全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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"&*#%$*"+
!!!!!!!!!!!!!!!
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$
#",-+"+
%
.
,/001,#"""*$"!,!"#$,"&,#%$
收稿日期$
!"#$*"$*"!
&修改稿收到日期$
!"#$*"+*%"
基金项目$江苏省自然科学基金"
23!"#!-&!
#
作者简介$王晓宇"
#)-!(
#!男!博士!副研究员!主要从事植物病害生物防治抗病基因克隆及转基因应用和研究(
4*56/7
$
89
:
;)))
!
#!+,<=5
转鞭毛蛋白基因水稻细菌性条斑病抗性研究
王晓宇#!陈志谊#!刘文真!!罗楚平#!张荣胜#!周华飞#
"
#
江苏农业科学院植物保护研究所!南京
!#""#$
&
!
中国水稻研究所!杭州
%#"""+
#
摘
!
要$该研究从生防菌枯草芽胞杆菌
20*)#+
中克隆了鞭毛蛋白基因!利用转基因载体
>
?@A2B@#%""
转入水稻!
筛选得到
)&
株阳性转基因植株(分子检测结果表明!有
#!
个转基因株系可检测到目的基因的表达(随后抗病性
鉴定表明!有
%
个转基因株系对水稻细菌性条斑病具有较高的抗性(该研究为目前水稻抗细菌性条斑病转基因研
究拓宽了可应用基因资源的范围(
关键词$鞭毛蛋白基因&水稻细菌性条斑病&水稻&枯草芽胞杆菌
中图分类号$
C-&)
文献标志码$
@
$%&#&()*%"1$/#2&3&/$4&(
5
6$)
+
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5
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JIOMIH6RN/
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!?K/16E6S/=167Q/B10S/SHSN
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I61
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;K=H%#"""+
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67&/(*
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B1SK/00SHW
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R76
P
N7/1
P
N1N<7=1NWRU=5Y/=<=1SU=70SU6/120*)#+
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860/1SU=*
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SU610
P
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P
N1/<7/1N08NUN=YS6/1NW,T?Q61W
Q[*T?QSN0S8NUN<6UU/NW=HSS=WNSN>
UN00/=1=RS6U
P
NS
P
N1N061W#!SU610
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UN00/=1=R
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2"3
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1
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P
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H0NWS=<=1SU=7W/0N60N
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Y60KNW7/
P
KS=1SKN/UHS/7/S
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8%
9
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$
R76
P
N7/1
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N1N
&
+",)-./.,".0
1
2"3
>
Z,.0
1
2$#.%"
&
U/&
!"#$%%&&()$%$
!!
水稻细菌性条斑病"
26!
2LX
!
简称细条病#是由
+",)-./.,".0
1
2"3
>
Z,.0
1
2$4
#.%"
"简称
G==?
#侵染引起的细菌性病害(该病是
目前威胁中国南方稻区水稻生产的重要病害!也是
中国美国和澳大利亚等重要的检疫性水稻病害(
据估计!当气候条件适宜时!水稻细条病能在感病品
种上引起
#^
"
!^
损失!严重时可达
$"^
"
+"^
)
#
*
(对水稻细条病的防治主要有化学防治生
物防治及抗性育种(其中发掘利用新抗源!培育抗
病品种是控制该病害最经济有效的途径(
克隆细条病抗病基因!了解这些基因的抗病机
制!对于防治细条病减少经济损失具有重要的理论
和现实意义(目前在水稻细条病抗性基因研究方
面!国内外目前少有报道(与其亲缘关系最近的水
稻白叶枯病菌!已从水稻中找到
+
个抗性基因!而水
稻细条病却未能从水稻中克隆到抗性基因)!*%*(
JK6=
等)$**从玉米中克隆到一个抗性基因
56.#
!在
将其转入水稻中!接种水稻细条病菌后!转基因植株
叶片会产生强烈的过敏反应!从而限制病菌的进一
步侵染(谢学文等将
56.#
基因转入水稻!转基因
植株对水稻细条病菌可以产生过敏性抗病反应)+*-*(
本研究即针对抗细条病基因资源的匮乏问题!拟将
来源于生防枯草芽胞杆菌中的基因转入水稻!以期
获得抗细条病水稻植株!从而为利用各种有价值的
外源基因应用于水稻细条病的抗性育种提供一个有
益的尝试和探索(
本实验室筛选的生防菌枯草芽胞杆菌
20*)#+
!
其本身对水稻无致病性!和植物之间是良性互作关
系(陈志谊等)&*报道叶面喷施拮抗菌
20*)#+
后可
以诱导水稻植株内一些与抗病性有关酶类活性大幅
度提高!从而增加了水稻抵御病原菌侵入蔓延的能
力(本实验利用前期从生防菌
20*)#+
中克隆到的
鞭毛蛋白基因!将其转入水稻!以期得到抗病植株(
这一研究工作在为阐明生防菌鞭毛蛋白诱导水稻抗
病性的机制做深入探索的同时!也为水稻抗病育种
提供一个新的基因资源!为最终获得高抗多抗持
久抗性的抗病新品种奠定基础(
#
!
材料和方法
;,;
!
实验材料
植物转化载体
_I
#
%
>
?@A2B@#%""
由中国
水稻所馈赠!克隆载体
>
A_#&*[
购自
[6]6U6
公
司!转基因受体材料为日本晴"
70
1
2"")$8"L,0
>>
,
9
"
:
.,$#">>
=1Y6UN
#(
;,<
!
转基因载体的构建
用于构建双元转化表达载体的质粒由
[*_E@
改造而来!其中除
[*_E@!Y
>
重复序列"
L2
和
Q2
#真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子
%X
"
>
%X
#和终止子外!还有在原核生物"细菌#中
作为选择标记使用的
,
:
)
$
和在真核生物"植物#中
作为选择标记使用的
-
:
)
%
(用于选择的抗生素均
为卡那霉素"
35
#和
I F`
(作为目的基因使用的
鞭毛蛋白基因
*
%"
插入在
>
?@A2B@#%""
质粒的
>
%X
和
[*_E@!Y
>
重复序列
Q2
之间的多克隆
酶切位点上!采用的转基因载体
>
?@A2B@#%""
上
含有一个
%X
启动子和终止子(质粒
>
?@A*
2B@#%""
经过
+-.
$
酶切后自连得到
-,)]Y
重组
质粒片段(设计引物添加酶切位点
!"/I
$
和
;"%
$
扩增
%X
启动子和终止子!扩增得到
_E@
片段
连入
>
A_#&*[
载体(最后得到一个含有
!"/I
$
和
;"%
$
酶切位点的
%X
启动子和终止子克隆
>
A_#&*[
$
%X
(
将
*
%"
基因用
+-.
$
酶切!将
>
A_#&*[
$
%X
用
+-.
$
单酶切并用去磷酸化酶
?B@T
处理后回收
%,+]Y
大片段(将此大片段和酶切回收的
*
%"
基
因一起进行连接(最后酶切验证并测序得到
>
A_#&*[
$
%X
$
*
%"
重组片段(
将
>
A_#&*[
$
%X
$
*
%"
重组片段用
;"%
$
酶切
位点切下
%X
$
*
%"
基因片段!同时用
;"%
$
单酶切
>
?@A2B@#%""
载 体!二 者 混 合 连 接 即 可 得 到
>
?@A2B@#%""
$
*
%"
重组植物表达载体"图
#
#(
;,=
!
基因转化水稻方法
基因转化参照
I/N/
等)*的方法并加以修改(
取开花后
#!
"
#W
的稻穗脱粒!表面灭菌后接种在
E2
培养基上!
+a
下暗培养诱导愈伤组织(约

