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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
HBx与肝细胞脂肪变性关系及可能机制的细胞学研究
郑黎黎 沈薇
(重庆医科大学附属第二医院消化内科，重庆 400010)
摘 要: 从细胞水平探讨乙型肝炎病毒 X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)与肝细胞脂肪变性的关系，并探讨其可
能分子机制。油红 O染色及细胞内甘油三酯含量测定鉴定 HepG2. 2. 15 细胞和 HepG2 细胞的脂变程度;Western blotting检测
HBx，肝 X受体(liver X receptor alpha，LXRα)及脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)蛋白的表达。结果显示，C2. 2. 15组细胞脂
变程度较 CG2组细胞重。O2. 2. 15组细胞在 24，48 及 72 h 的脂变程度及 TG 含量均较同一时间段的 OG2组增加;Western blotting
结果显示，HepG2. 2. 15 细胞内有 HBx蛋白表达，而 HepG2 细胞则无此蛋白表达;C2. 2. 15组细胞 LXRα及 FAS 蛋白表达强度较
CG2组细胞高。HBx蛋白与肝细胞脂肪变性存在密切的关系，其机制可能与 HBx /LXRα /FAS信号通路有关。
关键词: 乙型肝炎病毒 X蛋白 HBV 肝细胞脂肪变性
Relationship and Possible Mechanism of Hepatitis B Virus X Protein
Expression with Hepatic Steatosis
Zheng Lili Shen Wei
(Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400010)
Abstract: Hepatic steatosis occurs in roughly a quarter to a half of patients with chronic hepatitis B (CHB)or chronic hepatitis
C (CHC)． However，the specific functions of hepatitis B virus X protein (HBx) ，which include potential mechanisms of the regulation
of hepatic adipogenic and lipogenic genes，remain to be poorly understood． Here we explored the HBx might be involed in HBV-associ-
ated hepatic steatosis via interacting with LXRα and FAS． Lipid accumulation in HepG2. 2. 15 and HepG2 cells was observed by oil red
O staining and TG content detection． HBx，LXRα and FAS protein expression levels were measured by western blotting． Results
showed that compared with the HepG2 cells，lipid droplets and the TG content were markedly increased in HepG2. 2. 15cells． The HBx
was only existed in HepG2. 2. 15 cells． The expression of LXRα and FAS proteins in HepG2. 2. 15 cells was obviously higher than that
of HepG2 cells． Our results demonstrated that HBx interacts with LXRα，thereby resulting in the up-regulation of FAS which could be
