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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
炭疽菌保护性抗原受体结合区的
表达及其多克隆抗体的制备
邱炎 1, 2 　王艳春 1 　展德文 1 　陶好霞 1 　姜娜 1 　韩秀萍 2 　李家奎 2 　刘纯杰 1
(1 军事医学科学院生物工程研究所 病原微生物与生物安全国家重点实验室 ,北京 100071; 2 华中农业大学动物医学院 ,武汉 430070)
　　摘 　要 : 　原核表达炭疽杆菌保护性抗原受体结合区并制备该蛋白的多克隆抗体。从炭疽芽胞杆菌 A16R中经 PCR扩
增得到了炭疽菌保护性抗原 ( PA)受体结合区基因 ,即 PA的第四结构域 ( PA2D4) ,将其克隆至含有 6 ×H is编码序列的原核表
达载体 pET22b ( + )中 ,将重组质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3) ,在 IPTG诱导下进行蛋白表达 ;用 H iTrapTM Chelating HP柱纯化
重组蛋白 ,W estern blot进一步鉴定 ;以纯化后的蛋白为抗原 ,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多克隆抗体 ;用 EL ISA和
W estern blot检测抗血清。结果表明 ,目的蛋白在大肠杆菌 BL21 (DE3)中获得了可溶性表达 ,纯化后纯度可达 90%以上 ;制备
了针对 PA2D4融合蛋白的高效价抗血清 , EL ISA抗体滴度为 1∶102 400;其抗体能特异性识别内源性的 PA。PA2D4重组蛋白
及其多克隆抗体的获得 ,为后续研究其功能和炭疽疫苗免疫保护机制奠定了基础。
关键词 : 　炭疽杆菌 　保护性抗原 　受体结合区 　原核表达 　多克隆抗体
Expression of the Receptor2binding Doma in of Protective Antigen
from B acillus an th racis and Preparation of Its Polyclonal Antibody
Q iu Yan1, 2 　W ang Yanchun1 　Zhan Dewen1 　Tao Haoxia1 　J iang Na1 　Han Xiup ing2 　L i J iakui2 　L iu Chunjie1
(1 B eijing Institute of B iotechnology, S tate Key Laboratory of Pathogen and B iosafety, B eijing 100071;
2 College of Veterinary M edicine, Huazhong Agricultural University, W uhan 430070)
　　Ab s tra c t: 　 It was to obtain the recep tor2binding domain of B acillus an th racis p rotective antigen from p rokaryotic cells and p re2
pare its antibody used for further studies of PA2D4. The B acillus an thracis p rotective antigen recep tor2binding domain gene ( the do2
main 4 of PA , PA2D4) was obtained by PCR from B acillus an thracis A16R genome and cloned into the p rokaryotic exp ression vec2
tor pET22b ( + ) containing 6 ×H is coding sequence . The recombinant p lasm id was transformed into host strain E. coli BL21 (DE3)
and induced to exp ress recombinant PA2D4 by IPTG. The recombinant p rotein was purified through H iTrapTM Chelating HP affinity
columns and then identified by W estern blot analysis. Purified p rotein was used as the antigen to immunize New Zealand rabbits for
three times to raise polyclonal antibody. Antiserum was analyzed by EL ISA and W estern blot. Results indicated that reconstructed
PA2D4 gene was successfully exp ressed in E. coli BL21 (DE3) in soluble form , and when purified with N i column, PA2D4 p rotein
covered more than 90% total p roteins. The polyclonal antibody against the p rotein with high titer was obtained, and EL ISA assay titer
of antiserum from vaccinated rabbits reached 1∶102 400. The results ofW estern blot showed PA2D4 p rotein exhibited p referable im2
munogenicity and its polyclonal antibody could specifically recognize endogenous PA p rotein. Thus, PA2D4 p rotein and its specific
antibodies were obtained successfully, which would lay foundation for further research of p rotein function and immune mechanism of
the anthrax vaccine.
