全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-27
基金项目:国家重点基础研究发展计划973项目(2004CB719604)
作者简介:田双起(1984-),男,河南新乡,硕士研究生
通讯作者:常胜合,E-mail:shchang@zzu.edu.cn
随着人类基因组计划取得巨大的成功和许多
物种基因组测序的完成,仅仅靠基因组的序列试图
阐明生命现象是远远不够的。尽管现在已经有多个
物种的基因组被测序,但这些基因组中通常有一半
以上基因的功能是未知的[1]。因此,研究重心已经
开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整
体水平对功能的研究上,生命科学已实质性地跨入
了后基因组时代,即蛋白质组学时代[2]。从而从蛋
白质分子水平来进行生命功能方面的研究,来揭示
生命的本质,进而进行人为控制生命体的新陈代谢
来生产对人类有用的物质。
蛋白质是生理功能的执行者和生命现象的直
接体现者,对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明
生命在生理或病理条件下的变化机制;蛋白质本身
的存在形式和活动规律,如翻译后修饰、蛋白质间
相互作用及蛋白质构象等问题,仍依赖于直接对蛋
白质的研究来解决。因此要对生命的复杂活动有全
面和深入的认识,必然要在整体、动态、网络的水平
质谱技术及其在后基因组时代中的应用
田双起 秦广雍 李宗伟 王雁萍 陈林海
谈重芳 李宗义 黄新 常胜合
(郑州大学离子束生物工程省重点实验室,郑州 450052)
摘 要: 蛋白质组学的建立开辟了功能基因组学研究的新领域,为研究蛋白质水平的生命活动展现了更为崭新的
思路和广阔的前景。质谱技术能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后修饰,成为连接蛋白质与基
因的重要技术。质谱技术联合蛋白质组学多角度、深层次探索生命系统分子本质成为现阶段生命科学研究领域。简要综
述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的原理、方式和应用,并对其发展前景做出展望。
关键词: 质谱技术 蛋白质组 基因组
DevelopmentResearchonMassSpectrometryand
ProspectinPost-genomics
TianShuangqiQinGuangyong LiZongweiWangYanping ChenLinhai
TanChongfang LiZongyiHuangXin ChangShenghe
(HenanProvincialKeyLaboratoryofIonBeamBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052)
Abstract: Asestablishingofproteomics,thestudyoffunctionalgenomicsiscominganew areas,whichhas
demonstratedmoreinnovativeideasandbroadprospectsatproteinlevelsforthestudyoflifeactivities.Masspectrometry
canaccuratelymeasuringtheweightofthepeptideandproteinmolecular,aminoacidsequenceandpost-translational
modification.Thereforemasspectrometrybecomeanimportanttechnologylinkingproteinandgeneindisputably.The
potentialforcurentmethodstouncovernewtypesofinformationandtoencodebiologicalsystemsatamolecularlevel
makemasspectrometryandproteomicsamongthemostexcitingandimportantresearchthemesatthepresenttime.In
thisarticle,thebasisprinciplesandlimitsofcurentsmasspectrometricmethodsthatarethebasisforproteomicsanalysis
weresummarized,togetherwithadescriptionofthedevelopmentofnewerproteomicsstrategiesforproteinidentification.