a putative molecular mechanism of HBV-associated hepatic lipid accumulation．
Key words: Hepatitis B virus X protein Hepatitis B virus Hepatic steatosis
收稿日期:2010-02-01
基金项目:国家自然科学基金(30871160)
作者简介:郑黎黎，女，在读硕士，研究方向:脂肪肝发病机制;E-mail:zhenlili1983@ 163． com
通讯作者:沈薇，女，博士生导师，研究方向:脂肪肝发病机制;E-mail:shenwei315@ 126． com
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝
炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是一个严重的公
共卫生问题，全球约 5 亿人为 HBV 或 HCV 慢性感
染，是慢性肝炎，肝纤维化及肝癌的重要病因之
一［1，2］。近年来文献报道，有 27% －51%的慢性乙型
肝炎(chronic B virus hepatitis，CHB)合并肝细胞脂肪
变性，而慢性丙型肝炎(chronic C virus hepatitis，
CHC)约 31% － 72%合并肝细胞脂肪变性［3 － 7］，我们
前期研究也发现 CHB合并脂变率为 20. 8%。有学者
认为肝细胞脂肪变性是 CHB 和 CHC 患者的一个共
同病理改变［8］。目前，HCV 感染能诱导肝细胞脂肪
变性已达成共识，其主要通过 HCV 核心蛋白调控
LXRα等脂代谢关键调控点，从而参与调节宿主脂代
谢，最终引起脂代谢紊乱及肝细胞脂肪变性［9］。HBV
与肝细胞脂肪变性的关系是否存在与 HCV相似的情
况，HBV 是否通过其自身编码的某种蛋白参与肝脂
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
肪变性的发生，国内外研究甚少，但 HBx 蛋白作为由
HBV 基因编码的多功能蛋白，对其功能的研究越来
越受到重视。前期通过对人肝组织的研究得出，HBx
可能通过诱导 LXRα及 FAS高表达参与 HBV相关肝
细胞脂肪变性的发生，本试验将从细胞水平探讨 HBx
蛋白与肝细胞脂肪变性的关系及分子机制。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂
HepG2. 2. 15细胞及 HepG2 细胞均由重庆医科
大学附属第二医院肝炎所惠赠。胎牛血清(杭州四季
青公司) ，MTT 凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司，
鼠抗人 HBx单克隆抗体(Abcam 公司，ab235) ，兔抗
人 FAS多克隆抗体(Santa Cruz 公司，sc-20140) ，鼠
抗人 LXRα单克隆抗体(Abcam 公司，ab41902) ，油
红 O(Sigma 公司) ，TG 检测试剂盒(南京建成生物
研究所) ，核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(南京凯基
生物)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 细胞培养 HepG2. 2. 15 细胞是由包含了二
拷贝 HBV 基因组的质粒转染到人肝癌细胞株 HepG2
细胞所得到的稳定克隆，HepG2. 2. 15 细胞能合成
HBsAg、HBeAg、HBx 和 Dane 颗粒等。HepG2. 2. 15
用含 10%胎牛血清、200 μg /mL G418(Calbiochem
公司)的 RPMI-1640 培养液培养，HepG2 细胞用含
10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液培养。培养条
件均为 37℃，5%CO2 饱和湿度，每 2 － 3 d用 25%胰
酶消化传代。试验选用对数生长期的细胞。
1. 2. 2 试验分组 试验设立 HepG2. 2. 15 细胞对
照组及 HepG2 细胞对照组(培养基中不加油酸钠，
分别记为 C2. 2. 15组及 CG2组) ，HepG2. 2. 15 细胞脂
变组及 HepG2 细胞脂变组(培养基中加油酸钠，分
别记为 O2. 2. 15及 O G2组)。