Key wo rds: 　B acillus an thracis　Protective antigen　Recep tor2binding domain　Prokaryotic exp ression　Polyclonal antibody
收稿日期 : 2009204207
作者简介 :邱炎 (19852) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向 :病原微生物及其疫苗 ;王艳春 (19802) ,男 ,博士研究生 ,研究方向 :病原微生物及其疫苗 ;二
者为并列第一作者
通讯作者 :刘纯杰 , E2mail: liuchunj@nic. bm i. ac. cn;李家奎 , E2mail: lijk210@ sina. com　　炭疽病是由炭疽芽胞杆菌 (B acillus an thracis) 引起的一种人畜共患烈性传染病 ,主要通过皮肤、呼
2009年第 8期 邱炎等 :炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达及其多克隆抗体的制备
吸道和消化道感染动物和人 ,死亡率非常高。
炭疽杆菌的主要致病因子包括炭疽毒素和细菌
荚膜 ,它们的编码基因分别位于细菌的两个质粒
pXO1和 pXO2上。荚膜能阻止细菌被宿主免疫细
胞吞噬 ,而毒素是造成宿主损伤和死亡的主要原
因 [ 1, 2 ]。炭疽毒素由 3个功能相关的蛋白组成 :保
护性抗原 (p rotective antigen, PA )、致死因子 ( lethal
factor, LF)和水肿因子 ( edema factor, EF) [ 3 ] ,它们
都是炭疽杆菌分泌出来的蛋白单体。炭疽杆菌保护
性抗原由 753个氨基酸残基组成 ,它能形成七聚体 ,
同靶细胞膜上的受体 (ATR)结合 ,介导 LF和 EF进
入宿主细胞 ,破坏宿主免疫系统 ,发挥致死和水肿的
毒素作用。
1997年已获得 PA以及 PA63亚基七聚体的晶
体结构 [ 4 ] ,它共包含 4 个结构域 : 结构域 Ⅰ包含
furin蛋白酶的作用位点和 EF /LF的结合位点 ;结构
域 Ⅱ与 PA 跨膜时的孔道形成有关 ,其作用是使
PA63实现寡聚化和插入内体小泡膜 ;结构域 Ⅲ的基
本作用是帮助介导 PA63的寡聚化 [ 5 ] ;结构域 Ⅳ是
受体结合区 [ 6 ]。研究还显示 , PA的第四结构域存
在 PA的主要中和抗原表位 [ 7 ]。
PA在炭疽杆菌的免疫保护中发挥关键作用 ,它
可以刺激机体产生中和抗体 ,是现有炭疽疫苗 ( an2
thrax vaccine adsorbed, AVA)的主要免疫活性成分。
PA2D4是 PA与细胞受体的结合部位并且存在 PA
的主要中和抗原表位 ,因此 ,重组表达独立的 PA2D4
并制备抗 PA2D4的中和抗体 ,其抗体就能够特异地
与 PA结合 ,中和 PA的生物学活性 ,阻断 PA与其受
体的结合 ,从而阻断炭疽毒素发挥生物学作用达到
治疗炭疽的目的。本研究实现了 PA2D4的可溶性
表达 ,并对其免疫原性进行了初步研究 ,为检测其抗
毒素活性和构建炭疽杆菌基因工程多价苗打下了
基础。
1　材料与方法
111　材料
新西兰大耳白兔购自军事医学科学院实验动物
中心。质粒 pET222b ( + )、大肠杆菌 DH5α、BL21
(DE3)、B acillus an thracis A16R菌株由本室保存 , T
载体为全式金公司产品 ;高保真 DNA聚合酶 Pfu、
HRP显色试剂盒购自天根生物工程有限公司 ;限制
性内切酶购自 TaKaRa公司 ; T4 连接酶购自纽英伦
生物技术有限公司 ;小量质粒提取试剂盒和 DNA回
收试剂盒购自 Promega公司 ;中分子量蛋白 Marker
及预染 Marker为 Fermentas公司产品 ;用于抗原纯
