全 文 ：雪灵芝提取物对 HepG2.2.15细胞株 HBsAg
与 HBeAg表达的影响
唐庆年 1 ,冯　梅2＊ ,龚受基 2 ,戴支凯 2 ,周以智3 ,徐　庆 2
(1.广西桂林解放军第 181医院药剂科 ,广西桂林 541002;2.桂林医学院药理学教研室 ,广西桂林 541002;
3.西藏阿仲嘎保生物制品有限公司 ,西藏拉萨 850000)
　　摘要　目的:探讨雪灵芝提取物对 HepG2.2.15细胞株 HBsAg与 HBeAg表达的影响。方法:应用 HepG2.2.15
细胞系培养系统检测雪灵芝提取物对 HBsAg与 HBeAg表达的影响。结果:雪灵芝醇提物和水提物各剂量组(50 ～
400mg/L)孵育 HepG2.2.15细胞株 72、96h后抑制了 HBsAg和 HBeAg的表达(与正常对照组比较 , P<0.01),并
呈浓度和时间依赖性。其中雪灵芝醇提物在实验 72、96h对 HBeAg最大抑制率分别为 63.2%和 90.8%;雪灵芝水
提取物在实验 96h对 HBsAg和 HBeAg的最大抑制率分别为 52.5%和 72.8%。结论:雪灵芝醇提物和水提物体外
均有明显的抗乙肝病毒作用 ,但醇提物细胞毒性较大 , 而水提物作用确切且毒性较低。
关键词　雪灵芝;HepG2.2.15;HBsAg;HBeAg;HBV
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)08-1212-05
TheEfectsofExtractsfromArenariakansuensisontheLevelsofHBsAg
andHBeAginHepG2.2.15 Cels
TANGQing-nian1 , FENGMei2 , GONGShou-ji2 , DAIZhi-kai2 , ZHOUYi-zhi3 , XVQing2
(1.The181sthospitalofP.L.A, Guilin541002, China;2.GuilinMedicalColege, Guilin541004, China;3.TibetA.kansuensisBio-
logicalProductsCo.Ltd, Lasa850000, China)
Abstract　Objective:Toinvestigatetheanti-HBVeffectsoftheextractswithalcoholandwaterfromArenariakansuensisinvitro.
Methods:HepG2.2.15celswereusedtoestimatetheefectsoftheextractswithalcoholandwaterfromArenariakansuensisonthelev-
elsofHBsAgandHBeAginmediumbyELISA.Results:IncubationofHepG2.2.15 cellswithboththeextractswithalcoholandwater
fromArenariakansuensis(50 ～ 400 mg/L)for72and96hsignificantlyinhibitedthelevelsofHBsAgandHBeAg.Themaximumin-
hibitingrateofHBeAgfromtheArenariakansuensisextractswithalcoholwas63.2% and90.8% at72hand96h, respectively.Mean-
while, theArenariakansuensisextractswithwaterhadobviousinhibitoryeffectsonthelevelsofHBsAgandHBeAginHepG2.2.15
celsat96h, comparedwiththatofthecontrolgroup(P<0.01).Themaximuminhibitingrateswere52.5% and72.8%, respective-
ly.Conclusion:TheextractswithwaterfromArenariakansuensishasobviousanti-HBVeffectsinvitro.