1. 2. 3 HepG2. 2. 15 和 HepG2 细胞脂变程度的检
测 将 HepG2. 2. 15 及 HepG2 细胞同时接种于 96
孔板中，分别加入不同浓度的油酸钠刺激 24、48 及
72 h，用 MTT比色法确定诱导细胞形成脂肪变性的
最佳浓度及最佳作用时间。选择对细胞会造成一定
损伤，但又不会使细胞大量死亡的浓度作为诱导
HepG2. 2. 15 及 HepG2 细胞脂肪变性的最佳浓度。
用油红 O染色鉴定上述两种细胞在油酸钠诱导下
的脂肪变性程度。油红 O 染色方法:预先将1 cm ×
1 cm 大小的盖玻片放置于 24 孔培养板内，再将
HepG2. 2. 15 及 HepG2 细胞以 5 × 104 /mL 浓度接
种，按上述分组及时间段，每孔一个样本，24 h 细胞
贴壁后开始干预，分别于 24、48、72 h 后取出，PBS
漂洗 3 － 5 次，4%多聚甲醛固定 30 min，双蒸水清洗
残留多聚甲醛，油红 O 染色 22 － 25 min，60%异丙
醇脱底色 30 s，双蒸水清洗残留异丙醇，苏木素细胞
核复染 1 － 2 min，水封片，倒置显微镜下观察细胞内
橘红色脂滴并拍照。
1. 2. 4 细胞内甘油三脂含量的测定 HepG2. 2. 15
及 HepG2 细胞以 5 × 104 /mL浓度分别接种于 12 孔
板中，每孔一个样本，24 h 细胞贴壁后开始干预。
分别用含 40 μg /mL油酸钠的 RPMI-1640 培养基培
养 24、48 及 72 h 后收集细胞，反复冻融裂解细胞，
3 000 r /min离心 10 min，取上清液检测 TG 的含量，
按试剂盒说明进行操作。
1. 2. 5 Western blotting 检测 LXRα 及 FAS 蛋白表
达差异 将 HepG2. 2. 15 及 HepG2 细胞 5 × 106 －
1 × 107个 /mL，胰酶消化，4℃ 500 × g 离心，3 min 收
集细胞，弃去培养液，预冷 PBS 洗 3 次，按试剂盒说
明书提取总蛋白、胞浆及胞核蛋白。BCA 法测蛋白
浓度， － 70℃ 冻存。HBx 蛋白上样到 15% SDS-
PAGE中，FAS蛋白上样到 6% SDS-PAGE 中，LXRα
蛋白上样到 10% SDS-PAGE 中，每泳道 20 μg 上样。
转膜后将膜各自加入 HBx 抗体(1 ∶ 1 000 稀释) ，
FAS抗体(1 ∶ 1 000 稀释) ，LXRα 抗体(1 ∶ 1 000 稀
释)中孵育过夜，PBS-Tween 洗 3 次，再放入二抗中
2 h 后 ECL显色。
1. 2. 6 统计学处理 统计学处理采用 SPSS12. 0
软件进行分析，两样本均数间比较采用 t 检验，多
个样本均数的比较采用方差分析，多个样本均数间
的两两比较采用 q 检验(Newman-Keuls 法) ;P ＜
0. 05 为差异有统计学意义，结果用 x
— ± s 表示。
2 结果
2. 1 油酸钠作用浓度的确定
MTT检测提示油酸钠浓度超过 40 μg /mL 时吸
光度值下降明显，对细胞增殖影响较大，故选取 40
μg /mL作为油酸钠最佳诱导浓度，最佳作用时间为
24、48、72 h(表 1)。
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2. 2 油红 O染色鉴定培养细胞脂肪变性程度
油红 O染色显示 C2. 2. 15组及 CG2组细胞胞浆中
仅见少量橘红色脂滴，且 C2. 2. 15组细胞内脂变程度
高于 CG2组细胞(图 1，图 2)。40 μg /mL 油酸钠处
理后 O2. 2. 15组及 OG2组细胞胞浆中有明显的大小不
等的橘红色脂滴聚集，且随时间延长，细胞胞浆中脂
滴逐渐增多;与 OG2组相比，同一时间段的 O2. 2. 15组
细胞脂滴较多(图 1 －图 8)。
2. 3 两种细胞甘油三酯(TG)含量的比较
C2. 2. 15组及 CG2组细胞的 TG 含量并未随着培养
时间的延长而增加，因此培养时间对 HepG2. 2. 15 及
HepG2细胞 TG含量的影响可忽略不计，P 值分别为
0. 6271及 0. 2273;但是 C2. 2. 15组 TG含量高于 CG2组，
差异有显著性，t = 2. 2028，P = 0. 0384。O2. 2. 15组在
24，48，72 h的 TG含量均比同一时间段 O G2组增加，
差异有统计学意义(表 2)。