化的 H iTrapTM Chelating HP柱子购自美国 GE公司 ;
完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为 Sigma公司产
品 ;羊抗 PA多克隆抗体购自 Santa Cruz B iotech公
司 ; HRP酶标羊抗兔 IgG和兔抗山羊 IgG抗体购自
北京中杉金桥生物科技有限公司。
112　PA2D4基因的 PCR扩增
根据 GenBank中收录的炭疽芽胞杆菌 pXO1质
粒的 pag基因序列找到 PA2D4序列 ,用 Primer5. 0
软件设计扩增 PA2D4基因的引物如下 ,正、反向引
物分别引入 N coⅠ和 X hoⅠ酶切位点 (下划线部
分 ) ,引物由本所微生物基因组学实验室合成 :
正向引物 : 5′2CGACCATGGATTTTCATTATGAT
AGAAATAACATAG23′;
反向引物 : 5′2GCACTCGAGTCCTATCTCATAGC
CTTTTTTAG23′。
用常规 PCR方法扩增目的基因 ,将炭疽芽胞杆
菌 A16R株于水浴中煮沸 10 m in,离心 ,取上清作为
模板进行 PA2D4基因的 PCR扩增。反应体系为 50
μl,扩增参数为 95℃预变性 5 m in;然后 94℃变性 30
s, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s,扩增 30个循环 ;最
后 72℃延伸 10 m in。对 PCR产物进行琼脂糖凝胶
电泳分析 ,并用 DNA试剂盒回收。
113　PA2D4基因原核表达载体的构建
将上述纯化后的 PA 2D4基因片段 ,用 N coⅠ和
X hoⅠ进行双酶切 ,经 T4 连接酶连接到同样经 N co
Ⅰ和 X hoⅠ酶切过的原核表达载体 pET222b ( + )
中 ,参照文献 [ 8 ] ,采用热激法将连接产物转化感
受态大肠杆菌 DH5α株 ,涂布于含 100μg /m l氨苄
青霉素 (Amp )的 LB 平板 ,挑取阳性克隆经菌落
PCR和酶切初步鉴定后 ,送本所微生物基因组学
实验室测序。鉴定正确后得到重组表达载体 pET2
PA 2D4。
114　重组蛋白诱导表达
11411　诱导表达 　提取测序正确的 pET2PA2D4阳
性质粒 ,转化大肠杆菌 BL21 (DE3 )感受态细胞 ,
37℃培养过夜。挑取单菌落接种至含 100 μg/m l
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
Amp的 5 m l LB液体培养基中 , 37℃, 200 r/m in振
荡培养过夜。以 1∶100比例转接于 5 m l新鲜 LB培
养基中 , 37℃, 200 r/m in培养至 OD600值约为 0. 6时
加入 IPTG至终浓度 0. 5 mM ,诱导培养 4 h。
11412　表达产物的 SDS2PAGE鉴定 　取 1 m l诱导
后的菌液 , 12 000 r/m in离心 1 m in,细菌沉淀用 100
μl 1 ×PBS重悬 ,加入 25μl 5 ×SDS蛋白上样缓冲
液制备蛋白电泳样品 ,煮沸变性 5 m in,用 15%的
SDS2PAGE进行电泳 ,同时以空载体菌 pET222b /
BL21为阴性对照 ,判断蛋白表达情况。
11413　重组蛋白的可溶性分析 　按上述方法大量
诱导表达目的蛋白 ,于 4℃, 8 000 r/m in, 10 m in离
心收集菌体 , PBS重悬 ,超声破碎菌液至清亮 ,破碎
产物于 4℃, 12 000 r/m in离心 10 m in,分别收集上
清和沉淀物 ,并以同体积 PBS重悬沉淀物 ,分别取
上清和沉淀重悬液 ,制备蛋白电泳样品 ,进行 SDS2
PAGE电泳 ,确定重组蛋白的表达形式。
115　重组蛋白纯化和 W estern blot分析