Keywords　ArenariakansuensisMaxim;HepG2.2.15cells;HepatitisBsurfaceantigens;HepatitisBeantigens;HepatitisB
virus
作者简介:唐庆年(1970-),女,临床药师 ,从事临床药学工作;Tel:13087736415。＊通讯作者:冯梅(1971-),女 ,讲师 ,硕士 ,主要从事心血管疾病的基因治疗及中药药理学研究。
　　乙型肝炎是由乙型肝炎病毒 (HBV)引起的一
种严重危害人类健康和生命的全球性传染性疾病 ,
HBV持续感染与肝硬化和原发性肝细胞肝癌等的
发生发展密切相关 〔1〕。我国属乙肝大国 ,近年来乙
肝的发病率呈持续上升的趋势 。迄今尚无根治乙肝
的良药 ,常用的抗病毒药物如干扰素和拉米呋啶疗
效差强人意 ,寻找安全有效的抗 HBV药物已成为当
今医药学界的一项迫切任务〔2〕。
雪灵芝 ,又名草灵芝 ,学名卵瓣蚤缀(Arenaria
kansuensisvar.ovatipetalaTsui), 藏药名为阿仲嘎
保 ,为高原野生植物 ,属石竹科(Caryophylacea)蚤
缀属(Arenaria)甘肃蚤缀 (ArenariakansuensisMax-
im),为多年生垫状草本植物 ,生长在青藏高原海拔
约 4000 ～ 5000米左右的高山草甸和石缝中 ,是一种
珍贵的野生藏药资源 〔3〕 ,有清热解毒 ,利胆退黄 ,通
淋止痛的功效 。国内学者发现雪灵芝对小鼠免疫性
肝炎有明显的治疗作用 ,使血清谷丙转氨酶的活性
显著降低 〔4〕。另有研究表明雪灵芝能降低酒精性
肝损伤大鼠肝脏中丙二醛 、甘油三酯含量 ,增加还原
型谷胱甘肽的水平 。但其对 HBV所致的病毒性肝
炎是否具有保护作用尚无文献报道。本实验选用
HepG2.2.15细胞株作为乙肝细胞模型 ,观察其对乙
肝表面标志物 HBsAg与 HBeAg表达的影响 ,以期
为雪灵芝的进一步开发利用提供实验依据。
·1212· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.08.042
1 　材料与方法
1.1 　材料　HepG2.2.15细胞系 ,购自北京大学医
学院第一附属医院病毒研究所;细胞培养基 RPMI
1640为 GibcoBRL产品;胎牛血清(FBS)购自杭州
四季青生物工程材料有限公司;谷氨酰胺 、G418
(Gibco分装)、胰蛋白酶 、MTT、DMSO为 Amresco公
司产品;HBsAg、HBeAgELISA检测试剂盒为上海荣
盛生物技术有限公司 , 批号分别为 20070202和
20070407;拉米呋啶片(国药试字 2000004,葛兰素
史克制药有限公司 ,中国苏州 ,批号 03010041);其
余为分析纯试剂。二氧化碳培养箱 (MCO3/15AC,
日本三洋);倒置显微镜 (XSB3/IA,上海);超净工
作台(天津尘埃净化设备厂);96孔细胞培养板
(Corning美国);CF2500酶标仪(美国)。雪灵芝由
西藏阿仲嘎保生物制品有限公司提供 。
1.2 　方法
1.2.1　雪灵芝的提取:雪灵芝全草粉碎 ,以 6倍量
的 95 %乙醇加热回流提取三次 ,每次 1 h,合并提取
液 ,浓缩干燥得雪灵芝乙醇提取物。残渣挥干乙醇 ,
以六倍量蒸馏水加热回流提取三次 ,每次 1 h,合并
提取液 ,浓缩干燥得雪灵芝水提取物 〔5〕。
1.2.2　HepG2.2.15细胞株的培养:在 RPMI1640
中加入 380 mg/LG418, 10 %胎牛血清 , 2 mmol/L
谷氨酰胺 , 100U/ml青霉素及 100 mg/L链霉素 ,接
种于培养瓶 , 置 37℃、 5%CO2 的培养箱中常规培
养 。待细胞约 80%融合时 ,进行传代培养。
1.2.3　实验分组:将对数生长期的 HepG2.2.15
细胞按 104 /ml接种于 96孔细胞培养板中 ,每孔 180
μl;待细胞贴壁(24h)后加药 ,分为 5组:空白对照
组:10% FBS的 RPMI1640培养基;雪灵芝醇提取
物组:400、200、100、50 mg/L;雪灵芝水提取物:400、
200、100、50 mg/L;阳性对照组:拉米呋啶(10-6 mol/
L);溶媒对照组:1%DMSO。每个浓度设 3复孔 ,每
