全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-03
基金项目:河南科技学院博士启动基金(6002)
作者简介:郑玉姝(1977-),博士,副教授,主要从事分子病毒学与免疫学研究
基因组是病毒攻击的敏感位点。生物体如何保
护自身的基因组免受病毒的攻击呢?近年来发现了
一种真核生物中保守的防御机制。这种保护机制有
RNA水平上特异性识别、清除入侵核酸分子的能
力,故被称为分子免疫系统[1]。目前已知该系统是
广泛存在于生物体内的一些小 RNA分子如小干扰
RNAs(small interfering RNA,siRNA) 和 微 RNAs
(microRNA,miRNA),它们能以序列特异性方式介
导靶 mRNA降解或抑制其翻译,从而导致靶基因
沉默,称为 RNAi或 RNA沉默。最近,已经提出
RNA介导这种抵抗机制是一种抵制转基因、转座
子和病毒攻击的古老免疫形式[2],这提示 RNAi有
用作抗病毒感染的潜力,大量的尝试也取得了
令人鼓舞的成果,就这方面的研究进展作以综
述。
1 基因免疫系统的理论基础
1.1 RNAi的机制
当小 RNA由入侵双链 RNA(double-stranded
RNA,dsRNA)诱导产生时,它们被视为 siRNAs;然
而,如果小 RNA由细胞内产生,作为固有 RNA折
叠成不完整的发夹结构,则称为微RNA(microRNA,
miRNA)。
1.1.1 siRNA siRNAs通过核糖核酸酶Ⅲ(ribonuc-
lease-III,RNaseIII)相关酶 Dicer切割产生,以一种
ATP依赖的方式逐步切割成长约 21~25nt siRNA双
链体。然后该 siRNA双链体被 RNA解旋酶展开和
装配入 RNA诱导沉默复合 (RNA-induce silencing
complex,RISC),该复合物由内切核酸酶和外切核
酸酶和解旋酶等多种酶活性,在 ATP存在下,siRNA
双链解旋,暴露解链 siRNA的反义部分,通过与同
RNAi—分子免疫系统
郑玉姝 赵朴 贾贝贝 刘兴友
(河南科技学院动物科学学院,新乡 453003)
摘 要: RNA干扰(RNA interference,RNAi)或RNA沉默是广泛存在于从植物到哺乳动物的真核生物体中小
RNA诱导的基因沉默机制。该领域新的研究进展清楚表明在植物和动物中RNAi起着天然抗病毒作用。因此,RNAi常
被视为有效的分子免疫系统。深入理解该分子免疫系统非常有助于揭示一些病毒病的致病机制和开发有效的抗病毒疗
法。因此,就该分子免疫系统的研究进展作以综述。
关键词: RNAi分子免疫系统 抗病毒
RNAi—Molecular Immune System
Zheng Yushu Zhao Pu Jia Beibei Liu Xingyou
(Department of Animal Science and Technology,He an I stitute of Science and Technology,Xinxiang 453003)
Abstract: RNA interference(RNAi)or RNA silencing refers to the small RNA-guided gene silencing mechanism
conserved in a wide range of eukaryotic organisms from plants to mammals. New developments in this field clearly
support a naturally antiviral role for RNAi in plants and animals,So RNAi is often co sidered as potent molecular
immune system. A deeper understanding of the molecular immune system is very helpful to reveal the pathogenesis of
some viral diseases and developement an effective antiviral therapy. Therefore,the progress of the molecul r immune
system is reviewed in the text.