11511　重组蛋白纯化 　收集 800 m l诱导表达培养
液的菌体 ,以 25 m l PBS重悬 ,超声破碎后离心收集
上清 ,经 0. 45μm滤器过滤制得纯化用样品 ,利用
AKTA纯化系统通过 H isTrap 5 m l chelating HP柱对
表达的目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化。纯化过
程 :利用 AKTA纯化系统 ,用 5 ×柱床体积的 binding
buffer(0. 02 M PB, 0. 5 M NaCl, pH7. 4)预平衡 H is2
Trap 5m l chelating HP柱。首次上样 1 m l,在 10个
柱体积内用 elution buffer (0. 02 M PB, 0. 5 M NaCl,
0. 5 M咪唑 , pH7. 4)完成梯度洗脱 (0～500 mmol/L
咪唑浓度 ) ,摸索洗脱条件。收集不同峰管并通过
SDS2PAGE电泳判断目的蛋白纯化情况 ,并据此调
整洗脱程序 ,以 125 mM咪唑洗脱浓度和 300 mM咪
唑洗脱浓度进行阶段洗脱来分离杂蛋白和目的蛋
白 ,收集目的蛋白。收集到的目的蛋白通过 H isTrap
5 m l Desalting柱进行脱盐。脱盐后再用 M ilipore 15
m l超滤离心管浓缩后 ,进行 SDS2PAGE电泳 ,并以
凝胶成像分析仪拍照分析蛋白纯度 ,同时用 BCA蛋
白定量试剂盒进行定量。
11512　重组蛋白 W estern blot鉴定 　参照文献 [ 9 ] ,
对纯化后的 PA2D4、未诱导的 pET PA2D4 /BL21、空
载体菌 pET222b /BL21 进行 SDS2PAGE、转膜、封
闭 ,一抗为 1∶200稀释的羊抗 PA多抗 ,二抗为 1∶5
000稀释的 HRP标记的兔抗山羊 IgG,最后用 DAB
显色试剂盒显色。
116　重组蛋白多克隆抗体的制备与检测
11611　动物免疫 　选取雌性新西兰大耳白兔 2只 ,
体重约 2. 5 kg,耳缘静脉采血后于背部皮下多点注
射抗原进行免疫 , 3次免疫抗原剂量均为 0. 5 mg/
只。首次免疫时将抗原加等量完全弗氏佐剂 (CFA )
充分混合乳化后皮下多点注射 ,每隔 2周再以抗原
加等量不完全弗氏佐剂 ( IFA )乳化后加强免疫两
次。第一次免疫前采血并分离血清作为阴性对照 ,
第一次加强免疫前耳缘静脉采血 ,用 EL ISA检测抗
血清效价。3次免疫后 10 d耳缘静脉采血 ,检测抗
血清效价 ,达到较理想的滴度后 ,于免疫程序结束后
14 d,颈动脉取血 ,分离血清。
11612　间接 EL ISA法检测抗体效价 　对抗体效价
的检测采用间接 EL ISA 法进行。用纯化的 PA2D4
融合蛋白以包被液稀释至 10μg/m l,包被于酶标板
中 ,每孔 100μl, 4℃包被过夜。次日加入不同稀释
度待检抗血清 ,以同样稀释度的正常兔血清为对照 ,
二抗为 1∶5 000稀释的 HRP标记山羊抗兔 IgG,显
色底物为邻苯二胺 (OPD ) ,显色结果用酶标仪在波
长 490 nm处进行测定 , P /N大于 2. 1为阳性。
11613　抗体特异性鉴定 　浓缩炭疽芽胞杆菌 A16R
培养基上清 ,对浓缩的 A16R上清蛋白、A16R菌体
沉淀进行 SDS2PAGE、转膜、封闭 ,以 1∶10 000稀释
的 PA2D4重组蛋白免疫兔抗血清为一抗 ,以 1∶5
000稀释的 HRP标记的山羊抗兔 IgG为二抗 ,进行
W estern blot分析 ,以检测多克隆抗体的特异性。
2　结果
211　PA2D4基因的扩增
以 B acillus an thracis A16R基因组为模板 ,加入
相应引物 ,经过 30个 PCR循环扩增目的基因片段 ,