孔 20 μl(各药物终浓度中含 1%DMSO), 37℃, 5 %
CO2分别孵育 72、96h后测定培养基上清液中 HB-
sAg与 HBeAg的表达。
1.2.4　HBsAg与 HBeAg含量的测定:按 HBsAg、
HBeAg的 ELISA试剂盒说明 ,采用双抗体夹心法 ,
用波长为 450 nm酶标仪测定 HepG2.2.15细胞株
培养基上清液中 HBsAg与 HBeAg的吸光度 A值 。
计算雪灵芝提取物对 HBsAg、HBeAg表达的抑制率
〔6〕。
　　抑制率(%)=(实验孔 P/N-对照孔 P/N)÷(对照孔
P/N-2.1)×100%(注:P/N为 HBsAg或 HBeAg的阳性孔
A值 /阴性孔 A值)
1.2.5 　MTT法测定药物对细胞的毒性:用 MTT法
测定细胞数以反映药物对细胞的毒性。活细胞中的
线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色 MTT还原为蓝紫
色的结晶 formazan,后者的产量与活细胞数成正相
关 , formazan可被二甲基亚砜(DMSO)溶解 ,在酶标
仪上读取光密度可反映活细胞数 。培养结束前 4 h,
每孔加入 5 g/L的 MTT溶液 20 μl,继续孵育 4 h后
中止培养 ,去培养液 ,每孔加入 150μlDMSO,室温下
静置 5 ～ 10 min后 ,待 formazan完全溶解后 ,用酶标
仪在 570 nm处测定吸光度 A值 〔7〕。计算细胞存活
率及治疗指数 。
　　细胞存活率(%)=(实验孔 A值 /对照孔 A值)×
100%
治疗指数(TI)=TC
50
/IC
50
。 (TC
50
是实验孔存活细胞
为对照孔 50%时的药物浓度 , 当 TI> 2时为有效 , TI= 1
时为低效高毒 , TI<1时为无效)
1.2.6 　统计学处理:数据用 x±s表示 , 采用
SPSS10.0统计分析软件 ,对组间实验数据进行方差
分析以及 Dunnet两两比较 。若组间方差不齐 ,则
用非参数秩和检验 ,以 P<0.05认为有显著性差异。
2　结果
2.1　雪灵芝醇提取物对 HepG2.2.15细胞株 HB-
sAg和 HBeAg表达的影响　雪灵芝醇提取物各剂
量组孵育 HepG2.2.15细胞株 72、 96h后抑制了
HBsAg和 HBeAg的表达 ,并呈现出浓度依赖性和时
间依赖性 ,详见表 1、2。 72hHBeAg的 IC50为 46.456
mg/L, TI=1.80;96 hHBeAg的 IC50为 54.825 mg/
L, TI=3.54,提示雪灵芝醇提取物对 HBeAg的表达
有明显的抑制作用 。
2.2　雪灵芝水提取物对 HepG2.2.15细胞株 HB-
sAg和 HBeAg表达的影响　雪灵芝水提取物各剂
量组孵育 HepG2.2.15细胞株 72、96h后也抑制了
培养基上清液中 HBsAg和 HBeAg的表达 , 亦呈现
出浓度依赖性和时间依赖性 ,详见表 3、4。 HBsAg
的 IC50为 298.89 mg/L, TI=3.17;HBeAg的 IC50为
150.901 mg/L, TI=6.28, 提示雪灵芝水提取物对
HBsAg和 HBeAg的表达抑制作用明确而且毒性较
低。除此之外 , 1% DMSO的溶媒对照组和 10-6mol/
L拉米呋啶对 HBsAg、HBeAg的表达及细胞存活率
与正常对照组相比没有明显差异 。
3　讨论
慢性乙型肝炎病毒感染是人类最严重的感染性
疾病之一 。有数据显示 ,全球超过 4亿人罹患慢性
HBV感染 ,每年约有 100万人因此丧生。在我国 ,
慢性乙肝病毒携带者达到了 1.2亿左右 ,并有三千
·1213·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月
　　表 1 　雪灵芝醇提取物对 HepG2.2.15细胞株 HBsAg表达的影响( x±s, n=3)
浓度(mg/L)
72h
A 抑制率(%) 细胞存活率(%)
96h
A 抑制率(%) 细胞存活率(%)
空白对照组 0.110±0.006 - 100.0 0.157±0.012 - 100.0
400 0.077±0.004＊＊ 　45.1 29.4 0.075±0.006＊＊ 70.2 27.6