Keywords: Masspectrometry ProteomicsGenomics
2008年第3期
上对蛋白质进行研究[3]。
质谱技术(MassSpectrometry,MS)具有灵敏度、
准确度、自动化程度高的特点[4],能准确测量肽和
蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后修
饰,因此成为连接蛋白质与基因的重要技术,开启
了大规模自动化的蛋白质鉴定之门[5]。
1 质谱技术
质谱是带电原子、分子或分子碎片按荷质比
(或质量)的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能
使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将
它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现
质荷比分离[6],并检测强度后进行物质分析的仪器。
质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组
成。
1.1 质谱分析的原理
用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离
化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子,
这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并
形成一束离子,进入由电场和磁场组成的分析器,
离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大,速度
快的偏转小;在磁场中离子发生角速度矢量相反的
偏转,即速度慢的离子依然偏转大,速度快的偏转
小;当两个场的偏转作用彼此补偿时,它们的轨道
便相交于一点。与此同时,在磁场中还能发生质量
的分离,这样就使具有同一质荷比而速度不同的离
子聚焦在同一点上,不同质荷比的离子聚焦在不同
的点上,其焦面接近于平面,在此处用检测系统进
行检测即可得到不同质荷比的谱线,即质谱。通过
质谱分析,可以获得分析样品的分子量、分子式、分
子中同位素构成和分子结构等多方面的信息[7]。
1.2 质谱技术的发展
质谱的开发历史要追溯到20世纪初J.J.Thomson
创制的抛物线质谱装置,1919年 Aston制成了第一
台速度聚焦型质谱仪,成为了质谱发展史上的里程
碑。最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原
子量,随着离子光学理论的发展,质谱仪不断改进,
其应用范围也在不断扩大,到 20世纪 50年代后期
已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。
现今,质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领
域,在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和
宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔
的应用。质谱技术在生命科学领域的应用,更为质
谱的发展注入了新的活力,形成了独特的生物质谱
技术[8]。
2 生物质谱技术
电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱
技术是诞生于 80年代末期的两项轨电离技术。这
两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研
究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵
敏度和高质量检测范围,使得在 pmol(10-12)甚至
fmol(10-15)的水平上准确地分析分子量高达几万到
几十万的生物大分子成为可能,从而使质谱技术
真正走入了生命科学的研究领域,并得到迅速的
发展。以下主要介绍与生物学有关的几项质谱技
术[8,19]。
2.1 电喷雾质谱技术
电喷雾质谱技术(Electro-sprayIonizsationMass
Spectrometry,ESI-MS)是在毛细管的出口处施加高
电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化
成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电
荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多
个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子
的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电
荷离子而不是碎片离子,使质量电荷比(m/z)降低
到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大
扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也
可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势
就是它可以方便地与多种分离技术联合使用,如
液-质联用(LC-MS)是将液相色谱与质谱联合而达
到检测大分子物质的目的[9]。
2.2 基质辅助激光解吸附质谱技术
基质辅助激光解吸附质谱技术(MatrixAssisted
LaserDesorption/Ionization,MALDI):将分析物分散
在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,
由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积
并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分
析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多
为单电荷离子,因而质谱图中的离子与多肽和蛋白
质的质量有—一对应关系[10,13]。MALDI产生的离子
常用飞行时间[12,14](Time-of-Flight,TOF)检测器来检
田双起等:质谱技术及其在后基因组时代中的应用 51
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
测,理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器
