全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
洋桔梗的转基因研究
陈奇 王阁奇 马莉 陈丽梅
(昆明理工大学 生物技术研究中心,昆明 650224)
摘 要: 以叶盘为外植体, 通过农杆菌菌株 C58C l( pPM P90)介导,开展了用植物表达载体 pK235SGFP (含 GFP基因 )
转化洋桔梗 (Eustoma russellianum )的研究。洋桔梗叶盘用农杆菌浸染 15- 20 m in, 在共培养基上与农杆菌共培养 2 d后,转移
到分化培养基上诱导愈伤组织。10 d后选取部分叶盘在紫外灯下观察 GFP的荧光亮点,结果 80%以上的叶盘都有 GFP的荧
光亮点, 说明农杆菌对叶盘的感染效率很高。在分化培养基上红花洋桔梗叶盘不定芽分化频率约为 30% , 把分化培养基上形
成的小苗转移到含有 Km ( 20 mg /L )的生根培养基上, 进行生根诱导筛选具有 Km抗性的转基因植株,统计结果说明红花洋桔
梗的转化效率为 2. 4%。随机选取 4株具有 Km抗性的洋桔梗植株进行 PCR检测,结果均为阳性,证明 GFP基因已整合到洋
桔梗基因组中, 选取经 PCR检测为阳性的植株叶片,用激光共聚焦显微镜观察,结果发现有 GFP的绿色荧光出现在叶片细胞
质中, 说明叶片中有 GFP蛋白的表达, 转化试验成功。
关键词: 洋桔梗 农杆菌介导 转基因 GFP基因
Study of TransformationEustoma russellianum
Chen Q i W ang Geqi M a L i Chen Lmi ei
(Biotechno logy Research Center, Kunm ing University of Science and T echnology, Kunming 650224)
Abstrac:t T ransfo rma tion study w as conducted in L isianthus, Eustom a russellianum, w ith a plant expression vector pK235SGFP
( conta ining GFP gene) byAgrobacteriummediated method using leaf discs as the explants. TheEustoma russellianum leaf discs were in
cubated w ith theAgrobacter ium fo r 15- 20 m in. A fter cocultured w ith theAgrobacterium for 2 days, the leaf discs w ere transferred to
ca llus induced m edium. Ten days late r, a part of the lea f discs were se lec ted and subjected to GFP spot observation under aUVlam p.
The resu lts show ed that 80% o f the selected lea f d iscs displayed GFP spots, indicating h igh infection effic iency of the leaf discs by the
Agrobacterium. The efficiency o f the adventitious bud induction was 30% on the shootinduction medium. The shoots w ere transfe rred to
root induction m ed ium w ith Km( 20 m g /L) for se lection of Kmresistance p lants. Statistics ana lysis indicated that the transform ation effi
ciency o fEustom a russellianum w as 2. 4%. O f the Kmresistance plants, 4 plants w as random ly se lected for PCR ana lysis. The positive
resu lts in idicated that the GFP gene w as integ rated into the genom e ofEustom a russellianum. The leaves we re selected from the plants
com firm ed by PCR analysis and subjec ted to GFP expression observation under a laser scann ing con foca lm icroscope. The results showed
that GFP green fluorescent appeared in the cy top lasm o f leaf cells, ind icating the GFP prote in expression in the leaves and the success of
the transform ation experim ents.