"
-W
后取愈伤组织在相同条件下继代培养!用于
共培养(农杆菌于含
"5
P
%
L35
的
`A
平板上
划线!
&a
下暗培养
%W
!用金属匙收集农杆菌菌
体!悬浮于共培养
?A
液体培养基中!调整菌体浓
度至
O_
+""
为
",%
"
",
!加入乙酰丁香酮"
@X
!终浓
度为
#""5
P
%
L
#!即为共培养转化水稻用的农杆菌
悬浮液(将继代培养
$W
的愈伤组织浸于此菌液
中!
"5/1
后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液!随
即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上!于
!+a
下暗
培养
!
"
%W
(共培养后的愈伤组织在含
"5
P
%
L
潮霉素的筛选培养基上!
+a
下暗培养
#$W
!再转
到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选
#$W
(然后选
择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有
"5
P
%
L
潮霉素的分化培养基上!暗培养
%W
后转至
#K
%
W
光照条件下培养!再生的小苗在
#
%
!AX
上生根壮苗
!
周左右(选择高约
#"<5
根系发达的小苗!按编
号移栽入土(
;,>
!
目的基因的分子检测
从转基因植株叶组织提取水稻基因组
_E@
!设
计引物扩增
*
%"
基因(
T?Q
扩增程序为
)a
下

