全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·研究报告·
收稿日期：2008-09-10
基金项目：河南科技学院青年科学基金项目（20065053）
作者简介：李任峰（1978-），男，河南省驻马店人，讲师，从事微生物分子生物学研究；E-mail：lirenfeng@sina.com
通讯作者：王三虎，教授，E-mail：wangsanhu@hist.edu.cn
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌
（Actionobacillus pleuropneumoniae，App）引起的猪呼
吸系统的一种严重的接触性传染病，以急性出血性
纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺
炎为特征 [1]。
App 分为两个生物型， 生物Ⅰ型和生物Ⅱ型。
生物Ⅰ型为“脲酶”阴性菌，而从猪体内分离到的通
常为生物Ⅱ型 [2]。 目前，对于该菌致病性的研究主
要集中在 APXⅠ、APXⅡ、APXⅢ 3 种毒素及其荚
膜多糖、LPS 的抗原性等方面 [3]。 而对其运动性和侵
染细胞的机制研究报道甚少。鞭毛是大多数革兰氏
阴性杆菌所具有的运动器官，在细菌的致病性方面
发挥着重要作用 [4]，国内对 App 鞭毛蛋白的研究尚
未见报道。 依据 App 与大肠杆菌（Escherichia coli）、
沙门氏菌（Salmonella）、痢疾志贺氏细菌（Shigellosis）
鞭毛蛋白 flic 基因的高度同源性 [5]，设计一对引物，
运用 PCR 方法扩增出 App 鞭毛蛋白 flic 基因，并将
其克隆到原核表达载体 pGEX-KG 中， 实现了在大
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 flic基因的原核表达与
生物学活性分析
李任峰 1 田香勤 2 何启盖 3 王三虎 1 郑玉姝 1 胡建和 1 赵坤 1
（1河南科技学院动物科学学院，新乡 453003；2新乡医学院形态学研究室，新乡 453003；3华中农业大学动物医学院
农业微生物学国家重点实验室动物病原分室，武汉 430070）
摘 要： 以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型菌株基因组为模板，根据其鞭毛区与其它细菌高度同源性设计引
物，利用PCR方法扩增鞭毛蛋白基因flic片段，将其亚克隆到pMD-18T载体中并进行PCR和酶切鉴定，再将其亚克隆
与载体pGEX-kG分别双酶切和连接，构建重组表达载体pGEX-flic，并将其转化大肠杆菌工程菌BL21进行原核表达。结
果表明，目的基因片段长度为528bp，在大肠杆菌BL21中获得成功表达，且表达蛋白能与猪抗APP血清发生反应。为进一
步研究细菌鞭毛的抗原性及其他功能提供参考。
关键词： 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 鞭毛蛋白 诊断抗原
Analysis of Biologic Activity of flic Gene from Actionobacillus
pleuropneumoniae
Li Renfeng1 Tian Xiangqin2 He Q gai3 Wang Sanhu1 Z eng Yushu1 Hu Jianhe1 Z ao Kun1
（1Veterinary Medicine College，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003；2Morphology Laboratory，
Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003；3Division of Animal Infectious Disease，National Key Laboratory of Agricultural
Microbiology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070）
Abstract： Theflic gene ofApp was obtained by PCR based on highly homology withEsc erichia coli，
Salmonella，Shigellosis. Then it was legated to pMD-18T vector. The recombinant plasmid was identified by enzyme and
sequence analysis. The 528 bp fragment offlic gene was succ ssfully cloned into pGEX-KG vector，then the recombinant
plasmid was transformed intoE.coli BL21and expressed induced by IPTG. The western blot showed the reactivity of the
recombinant protein with swine anti-APP serum. These results provided reference for research on antigenicity and other
function of flic of bacteria.