Key words: Eustom a russellianum Agrobacter iumm ed ia ted T ransform ation GFP gene
收稿日期: 20091215
基金项目:国家自然科学基金 ( 30670163) ,教育部留学回国人员科研启动基金 ( 200555) ,云南省中青年学术与技术带头人培养费 ( 2004PY01
5) ,昆明理工大学人才培养费
作者简介:陈奇,男,博士研究生,研究方向:植物代谢途径基因工程; Em ai:l chenq i0072002@ yahoo. com. cn
通讯作者:陈丽梅,教授, Em ai:l chen lim eikm@ yahoo. com. cn
洋桔梗又名草原龙胆, 是龙胆科龙胆属 ( Eusto
ma)植物, 为一、二年生草本。其花形美丽, 花色丰
富、茎杆光滑挺直,叶片油绿,卵形至长椭圆形。洋桔
梗作为一种观赏植物,姿态轻盈滞洒,色调清新淡雅,
花形别致可爱,是目前国际上十分流行的盆花和切花
种类之一 [ 1 ]。洋桔梗原产美国,经品种改良现已成为
一种品种繁多、异常新奇的高档花卉。目前的年销售
量已达到 1亿支, 销售额 11亿美元,列切花排名第
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
七位,在欧洲各国的花店和家庭的窗台上到处可见。
洋桔梗英名为 L isianthus, E. russellianum 和 E.
grand if lorm是目前广泛栽培的两种洋桔梗, 在原生
地发现有紫、白、桃、黄和白底紫边等花色。引种到
欧洲和日本后,通过杂交改良, 育种家已经育出了一
系列花色的洋桔梗,而花型的丰富 (单瓣、重瓣 )更
增加了其魅力。洋桔梗常见的商业化品种有美人鱼
(M erm aid)系列, 花单瓣, 花色有粉红、紫、米色等。
蓝利萨 ( L isaB lue) , 花单瓣, 深蓝色, 分株性强。红
镜子 ( RedG lass), 花深红色, 是洋桔梗红花之最。重
瓣伊格尔 ( Deub leEagle) ,花色多样。伊迪 ( E eidi)系
列,花色有深蓝、粉、玫瑰红、黄、白、蓝和双色等。埃
克奥 ( E cho) , 花重瓣,花色有蓝, 粉白、双色等。玛
丽艾基 (M ar iach i),花色多样。
随着人们生活质量的逐步提高, 花卉的市场需
求也越来越大,消费者仍在不断地寻求具有新的颜
色,奇异的形状, 芬芳的香气和更长保鲜期的品种;
作为种植者则要求品种具有产量高、抗病、抗虫等优
良的农艺性状。花卉作为观赏性的作物, 其转基因
品种的生物安全性要求不象其他作物要求那么严
格,更容易投放市场实现商业化,基因工程技术的发
展为改良花卉品质提供了新的方法和途径 [ 2- 4 ]。己
有的研究工作表明, 洋桔梗叶片再生体系基因型依
赖性强 [ 5- 7] ,不同品种间差异大。植物遗传转化方
法的成功对品种基因型的依赖性也很大, 对洋桔梗
的遗传转化有一些成功的报道 [ 8- 12] , 但是转化方法
都不够成熟,有关洋桔梗遗传转化成功的报道几乎
没有。因此有必要对不同品种的洋桔梗开展广泛的
转基因研究。本研究对开红花的单瓣洋桔梗品种开
展转基因研究,为利用基因工程技术对它的花色和
品质进行改良奠定研究基础。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
植物转化采用的农杆菌菌株为含有植物表达载体
pK235SGFP[ 13]的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefa
ciens) C58C1( pPMP90)。植物材料为开粉红花的单瓣
洋桔梗 (图 1A )品种,购自日本。