5/1
&
)a
下
$0
!
+a
下
$0
!
-!a
下
!5/1
!
%
个循环&
-! a
下
#"5/1
(上游引物
bL@*b#
"
c*
@[F@F@@[?@@??@?@@[@[?F?*%c
#!下游引
物
bL@*Q#
"
c*[[@@??[[[?@F?@@[[F@@*
F@*@?[*%c
#(用
Xd[=S67QE@B0=76S/=1X
:
0SN5
试剂盒"
TU=5N
P
6
#提取
[
!
代转基因植株叶片总
QE@
!按照
TU/5N*X>
SQ[*T?Q
试剂盒"
[636*
Q6
#说明书合成
<_E@
并进行半定量
Q[*T?Q
分
析!所用引物为以上
bL@*b#
和
bL@*Q#
(
%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
王晓宇!等$转鞭毛蛋白基因水稻细菌性条斑病抗性研究
;,?
!
转基因植株抗病性鉴定
抗病性鉴定在江苏农业科学院隔离实验圃进
行(转
*
%"
基因水稻
[
#
代种子播种在病害流行区
隔离田块中!用人工接种法测定转
*
%"
基因水稻株
系对细条病的抗病型(接种菌株为本实验室分离得
到的强致病菌株(接种后
-W
观察接种植物的发病
情况!接种后
!#W
统计发病植株的病斑长度"取平
均值#!采用郭亚辉等)#"*分级标准稍作修改$病斑长
大于
#"55
为感病!病斑长在
+
"
#"55
之间为中
抗!病斑长在
55
以下为抗病!无病斑为高抗(
!
!
结果与分析
<,;
!
转基因载体的构建和转基因植株分子检测
根据材料和方法
;,<
中转基因载体构建方法!
得到
>
A_#&*[
$
%X
$
*
%"
重组片段(将
>
A_#&*[
$
%X
$
*
%"
重组片段用
;"%
$
酶切位点切下
!]Y
左右
%X
$
*
%"
基因片段!同时用
;"%
$
单酶切
>
?@A*
2B@#%""
载体回收约
&,)]Y
大片段!将二者混合连
接得到
>
?@A2B@#%""
$
*
%"
重组植物表达载体"图
#
#(将此重组转基因载体转入农杆菌!通过农杆菌
介导!共培养转化水稻愈伤组织!潮霉素抗性培养基
筛选后得到转基因植株(筛选得到
)&
株阳性转基
因植株"以
D#
"
D)&
依次编号#并进行
T?Q
检测
发现!
$%
株能扩增得到
)&-Y
>
的
*
%"
基因"图
!
#&
选取其中农艺性状与对照日本晴相近的转基因株系
分析
*
%"
基因表达情况(以真核生物中看家基因
<=#
!
为内参!采用半定量
Q[*T?Q
检测转基因株系!
结果有
#!
个转基因株系扩增到
*
%"
基因"图
%
#(
图
#
!
转基因载体构建
b/
P
,#
!
?=10SUHP
N1/+%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
!
!
部分转基因株系
*
%"
基因的
T?Q
扩增结果
A,_L!"""
&
?3,
日本晴&
#
"
#),
转基因植株
b/
P
,!
!
T?Q6167
:
0/0=R
*
%"
P
N1N/1SU610
P
N1/<7/1N0
A,_L!"""
&
?3,70
1
2"")$8"L,0
>>
,
9
"
:
.,$#">>
=1Y6UN
&
#
"
#),SU610
P
N1/<
>
761S
图
%
!
部分转基因株系
*
%"
基因的半定量
Q[*T?Q
分析
A,_L!"""
&
?3,
日本晴&
#
"
#&,
转基因植株
b/
P
,%
!
XN5/*
H61S/S6S/ZNQ[*T?Q6167
:
0/0=R
*
%"
P
N1N/1SU610
P
N1/<7/1N0
A,_L!"""
&
?3,70
1
2"")$8"L,0
>>
,
9
"
:
.,$#">>
=1Y6UN
&
#
"
#&,[U610
P
N1/<
>
761S
图
$
!
转
*
%"
基因水稻细条病抗性分析
#,
健康水稻"对照#&
!,
非转
*
%"
基因水稻&
%
"
-
分别为
D#

