全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
微滴培养技术的新应用
霍龙1 张岩2 吴应积1，2
(1内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021;2内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特 010021)
摘 要: 微滴培养技术在卵母细胞培养和胚胎早期发育研究中有广泛的应用。近期研究发现这项技术又有新的应用
范围。有科学家发现将该技术应用于胚胎干细胞可以实现高效传代，在精原干细胞培养和精子发生相关过程的研究方面也
可取得很好效果，同时，对早期人类胚胎干细胞的分离过程的监控和对精原干细胞生长过程的观察也相对容易。这些研究结
果显示，微滴培养技术在这些新领域的研究与常规培养方法相比具有独特的优势。回顾微滴培养技术的主要发展过程，重点
探讨微滴培养技术的最新应用及其优点。
关键词: 微滴培养技术 新应用 体外培养 胚胎干细胞 精原干细胞
The New Applications of Micro-drop Culture Technique
Huo Long1 Zhang Yan2 Wu Yingji1，2
(1College of Life Sciences Inner Mongolia University，Hohhot 010021;2Key Laboratory of China Education Ministry for
the Research of Mammal Reproductive Biology and Biotechnology，Inner Mongolia University，Hohhot 010021)
Abstract: Micro-drop culture technique has been used widely in the oocyte culture and the development of early embryos． It has
been found this technology has multiple new applications by recent studies． Some scientists have found that this technique used in em-
bryonic stem cells can achieve high efficiency in passage，used in in vitro culture of spermatogonial stem cells and related spermatogen-
esis can be also very desirable，while its relatively easier to monitor the derivation of the early human embryonic stem cells and observe
the process of the growth of spermatogonial stem cells． These results showed that micro-drop culture technique in these new areas of re-
search has multiple special advantages compared with the conventional culture methods． In this review，we describe the development
process of the micro-drop culture technique，and focus on the latest applications and advantages of this technique．
Key words: Micro-drop culture New applications In vitro culture Embryonic stem cells Spermatogonial stem cells
收稿日期:2011-04-29
基金项目:国家大学生创新性实验计划(101012610) ，高等学校博士学科重点专项科研基金项目(20101501110001)
作者简介:霍龙，男，本科，研究方向:精原干细胞;E-mail:howlown@ 163． com
通讯作者:吴应积，男，教授，研究方向:精原干细胞及乳腺生物反应器;E-mail:yingji_wu@ yahoo． com． cn
微滴培养技术是指在覆盖油膜的一定微小体积
的培养环境内对少数定量细胞的一种培养方法。这
项技术的建立对卵母细胞培养［1］、体外受精［2］、胚
胎早期发育［3］，以及多种胚胎操作技术［4］的发展起
到了极大的促进作用。近期一些学者的研究发现，
微滴培养技术还拥有更广阔的应用范围，如该技术
可实现胚胎干细胞的高效传代和对其分化过程的监