1. 2 洋桔梗无菌苗的培养
洋桔梗品种种子用自来水冲洗干净, 75%酒精
浸泡 30 s, 无菌水漂洗 1次, 3%次氯酸钠溶液灭菌
30m in, 无菌水漂洗 5次, 播种于不含任何激素的
MS(murash ige skoog)固体培养基 (含 3%蔗糖 )上,
培养条件为 25 持续光照,萌发得无菌苗。当芽长
到 4- 6片叶时, 选取长有成对叶的幼苗 (图 1B ),
从顶芽算起切取 2、3对叶片作试验材料。
A.洋桔梗鲜切花; B.洋桔梗无菌苗
图 1 转化试验用材料
1. 3 农杆菌菌液的制备
挑取携带有 pK235SGFP质粒的农杆菌单菌
落接种于 50mL的 LB ( 10 g /L蛋白胨, 5 g /L酵母
膏, 10 g /L NaC l)培养基中, 含 100 g /mL壮观霉素
( Spe), 180 r/m in, 28 培养 24 h, 待菌液 OD600至
10左右, 3 000 r/m in离心 10m in,沉淀菌体。再用
30mL左右的 MS液体培养基悬浮, 3 000 r /m in离
心 10m in,沉淀菌体。重复以上操作 2- 3次。最后
加入一定体积的 MS液体培养基重悬浮, 使菌体的
OD600值为 05。
14 转化试验
从洋桔梗无菌苗中切取叶片,用解剖刀除去叶
片顶部与基部,垂直于主叶脉把叶片切成 2- 3块叶
盘, 每块大致为 5 mm ! 5 mm大小。在制备好的农
杆菌菌液中浸染 15- 20m in,用无菌水洗一次,在无
菌吸水纸上吸干水后, 平铺于共培养基 B1( M S +
IBA 02 g /mL + 6BA 05 g /mL)上于黑暗处共
培养 2 d, 将外植体转移至含卡那霉素 ( Km, 20 g /
mL)和头孢噻肟 ( 400mg /L )的芽诱导培养基 B4(MS
+ IBA 02 g /mL+ 6BA 05 g /mL)上进行芽的诱
导, 约 20 d继代 1次。待有芽生成后, 转入含 Km
( 20 g /mL ) , IBA 025 g /mL及头孢噻肟 ( 400
mg /L )的 1 /2M S培养基上进行生根的诱导。
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2010年第 3期 陈奇等:洋桔梗的转基因研究
15 GFP的荧光观察
待叶盘在 B4培养基上生长 1 - 2周后, 选取
部分叶盘的愈伤组织, 放置于载玻片上, 使用连续
变倍体视显微镜观察 GFP的表达情况。先用显微
镜光源观察愈伤组织 (明场 )的生长情况并拍照。
然后关掉光源,使用紫外灯 (便携式紫外灯 )照射
愈伤组织观察 (暗场 )愈伤组织中的 GFP亮点并拍
照。转基因洋桔梗叶片细胞中表达的 GFP用激光
共聚焦显微镜 (奥林巴斯 FV 1000S, 日本 )观察,
GFP和叶绿素的荧光用波长为 488 nm 的激发光
激发, 在波长为 500- 515 nm的发射光下观察 GFP
的荧光,在波长为 630 - 680 nm的发射光下观察
叶绿素的荧光。
16 植物基因组 DNA的抽提
采用 CTAB法提取植物基因组, 操作程序为:
称取植物叶片 100mg左右置于 15mL离心管中,
加液氮用特制研棒研磨至粉末状; 加入 900 L预
热到 65 的 2 ! CTAB缓冲液 ( T risHC l 100 mM
pH75, EDTA 20 mM, N aC l 14 M, CTAB 2% ),
65 度水浴加热 20 m in后取出冷却; 加入 500 L
氯仿 异戊醇混合液 ( 24∀1 )摇匀, 4 离心 10 m in
( 7 500 r/m in)后转移上清至 15 mL EP管; 再次
加入 500 L氯仿异戊醇混合液 ( 24∀1)摇匀, 4
