移动。此外, CN
PAGE可
与 SDS
PAGE联用来检测单个蛋白亚基的情况,由于
CN
PAGE对于胶内活性测定和荧光检测标记具有优
势,且比 BN
PAGE更温和,获得的蛋白复合物活性更
强,因此在蛋白质组学研究中更具有优势。例如, Pe l

t ier等 [ 18]利用 CN
PAGE并结合 T ricine
SDS
PAGE分
析了叶绿体间质一些蛋白质的分子质量。
22 高效液相色谱技术 (HPLC )
高效液相色谱 (HPLC )最初是一种用于分离蛋
白质和多肽的方法,具有分析速度快、分离效率高和
检出极限低的特点。与二维电泳相比, HPLC主要与
高通量的MALD I
TOF
MS联用,构成自动化的液质联
机,能够解决低丰度蛋白质和疏水难溶性膜蛋白的分
离分析。反相高效液相色谱 ( RP
HPLC)适用于分离
非极性和极性较弱的化合物,原理是根据蛋白质的疏
水特性来分离不同的蛋白质组分。据统计, RP
HPLC
在现代液相色谱中约占整个应用部分的 80%, 影响
最为广泛。Friso等 [ 19]提取叶绿体类囊体膜蛋白, 利
用 RP
HPLC、单向和双向电泳进行分离,并用不同的
酶进行酶解,再用质谱和生物信息学方法鉴定酶解混
合物。结果显示,在被鉴定的 154个蛋白质中,有 76
个蛋白质为
螺旋整合类囊体膜蛋白, 27个为未知
功能的新蛋白已被预测为叶绿体运送肽,同时证明了
类囊体膜表面是蛋白质合成的重要场所。
23 高效毛细管电泳技术 (HPCE )
高效毛细管电泳 ( HPCE )是 80年代后期发展
起来的用于分离和分析蛋白质、多肽和核酸的一项
新技术,是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的
产物,在分辨率、灵敏度、速度和自动化程度等方面
比液相色谱法具有更多的优势。特别是在分离小分
子多肽时能够及时检测到所有组分, 克服了传统电
泳的局限性。其基本结构包括进样系统、毛细管、检
测系统、高压电源、清洗系统、温控系统等。HPCE
以毛细管为分离通道,在高电压作用下,带电粒子在
毛细管内电解质溶液中以不同的速度迁移来实现分
离。在分离多肽和蛋白质时,应用比较广泛的模式有
毛细管区带电泳 ( CZE )、毛细管等电聚焦 ( CIEF)和
毛细管电色谱 ( CEC)等。姚洪军等 [ 20]利用 HPCE较
好地分离了豌豆类囊体膜 PS!复合物并探讨了其结构
与多肽组成,为进一步利用毛细管电泳技术进行蛋白
复合物多肽的分离奠定了良好的基础。
24 质谱联用技术
质谱是高灵敏度高特异性地快速鉴定生物分子
的技术,近年来已成为蛋白质组学研究最重要的技
术突破之一 [ 21]。其原理是先将样品分子通过离子
化装置转化成气态离子, 接着通过质谱分析器根据
离子间质荷比的差异进行分离并确定分子质量, 最
后转化到离子检测装置。为使待分析的组分更接近
真实情况,要求质谱仪具有良好的灵敏度、精密度和
解析能力。
质谱具有较强的定性功能,在一次分析中能够
获得很多结构信息,测定时多采用与其它分离系统
的联用技术。首先将通过双向电泳或高效液相色
谱、高效毛细管电泳等分离得到的蛋白质用特定的
蛋白质酶 (如胰蛋白酶 )消化成肽段, 再用质谱仪进
行分析。Vener等 [ 22 ]利用质谱技术研究了拟南芥类
囊体膜蛋白质的磷酸化现象。研究发现, PS 核心
中的 D1、D2、CP43蛋白质位于 N端的苏氨酸 ( Thr)
被磷酸化; 外周蛋白 PsbH的 Thr
2被磷酸化; 而成
熟的光捕获蛋白 LHC 的 Thr
3被磷酸化,指出质
57
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2009年第 4期
谱法为研究复杂样品中蛋白质磷酸化的化学计量学
提供了新的途径。 Pe ltier等 [ 23] 利用 BN
PAGE、
MALD I
TOF和 ESI
MS /M S分析鉴定拟南芥叶绿体
中一个 350 kD的由 10个不同亚基组成的 C lpP蛋
白酶复合体时,发现了一个不属于任何已知叶绿体
基因家族的新的叶绿体蛋白。
25 植物膜蛋白质组学数据库
生物信息学是在计算机和网络迅速发展以及各
种生物数据不断增加的情况下把数据组织起来并从
中提取生物学新知识的一门科学,现已迅猛发展并广
泛渗入到各个领域。目前与植物膜蛋白质组学相关
的数据库不断完善,包含了双向凝胶电泳图和部分氨
基酸序列等信息, 其中最著名的数据库是 SW ISS

2DPAGE。另外还有植物膜蛋白质组数据库 ( PM

db)
[ 24]和植物质膜蛋白质组数据库 ( PPM db) [ 25] , 这
两个数据库详细提供了包括拟南芥膜蛋白文库 (AM

PL)、水稻膜蛋白文库 ( RM PL )、跨膜蛋白数据库
(TMPDB )和通道蛋白数据库 ( TCDB)等有关植物膜
蛋白组的数据库。这些数据将为植物膜蛋白质组学
的研究提供信息和参考。
3 结语
蛋白质组学提供了一系列在蛋白质水平上研究
植物膜蛋白的有力工具和方法。双向电泳技术、高
效液相色谱、高效毛细管电泳、质谱和生物信息学的
快速发展增加了蛋白质组学分析的敏感度和效能,
现已广泛渗入到植物亚细胞器和特异性组织的研究
中。蛋白质组学作为一门新兴学科, 目前仍然存在
一些技术上缺陷,如蛋白质的动态分辨率问题、纯化
和定量问题、疏水性膜蛋白的鉴定和定位等问题。
但随着膜蛋白抽提方法的改进、提取和分离效率的
提高以及一些新型药物的应用,植物膜蛋白质组学
研究将提升到一个新的水平。
植物类囊体亚蛋白质组学的深入研究为全面认
识叶绿体不同区域的功能蛋白奠定了重要基础。膜
蛋白检测技术的改进以及不断建立的植物基因组数
据库的完善,促进了对于类囊体膜上新蛋白及其新功
能的挖掘。多种蛋白质分离鉴定技术的综合运用和
蛋白质之间相互作用信息的积累有利于进一步探明
植物叶绿体亚蛋白质组的功能,从而在阐明植物生
长、发育、进化及代谢调控规律等方面取得重大突破。
参 考 文 献
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