200 0.084±0.010＊＊ 　36.5 22.5 0.084±0.005＊＊ 2.3 19.0
100 0.125±0.076 -20.3 45.4 0.124±0.005＊＊ 27.9 52.7
50 0.096±0.008＊ 　19.3 64.9 0.178±0.027 -17.4 100.0
　　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊ P<0.01。下表同
　　表 2 　雪灵芝醇提取物对 HepG2.2.15细胞株 HBeAg表达的影响( x±s, n=3)
浓度(mg/L)
72h
A 抑制率(%) 细胞存活率(%)
96h
A 抑制率(%) 细胞存活率(%)
空白对照组 1.216±0.107 - 100.0 2.724±0.139 - 100.0
400 0.468±0.438＊＊ 63.2 29.4 0.285±0.037＊＊ 90.8 27.6
200 0.606±0.623 1.6 22.5 0.381±0.060＊＊ 87.2 19.0
100 0.579±0.273＊＊ 3.9 45.4 0.682±0.055＊＊ 76.0 52.7
50 0.578±0.236＊＊ 54.0 64.9 1.499±0.136＊＊ 45.6 100.0
　　表 3 　雪灵芝水提取物对 HepG2.2.15细胞株 HBsAg表达的影响( x±s, n=3)
浓度(mg/L)
72h
A 抑制率(%) 细胞存活率(%)
96h
A 抑制率(%) 细胞存活率(%)
空白对照组 0.110±0.006 - 100.0 0.157±0.012 - 100.0
400 0.082±0.013＊＊ 38.6 86.8 0.095±0.013＊＊ 52.5 88.7
200 0.090±0.003＊＊ 28.0 92.8 0.110±0.007＊＊ 39.7 100.0
100 0.090±0.016 28.0 94.8 0.118±0.015＊＊ 32.9 99.8
50 0.092±0.002＊＊ 24.4 79.9 0.149±0.025 6.8 97.4
　　表 4 　雪灵芝水提取物对 HepG2.2.15细胞株 HBeAg表达的影响( x±s, n=3)
浓度(mg/L)
72h
A 抑制率(%) 细胞存活率(%)
96h
A 抑制率(%) 细胞存活率(%)
空白对照组 1.216±0.107 - 100.0 2.724±0.139 - 100.0
400 0.810±0.027＊＊ 34.3 86.8 1.058±0.530＊＊ 62.0 88.7
200 0.748±0.191＊＊ 39.6 92.8 0.768±0.593＊＊ 72.8 100.0
100 0.920±0.087＊＊ 25.0 94.8 1.620±0.198＊＊ 41.1 99.8
50 0.917±0.035＊＊ 25.3 79.9 2.181±0.135＊＊ 20.2 97.4
万慢性乙肝患者 。更严重的是感染的个体还可能发
展为肝硬化和肝癌 ,危害性极大 。目前 HBV感染的
治疗效果仍不尽如人意 ,仅有 20%的患者得益于重
组干扰素和核苷类似物如拉米呋啶的使用 〔8-11〕 ,寻
找更有效的抗 HBV感染的治疗药物已迫在眉睫 。
HepG2.2.15细胞株系 1986年 Sureau等利用
电穿孔基因转移技术以重组载体 pHolTHBV-1转染
人肝癌细胞株 HepG2 ,经 G418筛选后获得的一个
产生高水平 HBsAg、HBeAg的细胞克隆 。获得的转
染细胞成功地表达了 HBV的全部病毒标志 ,并在培
养上清液及细胞裂解物中证实了 Dane颗粒的存在。
此细胞株携带 HBV-DNA包括染色体整和序列及染
色体外松弛环状 、共价闭合环状和不完全拷贝的
HBV基因组 ,能够长期 、稳定地向培养上清液中表
达 HBsAg、HBeAg和 HBV颗粒 ,并仍有感染性 ,将
HepG2.2.15细胞培养上清静脉注射黑猩猩 , 可致
·1214· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月
典型肝炎 ,证实 HBV转染 HepG2细胞能够支持病
毒体的复制 〔12〕。而且它与正常肝细胞相比 ,具有相