经 1. 0%琼脂糖电泳分析表明获得了约 430 bp的特
异目的片段 ,与扩增基因的理论大小一致 (图 1)。
212　PA2D4基因原核表达载体的构建与鉴定
纯化后的 PA2D4基因 ,用 N coⅠ和 X hoⅠ进行
双酶切 ,获得的 PA2D4片段克隆到同样经 N coⅠ和
XhoⅠ酶切过的原核表达载体 pET222b ( + )中 ,得到
重组表达载体 pET2PA 2D 4。用 N coⅠ和 X hoⅠ进行
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2009年第 8期 邱炎等 :炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达及其多克隆抗体的制备
1. DNA marker; 2, 3. PCR产物
图 1　PCR扩增 PA2D4结果
双酶切鉴定重组质粒 pET2PA2D4,电泳结果显示有
2条带 ,分别与载体和目的片段的大小一致 (图 2)。
酶切鉴定后 DNA测序表明所得到的约 430 bp的基
因片段与预期结果完全一致 ,说明成功构建了原核
表达载体 pET2PA2D4。
1. DNA marker; 2, 3. 重组质粒 pET2PA2D4的 N coⅠ /XhoⅠ双酶切产
物 ; 4. PA2D4的 PCR产物 ; 5. 质粒 pET222b的 N coⅠ /X hoⅠ双酶切
产物
图 2　重组质粒 pET2PA2D4的酶切鉴定
213　PA2D4重组蛋白的表达、纯化和 W estern blot
分析
21311　PA2D4重组蛋白的表达 　重组菌株经诱导
表达和超声破碎后 ,进行 15%的 SDS2PAGE电泳 ,
比较蛋白在全菌、上清及沉淀部分的表达量 ,同时以
含空载体 pET222b的大肠杆菌 BL21 (DE3)为阴性
对照。结果显示在相对分子质量约 16 kD处有明显
的特异蛋白表达条带 ,与预期的 PA2D4融合蛋白大
小一致 ,并且 PA2D4主要以可溶形式存在 (图 3)。
1. 蛋白 marker; 2. 诱导的 pET222b /BL21; 3. 未诱导的 pET2PA2D4 /
BL21; 4. 诱导后的 pET2PA2D4 /BL21全菌 ; 5. 超声破碎的 pET2PA2
D4 /BL21上清 ; 6. 超声破碎的 pET2PA2D4 /BL21沉淀
图 3　重组蛋白表达效果
21312　PA2D4重组蛋白的纯化 　制备纯化样品 ,上
样 2 m l,以 125 mM咪唑洗脱浓度和 300 mM咪唑洗
脱浓度进行阶段洗脱来分离杂蛋白和目的蛋白 ,收
集目的蛋白洗脱峰 ,合并 ,脱盐 ,脱盐后的目的蛋白
经 M ilipore 15 m l超滤离心管浓缩后 ,进行 SDS2
PAGE电泳 (图 4) ,以凝胶成像分析仪拍照分析蛋
白纯度 ,凝胶成像分析显示蛋白纯度已达到 90%以
上 ,用 BCA蛋白定量试剂盒进行定量 ,浓度为 1. 49
mg/m l。
1. 蛋白 marker; 2. 超声上清 ; 3. 纯化后的 PA2D4
图 4　PA2D4重组蛋白纯化结果
21313　PA2D4重组蛋白 W estern blot分析 　以羊抗
PA多抗为一抗 , HRP标记的兔抗山羊 IgG为二抗
进行 W estern blot分析 ,结果表明重组 PA2D4蛋白
与羊抗 PA免疫血清反应后在相对分子质量约为 16
kD处有特异的反应条带 ,而空载体菌却没有相应的
条带出现 ,表明重组 PA2D4蛋白能与 PA抗体发特
异性反应 (图 5)。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
1. 蛋白 marker; 2, 3. 纯化后的 PA2D4; 4. 未诱导的 pET2PA2D4 /BL21; 5. 诱导后的 pET222b /BL21