控［5］，并在精原干细胞培养和观察［6］以及精子发生
相关过程的研究方面［7］也可取得很好效果。
1 微滴培养技术的主要发展阶段
1963 年，Brinster［8，9］为胚胎培养而创立微滴培
养技术，经过近半个世纪的发展，微滴培养技术曾用
于胚泡内细胞团的培养［10］及对阿米巴滋养体形态
的观察［11］;在检测药物敏感性［12］和对神经元细胞
网状系统动力学［13］进行特性分析时也证明了该方
法的可行性。此外，该技术已成功应用于胚胎、卵子
培养、体外受精技术、胚胎干细胞及精原干细胞培养
等一些重要领域的研究。
1． 1 微滴培养技术在胚胎和卵子发育研究方面的
应用
1980 年报道有科学家利用微滴培养技术培养
小鼠胚泡，并且成功证明了小鼠胚泡合成和释放糖
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
蛋白的原因是由于衣霉素的不敏感性［14］。Choi 和
Landa等［1，4］分别将微滴培养技术成功应用于小鼠
八倍体胚胎的培养和马卵母细胞在体外的成熟作
用。1996 年报道的关于在小鼠胚胎培养方面的文
章指出，科学家通过对囊胚孵化率的研究说明与其
他常规方法比较，微滴培养是一种更优越的培养系
统［3］。同年还有报道指出，在同样时间内未更换培
养液的微滴培养系统和常规培养系统相比，牛的胚
泡的发育率在前者的内部明显偏高［15］。2009 年，
Sharma等［16］阐述了微滴培养技术是一种高效的可
对水牛窦前期卵泡的伸展生长提供立体微环境的新
方法。一系列的研究试验证明微滴培养技术越来越
深入的研究将为胚胎和卵子的体外培养提供更佳的
培养条件。
1． 2 微滴培养技术在体外受精方面的应用
随着体外受精技术的逐渐成熟，许多科学家也
将微滴培养法应用于体外受精技术［17］。早在 1983
年就有文章报道科学家成功将微滴培养技术应用于
体外受精，当时使用的是牛卵母细胞和精子［18］。
2004 年的报道中曾经指出微滴培养系统可以提供
一个含有卵、卵泡细胞和卵泡系列成分在内的一个
重要的排卵环境，从而为下一步的受精做好准
备［19］。2005 年有文章报道称体外的拟生态微滴受
精系统可以减少多精入卵现象，增加潜在的有活力
的胚胎数量，而不减少整体数目上生长繁殖的效
率［20］。一直以来，人们认为猪体外受精过程中发生
多精入卵现象的主要原因是常规方法中将两种配子
进行了共培养，而 Park等［2］通过试验证明微滴培养
技术可以减少猪的体外受精中多精入卵现象，并会
在体外受精过程中获得具有更好特性和染色体核型
的胚胎细胞。因此，体外受精技术将会随着微滴培
养技术的发展而日趋成熟。
1． 3 微滴培养技术在崭新领域的应用
随着微滴培养技术发展，科学家也将其应用到
更多领域。2006 年，该项技术被应用于研究人类圆
形精子向长形精子的分化过程［7］。2010 年 4 月，一
些学者通过试验证实微滴培养技术在人类胚胎干细
胞的培养与分化方面比常规培养技术更为高效，而
且更容易监视早期人类胚胎干细胞的分化过程［5］。
在 2010 年 8 月的一篇报道中，Araki 等［6］将微滴培
养技术应用于精原干细胞的体外培养，并获得成功。
这些都是微滴培养技术在细胞领域的崭新应用，而
且将对胚胎干细胞和精原干细胞的体外培养作出应
有的贡献。
2 微滴培养技术在新领域的应用现状及其
优点
2． 1 微滴培养技术应用于圆形精子向长形精子体
外分化研究
生精细胞体外分化已成为男性辅助生育领域的
一大热点，然而，人类生精细胞体外培养分化的技术
到目前为止还不成熟，继续探索人类生精细胞体外
培养的方法具有十分重要的意义。2006 年有文章报
道研究人员通过使用微滴培养技术探讨梗阻性无精
子症患者(睾丸正常生精)的生精细胞在体外发生分
化的情况［7］，从而探索正常生精细胞向精子分化的条
件，为解决体内发育阻滞的生精细胞(生精阻滞患
者)在体外重新启动分化的难题提供思路和方法。
研究人员分别以普通 HTF 培养液和 Vero 细胞
条件培养液重悬细胞，置于 96 孔板中，用石蜡油
覆盖，将此细胞混合物置于 32℃、5% CO2培养箱中
培养，期间每 24 h观察 1 次［7］。
这种微滴培养技术的优点在于可以实现人睾丸
组织的圆形精子细胞在体外化为长形精子细胞这一
过程，并在此过程中观察长鞭毛的长形精子细胞及精
子、各种圆形细胞(包括圆形精子细胞、精母细胞、精
原细胞、Sertoli 细胞及其他体细胞)等的形态。通过
对长形精子细胞与圆形细胞的计数，从而求得长形
精子细胞比率(长形精子细胞数与长形精子细胞和圆
形细胞总数的比值) ，并发现在添加卵泡刺激素、睾酮
的 HTF培养液中进行睾丸细胞混合培养，24 h 后长
形精子细胞比率较培养前显著增加，从而为探索更佳
的生精细胞向精子的分化条件提供帮助。
2． 2 微滴培养技术应用于人类胚胎干细胞体外
培养
人类胚胎干细胞的培养和分化在细胞治疗、器
官组织移植等领域具有重要应用。2010 年，有报道
称 Aflatoonian等［5］将微滴培养技术成功应用于人类