离心 10 m in( 7 500 r /m in); 取出上清置于新的 EP
管中,加入 1 /10体积 3M pH 52醋酸钠和等体积
异丙醇,摇匀后 4 离心 20m in( 12 000 r /m in) ;弃
上清, 用 75% 乙醇清洗两次后, 干燥, 用含 RN ase
的 TE缓冲液溶解 DNA并降解 RNA。
17 基因组 PCR
根据 GFP 基因序列设计一对特异性引物
GFP5( ATGCGTAAAGGAGAAGAACTTTTC)和 GFP3
( CTATTTGTATAGTTCATCCATGCC ), 委托北京博迈
德公司合成,用于基因组 PCR反应扩增 GFP基因。
在 PCR反应混合液中加入 50 ng的基因组 DNA作
为模板, 同时加入 25 ng的特异性引物 GFP5和
GFP3、2 L dNTP( 25mM ), 2 L的 10 !Ex Taq反
应 Buffer和 025 L Ex Taq DNA聚合酶 ( 5 U /L,
日本宝生物 ) ,加 ddH2O使反应终体积为 20 L。在
PCR仪 ( B ioRad)上于 94 加热 2 m in, 然后按照
94 、30 s, 55 、30 s, 72 、1m in的程序进行 30个
循环的反应,最后在 72 延长反应 10 m in。反应完
成后,通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物
2 结果
21 洋桔梗遗传转化用的植物表达载体及转化试验
因为绿色荧光蛋白在植物组织中表达时可以用
手持紫外灯观察,不需要提供任何底物,同时还可以
进行活体观察,作活体观察时不需把试验材料取出
来,不影响转化试验的持续进行。因此用一个带有
绿色荧光蛋白基因 GFP的植物表达载体 pK235S
GFP(图 2)进行洋桔梗的遗传转化试验。在该表达
载体中, GFP基因的表达受 35S启动子的控制, 35S
启动子为组成型启动子,它的表达没有组织特异性,
也不需要环境条件的诱导, 因此可以使 GFP基因在
任意条件和任意组织细胞中表达, 便于观察追踪农
杆菌的感染和 GFP基因的表达情况。此外,在该表
达载体中还有卡那霉素抗性基因 ( Kmr ), 可用于转
基因植物的筛选;壮观霉素抗性基因 ( Sper ), 可用于
农杆菌的筛选和培养。
图 2 转化用的植物表达载体 (内含 GFP基因 )
所用的洋桔梗品种可以通过组织培养方法从叶
片再生植株,因此采用农杆菌介导的叶盘法转化该
洋桔梗。本研究总共转化了 450个叶盘, 另外用
220个未经农杆菌感染的叶盘作对照。
22 叶盘愈伤组织中 GFP荧光的观察
当叶盘在 B4培养基上生长 1- 2周后,为了解
农杆菌对洋桔梗的感染是否成功, 在手持紫外灯下
观察叶盘上是否有 GFP的荧光亮点。结果观察到
大部分被农杆菌感染的叶盘受伤的部位都有 GFP
荧光亮点 (图 3A )。统计结果说明, 在 450个被农
杆菌感染的叶盘中有 80%的叶盘有 GFP的荧光亮
点, 而没有被农杆菌感染的 220个对照叶盘没有
GFP的荧光亮点 (图 3B ), 这些结果说明所用的农
杆菌对洋桔梗的感染是成功的, GFP基因可以在被
111
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
感染的洋桔梗叶盘中表达。
A.用植物表达载体转化的叶盘; B.未转化的叶盘
图 3 愈伤组织阶段 GFP绿色荧光的观察
23 转基因植株的产生与 GFP插入情况的检测
被农杆菌感染的叶盘在 B4培养基上生长两个
星期后有 30%的叶盘边缘开始肿胀, 并有肉眼可见
的愈伤组织形成, 1个月后有部分小苗开始长出来
(图 4A ),而没有被感染的对照叶盘没有长愈伤组