似的形态学和生理学功能 ,是目前各实验室广泛用
于筛选和评价抗 HBV药物较好的细胞模型 ,现已成
为申报肝炎新药必具的抗病毒实验模型。本实验室
曾经多次利用此细胞模型对抗乙肝药物进行筛选 ,
均获得了较好的结果 〔13, 14〕。因此本实验选用
HepG2.2.15细胞株作为研究雪灵芝提取物抗乙肝
病毒的作用是合理而可行的。
雪灵芝的使用历史悠久 ,其性寒 ,味苦 ,有清热
解毒 、利胆退黄 、通淋止痛之功 ,主治流感 、肺炎 、黄
疸 、筋骨疼痛 、淋病等 。研究表明雪灵芝含有多种生
物活性物质 , 18种氨基酸(其中包括 8种必需氨基
酸)和 10余种微量元素 ,并含有多种维生素和较多
的钙。此外 ,还含有雪灵芝素 A、B、C、D〔15〕 ,是一种
颇具前景的民间用药 。本实验结果表明 ,雪灵芝醇
提取物对 HBeAg的表达抑制作用明显 , 96h的治疗
指数为 3.54,但对 HBsAg表达的抑制作用较弱 ,治
疗指数较低 ,综合实验结果表明雪灵芝醇提取物抗
乙肝作用较弱而细胞毒性较大。雪灵芝水提物对
HBsAg和 HBeAg两种抗原的表达均有抑制作用 ,且
在 96h达高峰 , 同时治疗指数较高 ,分别达到了
3.17和 6.28。说明雪灵芝水提物抗乙肝作用确切
而且毒性较低 。目前多数学者认为 HBV主要是通
过细胞免疫反应引起病变的 ,患者的细胞免疫反应
强弱是决定肝炎病变轻重的重要因素 。彭宝珠等人
研究证明 ,雪灵芝不论是水提液还是醇提液均有抗
炎 、抗免疫作用 ,而且是一种免疫调节剂 ,小剂量抑
制免疫 ,大剂量则增强免疫 ,其抗炎 、抗免疫作用类
似可的松。因此雪灵芝还可能通过其免疫调节作用
来发挥抗乙肝作用。
抗 HBV的化学合成药物中 ,目前研究最多的是
核苷类药物 ,主要有拉米呋啶 、更昔洛韦 、泛昔洛韦
等 ,其中以拉米呋啶疗效最为确切 〔16〕。细胞研究证
实 ,拉米呋啶能有效抑制 HBV复制 ,但仅仅抑制病
毒 DNA的复制量及其复制中间体的产量 〔17〕 ,因此
在停止用药后可发生反跳 ,长期用药可产生耐药性 。
笔者在研究中发现 ,拉米呋啶对 HepG2.2.15细胞
株 HBsAg、HBeAg的表达几乎无影响 ,这与本实验
室以前的研究结果及国内外其他学者的报道一
致 〔18-20〕。
综上所述 ,雪灵芝水提物体外抗乙肝病毒的作
用明确 、毒性低 ,因此有望成为一种新型的抗乙肝病
毒药物 ,在治疗慢性乙肝方面具有广阔的应用前景 。
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(2008 -01-09收稿)
＊通讯作者:王茜莎 ,女 ,药理学博士 ,讲师;Tel:13544561087, E-mail:wxs 521@ 163.com。
陆英不同工艺提取物对四氯化碳致
小鼠肝损伤的影响实验研究
朱少璇 1 ,廖琼峰3 ,王茜莎 2＊ ,邱玉文 1 ,杨　威1 ,朱　庆 1
(1.广州市医药工业研究所 ,广东广州 510240;2.广东药学院 ,广东广州 510240;3.广州中医药大学 ,广东
广州 510240)
　　摘要　目的:筛选陆英具有保肝降酶作用的优选提取工艺 , 并探讨陆英中保肝降酶的活性部位。方法:采用了
小鼠急性 CCl4肝损伤模型 ,对陆英不同提取工艺所得的提取物进行保肝降酶药效学筛选 ,并把筛选出的最佳工艺
提取物用不同溶剂萃取法和大孔吸附树脂分离法对活性部位进行了探索。结果:陆英 75%乙醇提取物能非常显著
地对抗 CCl4导致小鼠肝损伤 , 效果优于其他提取工艺;陆英 75%乙醇提取物经乙酸乙酯萃取部分能减少 CCl4导致
小鼠肝损伤 , 效果明显弱于陆英 75%乙醇总提物 , 而石油醚 、正丁醇和水萃取部分则无明显效果;陆英 75%乙醇提
取物经大孔吸附树脂纯化后 30%、60%和 95%乙醇洗脱液的高剂量和低剂量组均能对抗 CCl4导致小鼠肝损伤 ,但
30%乙醇洗脱液的作用最显著 , 并呈现剂量依赖性 ,且效果与陆英 75%乙醇总提物相似。结论:75%乙醇为陆英的
优选提取溶剂 , 陆英 75%乙醇提取物若经不同极性溶剂萃取 , 活性部位为乙酸乙酯萃取部分;若经大孔树脂纯化 ,
则活性有效部分主要集中在 30%乙醇洗脱液部分。
关键词　陆英;提取工艺;CCl4;急性肝损伤;大孔树脂