胚胎干细胞培养。人类胚胎干细胞培养和分化的常
规培养方法是进行内细胞团的共培养，这种共培养
使用的滋养层细胞是由内含一些成纤维细胞生长因
06
2011 年第 9 期 霍龙等:微滴培养技术的新应用
子和灭活的鼠或人类胚胎成纤维细胞组成。但在实
现人类胚胎干细胞分化的常规操作方法中却存在一
些不足。如一些重要的生长因子可能会在培养过程
中被稀释乃至消失，进而对细胞培养产生影响。
研究人员试图利用微滴培养技术解决上述问题，
在 8个细胞系的研究试验中，前两个使用常规方法培
养的细胞系(每个培养皿中加 10 mL培养液) ，另外 6
个细胞系使用微滴培养技术(在每滴 50 μL培养液的
表面覆盖矿物油) ，通过不同的条件设置对照试验。
在建立细胞系的过程中，研究人员对所培养细胞进行
冷冻，解冻，染色体的核型分析以及免疫染色等多项
操作过程，并发现在使用微滴培养法后，干细胞系在
每个胚胎内的比例从起初的 4． 8%上升到 16%［5］。
研究证明，微滴培养法能够更好的维护滋养层细
胞并使人类胚胎干细胞实现高效传代。在人类胚胎
干细胞的分化方面的应用比常规培养方法更具有优
势，也更容易监控早期人类胚胎干细胞的分化过程。
2． 3 微滴培养技术应用于精原干细胞体外培养
2010年 8月，有文章报道微滴培养技术被成功
应用于小鼠精原干细胞的体外增殖培养［6］。长期以
来，精原干细胞的长期体外培养一直受到科学家的关
注，因为人们对生精上皮细胞内精原干细胞的形态和
生物学特性了解甚少，而它的数目在动物体内含量也
较少，如仅占小鼠睾丸细胞的 0． 01%，并且如何建立
培养技术来获得纯度较高的精原干细胞也一直处于
研究状态之中［21，22］。由于精原干细胞的体外长期培
养一直受到条件限制，其体外培养的生长过程也一
直未被人们观察到。因而微滴培养技术在精原干细
胞培养方面的最新应用为研究人员带来很大惊喜，
将微滴培养技术中的优势之处应用于精原干细胞培
养会使我们对精原干细胞的研究更为深入。
在相关试验中，研究人员使用小鼠胚胎成纤维
细胞作为滋养层细胞，含 10%胎牛血清的 DMEM作
为培养液，利用显微操作技术转移精原干细胞。通
过试验发现，在 5 μL 的微滴培养液体积内，在起初
培养生殖干细胞的数目从 3 增加到 40 的过程中，增
殖所获得的细胞数量也会随之增加［6］。当只有少
量人体睾丸组织可用来做细胞培养时，如果需要对
细胞进行活体检测，常规的富集的方法对此可能并
不合适，因为样品中一些重要的成分会在富集过程
中丢失。但应用微滴培养法可以在富集过程中避免
丢失问题，通过一些显微操作技术还可以实现对确
定数目的细胞进行相关操作［5］。这种方法可以更
容易地从体细胞中挑选出干细胞，并且可以实现细
胞的高效增殖［6］。
研究指出，将微滴培养技术应用于精原干细胞
的体外培养过程，人们可更直观地了解精原干细胞
的生长过程。由于微滴培养技术是采用一定体积内
培养特定细胞数目的培养系统，因此，通过定期地观
察和分析，还可以收集定量性的数据［8］。同时，有
试验证明微滴培养系统有利于细胞分选［23］，尤其是
在人们对精原干细胞的体外培养过程了解较少的情
况下，希望微滴培养技术在精原干细胞培养方面的
进一步成熟会使我们更深刻地了解精原干细胞的体
外生长机理和自我更生及分化的条件。
虽然微滴培养法与常规培养法使用相同的培养
液，但它还具有常规培养法不具备的其他优势。如
微滴培养法，可实现在单位体积中培养适当数量的
细胞，从而保证细胞的营养需要，防止因培养液过多
而导致的一些干细胞发育过程中自身分泌的有效因
子的稀释现象，维持培养液滴正常的渗透压。这无
疑都将为细胞的体外培养提供更好的环境和条件。
此外，微滴培养技术的优点还来源于覆盖油层，
油层避免了污染和培养液蒸发的损失，还起到了稳
定温度和 pH 值的作用。研究表明，覆盖油层还可
以起到对有毒物质洗涤的作用，同时可以防止外界
的污染［24］。覆盖油滴可以保证培养液内细胞的营
养需要，维持培养液滴正常的渗透压，从而实现一个
较佳的细胞生长环境。微滴培养法将为细胞体外培
养过程的观测和高纯的细胞提取作出应有的贡献。
3 展望
综上所述，微滴培养技术在多领域的研究应用
说明该种方法相关的培养条件和优势之处将不仅仅
适合于胚胎、卵母细胞、圆形精子、胚胎干细胞和精
原干细胞，它还可以更广泛地应用于来自其他组织
的细胞研究。如有的试验将微滴培养技术成功应用
于进行核移植的牛卵母细胞的培养［25］，对克隆动
物、转基因动物等研究产生重大影响。因此，这一培
养方法将为更多种类的细胞培养提供一个新的技术
手段，从而直接应用到生物学与医学的相关研究当
16
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
中。我们预期，微滴培养技术将在各类干细胞的挑
选、纯化、胚胎操作和精原干细胞操作等研究中发挥
更大的作用。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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