图 5　重组 PA2D4的 W estern blot分析
214　动物免疫和抗血清制备
21411　抗体效价测定 　两只新西兰大耳白兔经过
一次基础免疫 ,和两次加强免疫 ,最后一次免疫后
14 d颈动脉取血 ,离心获得血清。第一次加强免疫
前耳缘静脉采血 ,用 EL ISA检测抗血清效价可达 3
200以上 ,说明抗原能够很好地刺激机体产生免疫
反应。第 3次免疫后 , 2只家兔的血清效价均达到 1
∶102 400。
21412　抗血清的 W estern blot分析 　对浓缩的
A16R上清蛋白、A16R菌体沉淀进行 SDS2PAGE、转
膜、封闭 ,以 PA2D4重组蛋白免疫兔抗血清为一抗 ,
以 HRP标记的山羊抗兔 IgG为二抗 ,进 W estern blot
分析 ,以检测多克隆抗体的免疫结合性。结果在分
子量约为 83 kD处有特异的反应条带 ,由此证明制
备的抗体可以识别内源性的 PA蛋白 (图 6)。
1. 预染的蛋白 marker; 2, 3. 培养基上清 ; 4. 菌体沉淀
图 6　W estern blot检测内源性的 PA
3　讨论
PA蛋白不仅在炭疽的致病中发挥重要作用 ,而
且在炭疽的免疫中起决定性作用。目前它是人用疫
苗中一个关键的保护性免疫原 ,疫苗的有效性几乎
完全依赖于 PA 抗体的产生 [ 10 ]。 PA 作为目前获
FDA批准的人用炭疽疫苗 AVA的主要免疫活性成
分 ,其疫苗和中和抗体的研制一直是人们关注的重
点 ,以其作为免疫原的基因工程疫苗研究越来越多 ,
因此获得 PA 抗原和特异、敏感的相应抗血清 ,为
PA抗原和抗体的检测提供技术手段具有重要意义。
而其保护性抗原 PA受体结合区的高表达不仅可以
为多价亚单位疫苗的研制奠定基础 ,还可以为从抗
体库中筛选炭疽毒素的中和抗体提供有效的抗原。
利用 pET222b ( + )表达系统表达了 6 ×H is2PA2
D4蛋白 ,蛋白可溶性表达量较高 ,包涵体形成较少 ,
且蛋白稳定性较高。对获得的蛋白进行了 W estern
blot分析 ,证明它可以与抗 PA的多抗发生特异性
结合。
将纯化后的 PA2D4融合蛋白免疫新西兰大耳
白获得抗血清。EL ISA检测抗血清效价可达 1∶102
400,说明所获得的 PA2D4具有良好的免疫原性。另
外 ,用制备的抗体与炭疽芽胞杆菌 A16R培养基上清
和菌体蛋白进行 W estern blot分析 ,结果在分子量约
为 83 kD处有特异的反应条带 ,由此证明制备的抗体
可以识别内源性的 PA蛋白。抗体可以识别内源性
的 PA蛋白 ,也就暗示了其有望成为炭疽治疗药物。
徐俊杰等 [ 11 ]的研究也显示 ,重组 PA免疫家兔产生的
抗血清 ,在体外能抑制炭疽致死毒素的活性。
总之 ,本研究制备的 PA2D4抗体 ,为该蛋白的
活性研究、表位筛选和多价疫苗的构建提供了有力
的工具和实验材料。 (下转第 108页 )
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
代谢途径 ,可通过这两个酶构建以甘油为底物的 32
HP基因工程菌微生物体内合成途经 ,合成途径的
惟一中间产物为 32羟基丙醛 ,其浓度过高将抑制菌
体的生长和甘油的代谢 [ 11 ] ,这可能是不能实现高产
的主要限制因素之一。另外当 E. coli JM109中同时
引入表达载体 pUCtac和 pEtac时 ,质粒保持率分别
为 85%和 80% ,相比大肠杆菌 E. coli JM109中只引
入 pUCtac或者 pEtac稳定性有所降低。构建的重
组菌 E. coli JM109 ( pEtac2dhaB , pUCtac2aldh)产 32
HP4. 92 g/L ,甘油转化率为 12. 3%。
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