织,也没有分化出小苗, 最后在 B4培养基上黄化或
白化死去,说明所用的 Km浓度适合于洋桔梗转基
因植物的筛选。待 B4培养基上分化的小苗长大后
用手术刀将它们从叶盘上切下来,转移到生根培养基
上诱导根的形成, 1个月后有 Km抗性的小苗可以长
根,没有 Km抗性的小苗渐渐白化死去 (图 4B )。最
后共获得 11个能在含有 Km的培养基长根的小苗,
统计结果说明洋桔梗的转化效率约为 24%。
为确认 GFP基因确实已插入到具有 Km抗性
的转基因小苗的基因组中, 随机选取 4个株系, 剪下
这些植株的叶片提取基因组 DNA, 以基因组 DNA
作模板扩增 GFP基因片段。凝胶电泳检测结果说
明这 4株植物的 PCR扩增产物都是 07 kb的 DNA
条带 (图 4C ) , 这与 GFP基因的分子量相符, 说明
这些植物的基因组中都含有 GFP基因。
2. 4 GFP绿色荧光蛋白在转基因植物叶片中的表
达检测
为了确定 GFP基因插入洋桔梗基因组后是否可
以在转基因植物中表达出 GFP荧光蛋白,取下经基
因组 PCR检测为阳性的转基因植物叶片,切成具有
一定厚度的薄片后置于载玻片上,用激光共聚焦显微
镜观察叶片细胞中 GFP蛋白的表达情况。结果观察
到叶片细胞中有 GFP的绿色荧光蛋白 (图 5A ),
A.转化后在分化培养基上诱导产生的转基因小苗; B. 转化后产生的
转基因小苗在生根培养基上诱导生根; C. GFP基因插入情况的 PCR
检测; 1. DNA分子量标记; 25.转基因小苗.
图 4 洋桔梗转基因小苗的产生与检测
由 35S启动子控制的 GFP蛋白表达后定位于细胞
质中,叶绿体中叶绿素的荧光为红色 (图 5B ), GFP
的绿色荧光与叶绿素的红色荧光没有重叠 (图 5
C ) ,说明 GFP基因插入洋桔梗基因组后可以在转基
因植物叶片细胞中表达出 GFP绿色荧光蛋白。
3 讨论
本研究利用一个带有 GFP绿色荧光蛋白基因
的植物表达载体探讨洋桔梗的转基因方法, 通过考
察 GFP基因在愈伤组组中的表达情况, 在转基因植
株中的插入情况及它在转基因植物叶片中表达情况
确定转化方法是成功的。
112
2010年第 3期 陈奇等:洋桔梗的转基因研究
A. GFP的绿色荧光; B.叶绿素的红色荧光; C. A与 B照片的重叠
图 5 GFP基因在转基因小苗叶片中的表达检测
Semeria等 [ 12]利用基因枪轰击洋桔梗细胞悬浮
培养物,由抗性愈伤组织诱导生成的植株 GUS检测
呈阳性。Ledger等 [ 11]用携带双元载体 pKWl 1 l0和
pLN26的根瘤农杆菌 A722与洋桔梗叶片共培养, 获
得转基因洋桔梗小苗, GUS基因的表达都呈阳性, 洋
桔梗的转化效率为 28% - 33%。Zaceai等 [ 10]把控
制花发育的 LEAFY基因通过农杆菌 EHA105转化洋
桔梗,他们把叶盘浸入用农杆菌菌液后, 抽真空 15
m in,然后转移到 MS培养基上共培养 48 h,在转移到
加有 40mg /L Km的筛选培养基上,把洋桔梗的遗传
转化效率从以前的 1% - 3%提高到 17%。获得了提
前开花的洋桔梗 Fl代, PCR检测表明 BEAT基因己
经整合到洋桔梗基因组中,红花洋桔梗的转化效率不
高 ( 24% ),结果与 Ledger等报道的类似。在本研
究中没有进行叶盘感染前的预培养, 在转染的过程
中也没有抽真空或加入能提高农干菌感染效率的化
学物质,这可能是转化效率不高的原因,今后通过增
加这些环节,可能会提高转化效率。
致谢:昆明纳瑞科技有限公司免费提供激光共聚焦显微镜服务并
指导我们观察叶片中 GFP和叶绿素的荧光,在此表示衷心的感谢!
参 考 文 献
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