表 1 不同浓度的油酸钠对 HepG2. 2. 15 细胞及 HepG2 细胞 OD值的影响(x－ ± s，n =3)
细胞株 时间(h)
油酸钠浓度(μg /mL)
0 20 40 60
HepG2. 2. 15 24 2. 69 ± 0. 30 2. 61 ± 0. 33 2. 43 ± 0. 26 1. 76 ± 0. 28
48 2. 77 ± 0. 29 2. 71 ± 0. 29 2. 49 ± 0. 27 1. 65 ± 0. 23
72 2. 84 ± 0. 31 2. 78 ± 0. 29 2. 56 ± 0. 33 1. 34 ± 0. 31
HepG2 24 2. 67 ± 0. 22 2. 55 ± 0. 24 2. 40 ± 0. 25 1. 68 ± 0. 23
48 2. 79 ± 0. 27 2. 64 ± 0. 24 2. 45 ± 0. 30 1. 55 ± 0. 25
72 2. 88 ± 0. 22 2. 70 ± 0. 22 2. 52 ± 0. 24 1. 26 ± 0. 26
图 1 C2. 2. 15组 油红 O染色(400 ×)
图 2 CG2组 油红 O染色(400 ×)
图 3 O2. 2. 15组 24 h油红 O染色(400 ×)
图 4 OG2组 24 h 油红 O染色(400 ×)
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图 5 O2. 2. 15组 48 h 油红 O染色(400 ×) 图 7 O2. 2. 15组 72 h油红 O染色(400 ×)
图 6 OG2组 48 h 油红 O染色(400 ×) 图 8 OG2组 72 h 油红 O染色(400 ×)
表 2 两种细胞内甘油三脂含量的比较［mg/(107细胞)，n =12］
组别
培养时间(h)
0 24 48 72
F P
C2. 2. 15组 2. 42 ± 0. 46 2. 53 ± 0. 44 2. 59 ± 0. 39 2. 65 ± 0. 48 0. 59 0. 6271
CG2组 2. 06 ± 0. 33 2. 12 ± 0. 31 2. 27 ± 0. 28 2. 29 ± 0. 35 1. 50 0. 2273
O2. 2. 15组 2. 42 ± 0. 46 7. 98 ± 0. 54a 12. 16 ± 0. 47bd 16. 38 ± 0. 52ce
OG2组 2. 06 ± 0. 33k 5. 47 ± 0. 31fl 10. 98 ± 0. 41gim 13. 76 ± 0. 38hjn
同一行(列)中小写字母不同表示差异极显著(P ＜ 0. 01)
2. 4 Western blotting 检测 HepG2. 2. 15 与 HepG2
细胞间 HBx蛋白的表达差异
HepG2. 2. 15 细胞中有 HBx 蛋白的表达，而
HepG2 细胞中未检测到 HBx蛋白的存在(图 9)。
2. 5 Western blotting 检测 HepG2. 2. 15 及 HepG2
细胞中 LXRα及 FAS蛋白表达差异
C2. 2. 15组细胞内 LXRα 及 FAS 蛋白表达强度较
CG2组细胞高。O2. 2. 15组及 OG2组细胞在 0、24、48、72
h随时间延长 LXRα 及 FAS 蛋白表达均逐渐增加，
差异有统计学意义。与 OG2组细胞相比，在同一时
间段，O2. 2. 15组细胞 LXRα 及 FAS 蛋白表达明显增
加(图 10，图 11)。
1． HepG2． 2． 15;2． HepG2
图 9 HepG2. 2. 15 与 HepG2 细胞间
HBx蛋白的表达差异
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1．未处理组 HepG2. 2. 15 细胞;2．处理组 HepG2. 2. 15 细胞24 h;
3．处理组 HepG2. 2. 15 细胞 48 h;4．处理组 HepG2. 2. 15 细胞 72
h;5．未处理组 HepG2 细胞;6．处理组 HepG2 细胞24 h;7．处理组
HepG2细胞 48 h;8．处理组 HepG2细胞 72 h
图 10 HepG2. 2. 15 及 HepG2 细胞内 LXRα及
FAS蛋白表达差异
3 讨论
脂质(主要是甘油三酯)在肝细胞内沉积即被
定义为肝细胞脂肪变性，越来越多的研究表明肝细
胞脂肪变性与肝脏炎症，肝纤维化及肝癌密切相关，
并且发现 CHB及 CHC作为常见的慢性肝病，常合并