Key words： Actionobacillus pleuropneumoniae Flagellin Diagnosis antigen
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
肠杆菌 Bl21 中表达，为研究 App 的运动性和致病机
理以及临床诊断奠定了理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和载体 App 血清 I 型菌株 AppⅠ，由
本研究室保存，大肠杆菌 DH5a，大肠杆菌 Bl21（DE3），
pMD-18T 载体及原核表达载体 pGEX-KG 均为本室
保存。
1.1.2 工具酶及主要试剂 限制性内切酶 、EX-
TaqDNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶等分子生物试剂购
自大连生物工程有限公司 ；DNA 凝胶回收试剂盒
购自上海生物工程有限公司，其它所有试剂均为分
析纯试剂。
1.1.3 培养基 LB 培养基等均按常规方法配制。
1.1.4 PCR 引物 根据 App 鞭毛蛋白的 N 端序列
以及 C 端与其它细菌 （Escherichia coli，Salmonella，
Shigellosis）高度同源性 ，利用 Primer 5.0 软件设计
一对引物， 上游引物 p1：5-ATCGAATTCGG ATGA-
CGCAGCGGGTCAGTC-3；下游引物 p2：5-AGGGA-
GCTCTTAGATCCGGCCAGTATCAGGG-3。 送于上海
生物工程有限公司合成以上特异引物。
1.2 方法
1.2.1 App 基因组 DNA 的提取 挑取 App 血清Ⅰ
型单菌落， 接种于 2 ml 液体培养基中，37℃培养过
夜，从中取出 1 ml，8 000 r/min，离心 5 min，弃上清，
沉淀悬浮于 1 ml TE 中 ， 加 30 μl 10 ng/ml 的溶菌
酶， 置于 37℃ 2 h； 加入 2 M NaCl 50 μl，10% SDS
110 μl，10 mg/ml 的蛋白酶 K5 μl，50℃过夜； 用酚 ∶
仿 ∶异戊醇（100∶99∶1）抽提两遍，取上清，然后用 0.6
倍体积异丙醇沉淀，再用 75%乙醇洗 2 次，抽干后
用 30 μl TE 溶解沉淀，保存于-20℃。
1.2.2 PCR 扩增反应条件 flic 基因扩增条件 ：
94℃预热 5 min；94℃变性 1 min，53℃变性 40 s，72℃
延伸 1 min，35 个循环，最后再 72℃延伸 10 min。
1.2.3 PCR 产物的回收，连接及酶切鉴定 PCR 扩
增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切
下目的条带， 按 DNA 凝胶回收试剂盒说明进行回
收，回收后与 pMD-18T 载体连接，命名为 pMD-18T-
flic，然后转化大肠杆菌 DH5a，经蓝白斑筛选得到阳
性重组子，酶切鉴定后获得重组质粒。
1.2.4 表达质粒的构建及酶切鉴定 首先用 EcoR
Ⅰ和 XhoⅠ双酶切重组质粒 pMD-18T-flic， 回收大
小为 528 bp 的片段， 再用 EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切
pGEX-KG 载体 ， 连接后得到重组表达质粒 pGEX-
flic，并进行酶切鉴定。
1.2.5 转化大肠杆菌 BL21 用所得的重组表达质
粒 pGEX-flic 转化大肠杆菌 BL21， 涂布含有卡那霉
素的 LB 平板，37℃温床培养，24 h 后将菌种接种加
有卡那霉素的 LB 液体培养基中 ，37℃震荡培养 ，4
h 后取菌液 100℃加热 5 min，作为模板 ，进行 PCR
筛选，获得阳性重组大肠杆菌。
1.2.6 蛋白的表达及 SDS-PAGE 分析 将过夜培
养的阳性菌悬液按 1∶10 接种 LB 培养基，37℃，250
r/min 震荡培养至 OD600 为 0.5~0.6 时， 加入终浓度
为 1 mmol/L 的 TPTG，诱导 4 h，3 000 r/min 离心 10
min，菌体重悬于 PBS 中，超声波破碎（40%功率，破
碎 8 min），然后 10 000 r/min 4℃离心 10 min，将上
清和沉淀分别与上样缓冲液混合后 ，100℃加热 10
min，进行 12%SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色。
1.2.7 Western blot 检测 将表达的蛋白质进行
SDS-PAGE 电泳后，转移到硝酸纤维素膜，用含 5%
脱脂牛奶的 PBS-Tween20 进行封闭 1 h，洗涤后，以
猪抗 APP 血清为一抗，37℃作用 1 h， 洗涤 3 次后，
加入 HRP 标记羊抗猪 IgG 抗体， 继续作用 1 h，洗
涤后，用 TMB 显色。
2 结果
2.1 flic 基因的 PCR 扩增结果
flic 基因在 PCR 扩增后 ， 明显可见一条约为
528bp 的条带（图 1），与预期大小相符，说明 AppⅠ
菌株中可能含有 flic 基因，初步确定扩增出的片段
为目的基因片段。
bp
2 000
750
500
250
100
1 2 3 4
图 1 App flic 基因的 PCR 扩增结果
1.DNA 分子量标准 DL2000；2，3.flic 基因的 PCR
扩增产物（528 bp）；4.空白对照
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2009年第 2期 李任峰等：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 flic基因的原核表达与生物学活性分析
2.2 重组质粒 pMD-18T-flic 的酶切鉴定