D!#

D#)

D#!

D!-
转
*
%"
基因水稻株系
b/
P
,$
!
QN0/0S611
2"3
>
Z,.0
1
2$#.%"/1SU610
P
N1/<7/1N0
#,IN67SKU/"
<=1SU=7
#&
!,E=1*SU610
P
N1/&
%
"
-,[U610
P
N1/<7/1ND#
!
D!#
!
D#)
!
D#!
!
D!-
<,<
!
转基因水稻细条病抗性分析
转基因水稻植株水稻细条病抗性鉴定在江苏农
业科学院实验圃进行(水稻细条病的抗性鉴定结果
显示!转基因植株
D#

D#)

D!#
与未转基因水稻
相比!转基因单株的平均病斑长小于
55
!未转基
因水稻植株的平均病斑长为
#",)55
!转
*
%"
基因
水稻病斑长度明显变短!说明这
%
个株系对水稻细
条病具有较高的抗性"图
$
!表
#
#(而
D#!
水稻株
系平均病斑长
#",+55
!与未转基因水稻相比很接
近!说明其未能获得对水稻细条病的抗性(其余株
系平均病斑长从

到
),$55
不等!其对水稻细条
病的抗性水平属于中抗"表
#
#(
%
!
讨
!
论
鞭毛蛋白是一个研究较深入的蛋白!其激活植
物防御反应的机制已阐述得较为清楚(在拟南芥和
番茄中!人们揭示细菌通过识别鞭毛蛋白
E
端的保
守序列!继而感知细菌的侵染(其
E
端保守序列包
含
!!
个氨基酸!人工合成的
!!
个氨基酸片段
*
%
>
!!
具有和完整鞭毛蛋白一样的生物活性)##*(
F=5N;*F=5N;
等)#!*用遗传学方法得到一个鞭毛蛋
白感知
!
号"
bLX!
#拟南芥突变体!并用图谱定位了
bLX!
位于