肝细胞脂肪变性［10，11］。有关 HCV与肝细胞脂肪变性
的关系及分子机制已基本研究清楚，HCV尤其是基因
3型 HCV的核心蛋白通过调节 LXRα等脂代谢关键基
因的表达，参与调控宿主肝细胞脂代谢，最终引起脂代
谢紊乱及脂肪变性［9］，而 HBV与肝细胞脂肪变性的关
系是否与HCV类似，国内外鲜有报道。
HBx是由 HBV 的 X 开放阅读框架(open read-
ing frame，ORF)编码的一种具有反式激活作用的多
功能蛋白质。HBx 参与许多信号转导通路，在调节
基因转录、细胞信号转导、控制细胞增殖和转化中具
有重要作用，最近有研究显示 HBx 可能参与了肝脂
肪变性的发生［12，13］。LXRα 属于核受体超家族，在
肝脏高度表达，与视黄醇类 X 受体(retinoid X re-
ceptor，RXR)结合形成异二聚体后与靶基因中称
为 LXR 反应元件(LXR response element，LXRE)的
特定核苷酸序列结合，促进许多靶基因如 FAS 基因
的表达，从而调控和维持脂肪酸代谢平衡［14］。前期
通过对人肝组织的研究得出 HBx 可能通过诱导
LXRα及 FAS 高表达参与 CHB 合并肝脂肪变性的
发生。但有关细胞学方面的研究甚少，因此拟从细
胞学水平探讨 HBx 蛋白与肝细胞脂肪变性的关系
及可能机制。
1． C2． 2． 15组;2． O2． 2． 15组 24 h;3． O2． 2． 15组 28 h;4． O2． 2． 15组 72 h;
5． CG2组;6． OG2组 24 h;7． OG2组 48 h;8． OG2组 72 h
图 11 HepG2. 2. 15 及 HepG2 细胞内 LXRα及
FAS蛋白表达差异
HepG2. 2. 15 细胞是由包含了二拷贝 HBV 基因
组的质粒转染到人肝癌细胞株 HepG2 细胞所得到
的稳定克隆，HBx 蛋白是 HBV 基因组编码的非结
构蛋白。本试验通过 Western blotting方法检测发现
HepG2. 2. 15 细胞中有 HBx 蛋白表达，而 HepG2 细
胞中无此蛋白表达，因此选择 HepG2. 2. 15 细胞及
HepG2 细胞作为本次研究的细胞模型。油红 O 染
色及细胞内甘油三酯含量测定显示 C2. 2. 15组细胞内
脂变程度较 CG2组细胞重。O2. 2. 15组及 OG2组细胞内
橘红色脂滴及 TG含量呈时间依赖性增加，且 O2. 2. 15
组细胞在 24、48 及 72 h的脂变程度及 TG含量均较
同一时间段的 OG2组增加。
Western blotting 显示 HepG2. 2. 15 细胞 中有
HBx蛋白表达，而 HepG2 细胞内始终无 HBx蛋白表
达。C2. 2. 15组细胞 LXRα 及 FAS 蛋白表达强度较
CG2组细胞高。O2. 2. 15组及 OG2组细胞中 LXRα 及
FAS蛋白表达均呈时间依赖性增加，但 OG2组细胞
表达强度较 O2. 2. 15组低。Western blotting 得出的结
果与油红 O及 TG测定结果一致。在前期的研究中
发现，HBV 相关性肝细胞脂肪变性与 HBsAg、HB-
sAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、病毒复制 HBV-DNA载
量、病理组织学炎症分级以及纤维化分期均无关，而
是与 HBx 蛋白有关。Kim 等［12，13］的研究也发现
HBx可能通过诱导 LXRα 及 FAS 高表达参与 HBV
相关性肝细胞脂肪变性的发生，由此推测 C2. 2. 15组及
O2. 2. 15组细胞内 HBx蛋白的表达诱导了 LXRα及 FAS
表达上调，而 CG2组及 OG2组细胞中由于无 HBx 蛋白
存在，所以 LXRα及 FAS 蛋白表达分别较 C2. 2. 15组及
O2. 2. 15组低(图 11) ，最终导致 C2. 2. 15组和 O2. 2. 15组细胞
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
橘红色脂滴及 TG含量均高于 CG2组和 OG2组。
综上可知，HBV可能主要通过其编码的 HBx蛋
白参与肝细胞脂肪变性的发生，其机制可能与
LXRα-FAS通路有关，即 HBx 蛋白上调 LXRα 表达
水平，进而引起脂肪酸合成酶表达增强，最终引起脂
代谢紊乱及脂肪变性。
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