重组质粒的电泳图谱（图 2）可以看出，经 EcoR
Ⅰ和 XhoⅠ双酶切后得到长约 2 600 bp 和 528 bp
的两条带，均与预期大小相符，初步表明 ，flic 基因
已被成功克隆。
2.3 重组表达质粒 pGEX-flic 的酶切鉴定
以重组表达质粒 pGEX-flic 为模板， 扩增后在
约 528 bp 处有一条带， 再用 EcoRⅠ和 XhoⅠ对重
组质粒 pGEX-flic 进行双酶切，结果可见在约 5 000
bp 和 528 bp 处分别有一条带（图 3）。
2.4 flic 基因在大肠杆菌 BL21 中的表达及鉴定
将 pGEX-flic 重组表达质粒转化大肠杆菌 BL21
（DE3）， 用 1 mmol/LTPTG 诱导表达 4 h，SDS-PAGE
分析，基因工程菌菌体裂解物中检测出分子质量为
50 kD 的表达产物，与预期结果相符合（图 4）。Wes-
tern blot 结果表明，该重组蛋白能与猪抗 APP 血清
发生反应（图 5）。
3 讨论
鞭毛是细菌的一种特殊结构， 约半数的杆菌、
极少数球菌和所有的螺旋菌及弧菌都有鞭毛，不但
与细菌的运动有关，而且在细菌的感染与免疫及细
菌分类鉴定等方面发挥重要作用。由于研究技术的
限制， 人们最早研究鞭毛是从它的染色方法开始
的，随着现代分子生物学技术的飞速发展 ，人们开
始从基因水平来研究鞭毛作为运动器官的分子机
制及其毒力相关基因，这方面研究较多的是鞭毛蛋
白的中央区段和 flic 基因。 Maynarelli [6]根据莱姆病
疏螺旋体鞭毛蛋白氨基酸序列同其它菌株鞭毛蛋
白有很高的同源性，尤其是 N 端和 C 端（但在其中
央区，氨基酸序列及长度差别很大），构建了重组鞭
毛蛋白中央区，并以此为抗原诊断莱姆病 ，其敏感
15 000
5 000
2 500
1 000
250
2 000
1 000
750
500
250
100
1 2 3 4
bp bp
图 2 pMD-flic 的酶切鉴定
1.DNA 分子量标准 DL15000；2.pMD-flic XhoⅠ酶切产物 ；3.pMD-
flic/ EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切产物；4.DNA 分子量标准 DL2000
15 000
5 000
2 500
1 000
250
2 000
750
500
250
100
1 2 3 4
bp bp
图 3 pGEX-flic 重组质粒的酶切鉴定
1.DNA 分子量标准 DL15000；2.pGEX-KG EcoRⅠ和 XhoⅠ双
酶切产物 ；3.pGEX-flic EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切产物 ；4.DNA 分
子量标准 DL2000
M 1 2 3 4kD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
N 1 M
kD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
图 4 pGEX-flic 表达物的 SDS-PAGE 电泳结果
1.pGEX-KG 质粒转化菌的表达产物 ;2,3,4.pGEX-flic
质粒转化菌的表达产物 ;M.蛋白质分子量标准
图 5 pGEX-flic 表达物的 Western blot 分析
N.pGEX-KG 空载体对照 ;1.pGEX-flic;M.蛋白质分子量标准
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
性及特异性均优于全细胞抗原诊断方法。 吕冰等 [7]
对中国莱姆病螺旋体 （Borrilia garinii）基因种参考
菌株 PD91 的鞭毛蛋白中央区编码基因进行克隆表
达，证明重组蛋白具有抗原性，为我国莱姆病的血
清学诊断提供了帮助。
在 flic 基因研究方面，Reid 等 [8]对所分离的 15
株致病性大肠杆菌的 flic 基因进行了克隆测序后，
并对其中的 H6 和 H7 菌株的 flic 基因进行比较表
明，它们的等位基因有一个嵌合结构，这一结构是
由不同菌株间 DNA 片段的横向转移所产生的 ，这
种 H7 基因序列紧密的相似性是由于在 flic 等位基
因间发生了交换。系统发生关系分析表明，O157∶H7
和 O55∶H7 两种血清型菌株的 flic 序列几乎完全相
同， 但与那些表达 H6 和 H2 鞭毛抗原的大肠杆菌
相比差别很大。 此外，一株山梨醇发酵的非运动型
克隆株 O157 能很快产生多个 flic 突变， 推测这可
能是鞭毛 flic 基因表达受到抑制的结果。 Chua[9]对
假单胞杆菌强毒株 KHW 的 flic 基因进行同源基因
缺失突变，从而成功构建 KHW flic 突变株。 小鼠鼻
内感染实验也证实了 flic 基因确实与假单胞杆菌
的毒力和致病性密切相关。Wei[10]曾经报导，沙门氏
菌的鞭毛蛋白基因的末端区域有很高的保守性，对
鞭毛的运动起调节作用， 而中央区的保守性很低，
一般认为它与鞭毛蛋白抗原的可变性有关。
目前， 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌共分 15 个
血清型， 各个血清型之间表型和基因型差异较大，
而国内对其鞭毛蛋白的研究尚未见报道。本研究对
App 鞭毛蛋白 flic 基因进行了克隆及序列分析，并
实现了在大肠杆菌 BL21 中表达， 为研究 App 基因
工程疫苗提供了理论依据，同时也为将 flic 重组鞭
毛蛋白作为抗原对 App 进行血清学诊断打下了坚
实的基础。
参考文献
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版社，2003，119.
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