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)08-1216-04
ResearchonActivePartofSambucuschinensisAgainstHepatitisMiceInducedbyCCl4
ZHUShao-xuan1 , LIAOQiong-feng3 , WANGXi-sha2 , QIUYu-wen1 , YANGWei1 , ZHUQing1
(1.PharmaceuticalIndustrialResearchInstituteinGuangzhou, Guangzhou510240, China;2.GuangdongPharmaceuticalUniversity,
Guangzhou510240, China;3.GuangzhouUniversityoftraditionalChineseMedicineGuangzhou510240, China)
Abstract　Objective:ToinvestigatethebestextractionprocessofSambucuschinensisagainsthepatitisandresearchonitsactive
part.Methods:WestudiedtheprotectiveefectsofdifferentextractsofSambucuschinensisdistilledbydifferentextractionprocesson
miceacutehepaticinjuryinducedbyCCl4 , andsearchedfortheactivepartofSambucuschinensisagainsthepatitisfromthebestextract
byextractionwithdifferentsolventandpurificationwithmacroporousadsorptionresin, thenstudiedtheirprotectiveeffectsonmiceacute
hepaticinjuryinducedbyCCl
4
.Results:TheextractionofSambucuschinensisby75% alcoholshowedverysignificantlyprotective
effectsonmiceacutehepaticinjuryinducedbyCCl4 andtheefectswerebetterthanthatofotherextractionprocess.Theextractionelu-
tedby30% alcoholafterpurificationwithmacroporousadsorptionresinandextractedbyEtOAcintheextractionofSambucuschinensis
by75% alcoholallshowedsignificantlyprotectiveefectsonmiceacutehepaticinjuryinducedbyCCl4 , andtheeffectsoftheextraction
elutedby30% alcoholafterpurificationwithmacroporousadsoptionresinwerebeterthanextractionwithEtOAc.Conclusions:Thebest
extractionsolventis75% alcohol.TheactivepartofSambucuschinensisagainsthepatitisistheextractionelutedby30% alcoholafter
purificationwithmacroporousadsorptionresinandextractionwithEtOAc.
Keywords　SambucuschinensisLindl.;Extractionprocess;CCl4;Acutehepaticinjury;Macroporousadsorptionresin
·1216· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月