号染色体(鞭毛蛋白受体"
bLX!
#富含
亮氨酸重复序列"
LNH>
N6S
!
LQQ
#!还含
-%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
王晓宇!等$转鞭毛蛋白基因水稻细菌性条斑病抗性研究
表
;
!
转
7
*$
基因水稻细条病抗性
[6Y7N#
!
QN0/0S611
2"3
>
Z,.0
1
2$#.%"/1SU610
P
N1/<7/1N0
抗性测试株系
[N0S7/1N
平均病斑长
@ZNU6
P
N7N0/=1
7N1SK
%
55
抗性
QN0/0S6<1N
日本晴
70
1
2"")$8"L,0
>>
,
9
"
:
.,$#">>
=1Y6UN
#",) X
R76*D# $," Q
R76*D% +,) AQ
R76*D$ &,- AQ
R76*D- -,% AQ
R76*D#" -,) AQ
R76*D## ),! AQ
R76*D#! #",+ X
R76*D#$ -,$ AQ
R76*D#+ ,& AQ
R76*D#) %,% Q
R76*D!" ," AQ
R76*D!# %,$ Q
R76*D!! +,& AQ
R76*D!$ +,# AQ
R76*D! -, AQ
R76*D!- ),$ AQ
R76*D%$ +,- AQ
R76*D%& &,% AQ
!!
注$
X,
感病&
Q,
抗病&
AQ,
中抗(
E=SN
$
X,XN10/S/ZN
&
Q,QN0/0S61&
AQ,ANW/H5UN0/0S61有一个胞外丝氨酸%苏氨酸激酶位点(随后的研究
显示
LQQ
和胞外丝氨酸%苏氨酸激酶活性对其与鞭
毛蛋白的特异性结合是必须的(不同植物中识别鞭
毛蛋白的位点不同!例如在番茄中!一个
#
个氨基
酸的鞭毛蛋白片段
*
%
>
#
就可以激活防御反应!而
在拟南芥中!则必须大幅提高
*
%
>
#
的浓度才可诱
导抗病反应(水稻可识别
*
%
>
!!
!但
*
%
>
!!
诱导的
抗病反应要远弱于完整鞭毛蛋白!这表明水稻中鞭
毛蛋白受体识别位点与拟南芥有较大区别)#%*(本
研究应用前期克隆到的枯草芽胞杆菌
20*)#+
鞭毛
蛋白基因"待发表#!转入水稻后获得了抗水稻细条
病的转基因水稻株系!表明在水稻中!
bLX!
可以识
别
20*)#+
鞭毛蛋白基因继而激活抗病反应!从而使
植物获得抗病性(这一研究结果提示在对水稻细条
病的防治中!转鞭毛蛋白基因水稻可以成为一种潜
在及有前景的手段(未来可通过多种不同机理抗病
基因组合的转基因育种策略!丰富水稻细条病的抗
病基因资源(
鞭毛蛋白通过类受体蛋白激酶以及丝裂素激活
蛋白激酶"
A@T3
#参与信号传导途径!从而诱导激
发植物防御反应)#$*#*(利用鞭毛蛋白这类激活蛋白
可以获得高效广谱的抗病植物!甚至抗虫抗逆品
种(
XK6=
等)#+*将水稻白叶枯病菌"
+",)-./.,"
.0
1
2"3
>
Z,.0
1
2"3
#的
-0
*
?
基因转化水稻愈伤组
织!结果显示转
-0
*
?
基因水稻白叶枯病菌的生长
明显受到抑制!且转基因水稻在
[
"

[
#
和
[
!
代对
白叶枯病有较好的抗性!并对水稻稻瘟病表现持续
广谱的抗性!相关抗病基因的表达水平都有所提高(
C/H
等)#-*将稻瘟菌蛋白激发子基因
:
3/@#
转化水
稻!获得了转基因植株!
:
3/@#
的表达提高了水稻
对稻瘟病的抗性(在转基因水稻中防御相关基因苯
丙氨酸解氨酶的表达水平升高和脯氨酸含量增加(
本研究中转鞭毛蛋白水稻获得了对细条病的抗
性!但对水稻纹枯病"数据未列出#则无抗性(对于
鞭毛蛋白激活的植物抗病途径!一般认为是植物自
身的免疫系统!但为何这一激活抗病系统在对抗不
同病原菌时会有显著差异!是否与病原菌可产生抑
制抗病途径的机制有关+ 或者在对抗不同病原菌
中!鞭毛蛋白激活的植物抗病途径并不尽相同+ 对
于这些深层机理还需大量细致和深入的工作(
对鞭毛蛋白基因来说!其本身并无杀菌抗病功
能!作为调节基因!下游抗病基因的表达只需一定量
的
*
%"
基因表达即可激活!因此其在植物中的表达
强度和转基因抗病性无相关性)#&*!所以无法通过增
加其在植物中的表达活性或拷贝数来提高转基因植
物抗病性(要高效利用该类激活蛋白!必须深入研
究其作用机理(对于大多数生防枯草芽胞杆菌来
说!与水稻是良性寄生关系!其本身对水稻无害!因
此进一步阐明转
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基因水稻抗水稻细条病机理将
使人们从另一个角度更深入理解水稻生防机制(
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