可检测分子的质量数是没有上限的。因此,MALDI-
TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生
物大分子的研究[16]。
2.3 快原子轰击质谱技术
快原子轰击质谱技术是一种软电离技术,是用
快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离
子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、
热不稳定的化-合物的分析,特别适用于多肽和蛋
白质等的分析研究[12,15]。快原子轰击质谱技术只能
提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元
素组成和分子式,而 FABMS-MS串联技术的应用可
以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在
生物学分析中迅速发展起来。
2.4 同位素质谱技术
同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术,
被广泛地应用于各个领域,但它在生命科学领域的
应用只是近几年的事。由于某些病原菌具有分解特
定化合物的能力,该化合物又易于用同位素标示,
人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中
同位素的含量以达到检测该病原菌的目的,同时也
为同位素质谱在生命科学领域的应用开辟了一条
思路[18]。
3 生物质谱技术的应用
随着质谱技术的不断改进和完善,质谱的应用
范围已扩展到生命科学研究的许多领域,特别是质
谱在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领
域的应用,不仅为生命科学研究提供了新方法,同
时也促进了质谱技术的发展[19]。用于鉴定蛋白质的
质谱法主要有 3种,即肽质量指纹图谱法、串联质
谱法和梯形肽片段测序法。
3.1 肽指纹图谱
肽指纹图谱(PeptideMassFingerprinting,PMF):
用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小
的片段,然后用质谱检测各产物肽的相对分子质
量,将所得到的蛋白酶解肽段质量数在相应数据库
中检索,寻找相似肽指纹谱,从而绘制“肽图”[17,22]。
随着蛋白质数据库信息的快速增长和完善,PMF技
术已成为蛋白质组研究中较为常用的鉴定方法,它
在蛋白质组学中最接近高通量。显而易见,分子质
量的精准度是 PMF的关键指标所在,但蛋白质的
翻译后修饰可能会使 PMF的质量数与理论值不
符,这就需要与序列信息适当结合[20]。
3.2 串联质谱法或碰撞诱导解离法
串联质谱法或碰撞诱导解离法(Colision-induced
dissociation,CID;严格来讲,CID法是串联质谱法的
一个过程):是利用待测分子在电离及飞行过程中
产生的亚稳离子,通过分析相邻同组类型峰的质量
差,识别相应的氨基酸残基,其中亚稳离子碎裂包括
自身碎裂及外界作用诱导碎裂。此外,具有源后衰变
(post-sourcedecay,PSD)功能的MALDI-TOF-MS也能
对肽链测序,但存在部分缺陷[21,30]。与 PMF图谱相
比,串联质谱的肽序列图要复杂一些,在鉴定蛋白
质时,需要将读出的部分氨基酸序列与其前后的离
子质量和肽段母质量相结合,这种鉴定方法称为肽序
列标签(ProteinSequenceTag,PST)[23]。
另外一种肽序列质谱测定法是梯形肽片段测
序法(Ladderpeptidesequencing),该法与 Edman法
有相似之处,是用化学探针或酶解使蛋白或肽从 N
端或 C端逐一降解下氨基酸残基,产生包含有仅
异于 1个氨基酸残基质量的系列肽,名为梯状
(Ladder),经质谱检测,由相邻肽峰的质量差而得
知相应氨基酸残基。但由于酶解速度不一,易受干
扰,故效果不甚理想[24]。
目前,酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机
算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势[25]。
4 不足与展望
由于蛋白质组是一个动态、变化的整体,生物
体内的蛋白质不能像核酸一样通过 PCR扩增来增
加样品量,因此其复杂性远远大于基因组。
虽然蛋白质组学的研究有它的局限性,但是技
术改进并未停止。新技术的补充和双向凝胶电泳的
新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。例
如,在样品分离过程中对样品预分离以减少样本的
复杂性,采用激光捕获显微切割技术以更为精确的
分离需要的组织和细胞,固相化 pH胶条和窄范围
的 pH胶条的使用可以分离到更多的蛋白质点,荧
光染料的使用使得蛋白质的分离更加准确可靠,切
胶和酶解的自动化减少了样品操作过程中角蛋白
的污染。技术方面,二维色谱(2D-LC),二维毛细管
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电泳(2D-CE),液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等新
型分离技术都是目前发展的主要方向。另一种策略
是以质谱技术为核心,直接鉴定全蛋白质组混合酶
解产物[26]。随着对大规模蛋白质组相互作用研究的
重视,发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测
技术也受到科学家的关注。此外,蛋白质芯片的发
展也十分迅速,并已经在临床诊断中得到应用[27]。
蛋白质组学的建立开辟了功能基因组学研究
的新领域,为研究蛋白质水平的生命活动展现了更
为崭新的思路和广阔的前景。可以说其发展受技术
限制,但同时也是受技术推动的。
随着生命科学及生物技术的迅速发展,生物质
谱不仅成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿
研究领域之一,更成为多肽和蛋白质分析最有威力
的工具之一[28]。串联质谱是肽序列分析的最先进方
法,但还存在一个问题,即分析串联质谱数据所代
表的序列是一项费时费力的工作,这就对序列分析
算法和软件等生物信息学交叉学科研究模式提出
了严峻要求。在发展新技术的同时,还应该重视现
有蛋白质组学研究技术的整合和互补,多种技术的
联合应用可以全面、系统、综合地分析蛋白质的特
征功能,强有力地推动人类基因组计划及其后基因
组计划的实施[29]。
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