Keywords: RNAi Molecular immune system Antivirus
2008年第3期
源 mRNA碱基互补配对允许活化的 RISC定位到靶
mRNA上,以特异性方式导致靶 mRNA切割和靶基
因沉默[3]。
1.1.2 miRNA 与 siRNAs相对照,miRNA首先在
细胞核内转录生成长的初始miRNA,然后被RNaseII
样酶 Drosha切割产生前体 miRNA(pre-miRNA)。
pre-miRNA随后由依赖 Ran的核转运受体家族成
员 Exportin5辅助运入细胞浆,pre-miRNA一旦到
达细胞浆,由胞浆 RNaseⅢ Dicer切割生成 miRNA
双链体,然后由 RNA解旋酶展开 miRNA双链体,
它的一条链通过未知核酸酶降解,而另一条链装配
入 RISC。一些 miRNA由 RISC引导切割和降解靶
mRNA,然而大多数 miRNA通过结合到靶 mRNA3′
非翻译区(3′untranslatedregion,3′UTR)抑制其翻
译[3]。
1.2 RNAi效应的扩增与传递
RNAi的许多有趣特点之一是该现象的明显催
化特性,少量的 dsRNA分子足以降解长时间连续
转录的靶 mRNA。由于编码 RNA依赖的 RNA聚合
酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)的突变
影响 RNAi,由此推测 RdRP可能是复制 siRNAs的
酶。最近许多研究,提供了令人信服的生物化学和
遗传的证据,RdRP确实在 RNAi扩大效应中起了
关键性的作用。siRNAs能作为引物将靶 mRNA转
变成 dsRNA,这些新生成的 dsRNA在 dsRNA合成
和降解循环中被降解以清除结合的靶 mRNA,同时
产生新的 siRNAs。Pak等[4]研究表明植物和秀丽隐
杆线虫中有两类不同的小 RNA参与了 RNAi:“初
级 siRNA”(产生于最初引发 RNA的 DICER核酸酶
切割产物)和“次级 siRNAs”(需要 RdRP合成的附
加小 RNA)。分析秀丽隐杆线虫中相关的功能小
RNA,发现次级 siRNA构成了绝大多数。大量次级
siRNAs显示出结构和序列预示的生物合成模式,
由此,每个分子产生于一个经 RdRP的新起始反
应。内源小 RNA的分析表明一部分产生于与次级
siRNAs相似的生物合成机制,暗示在 RNAi过程中
由 RdRP活性催化,产生于细胞 mRNA的小反义转
录本可能在细胞调控中起关键作用。这种放大效果
使得最初少量 dsRNA引起大量靶标 RNA沉默。
与高等脊椎动物中蛋白为基础的获得性免疫
相似,植物和线虫中的 RNA沉默可以散布到生物
体内的非感染细胞以阻止进一步感染。由RdRP催化
的 RNA合成由于提供了产生次级 siRNA的 dsRNA
新来源而扩大了 RNAi效应,并且也可能是 RNAi
散布到一些生物体末梢组织所必需的 [5]。有趣的
是,当用 BLAST在黑腹果蝇和人的几乎全基因组
搜索,没有鉴定到 RdRP[6]。在缺乏细胞 RdRP动物
细胞中多重循环 RISC可能介导 RNAi[7]。
此外,在 RNAi效应阶段末 mRNA被切割片段
的一部分也可能转变成 RdRP样活性的双链体,这
些双链体可能有 siRNA样功能并最终进入 siRNA
扩增反应。因此,RNAi扩增效应可能发生在 RNAi
的起始阶段和效应阶段[8]。
2 RNAi的抗病毒效应
与高等植物中 RNAi在天然抗病毒中作用的广
泛认可相对照,至到近来才有 RNAi在动物界起相
似抗病毒作用的试验证据。
近来发现,黑腹果蝇具有强大而有效的应对从
细菌到真菌,包括病毒感染的天然免疫系统[9]。已
知的黑腹果蝇免疫反应依赖于体液和细胞活性,与
发现的其它动物免疫系统相似。近来,与传统哺乳
动物免疫系统特异方式相似,RNAi或“RNA沉默”
作为果蝇应对特异性病原体、转座子和反转录病毒
成分的可能手段出现了。试验表明 RNAi是果蝇使
用的抗病毒反应来对抗双 RNA病毒果蝇 X病毒引
起的感染。另有研究[10]表明在成年黑腹果蝇抗病毒
反应中 RISC的重要催化成分内切酶 Argonaute2
(Ago-2)是必需的。Ago-2缺陷的果蝇对重要果蝇病
原果蝇 C病毒(DrosophilaCvirus,DCV)和蟋蟀麻
痹病毒(CricketParalysisvirus,CrPV)高度敏感。ago-
2突变果蝇死亡率提高伴随病毒 RNA积累和病毒
滴度急剧升高。由于发现 DCV编码了一个有效的
RNAi抑制物,该抗病毒机制的生理学意义而受到
重视。该抑制物结合长 dsRNA,并抑制 Dicer-2介导
的 dsRNA到 siRNA加工,但是不结合 siRNAs或中
断 miRNA途径。由此表明 RNAi是果蝇中的重要抗
病毒防御机制。
最近已经从人逆转录病毒的研究中得到 RNAi
在脊椎动物中控制病毒入侵的直接证据。Lecelier
等[11]发现了一种由细胞 miRNA介导的新型哺乳动
郑玉姝等:RNAi—分子免疫系统 45
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
物抗病毒免疫,他们鉴定了猴泡沫病毒 1型
(primatefoamyvirustype1,PFV-1)的 miR-32互补
位点。在感染细胞中携带损害与 miR-32部分互补
突变的 PFV-1突变株较野生型病毒积累水平更高。
在哺乳动物细胞中 RNAi途径抵御 PFV-1的作用
进一步得到试验证实——PFV-1编码 Tas蛋白抑制
miRNAs或 siRNAs介导的 RNAi[11]。
有些病毒可在感染细胞中表达病毒 miRNAs
来控制自身和宿主基因表达以优化感染。猿猴空泡
病毒(SimianVirus40,SV40)病毒编码的 miRNA有
效下调包括T抗原在内的一组基因表达[12]。SV40在
感染晚期主要表达 miRNA,并大量积累。奇怪的
是,病毒 miRNA的表达对病毒复制并没有副作用,
但降低了 CTL裂解病毒感染细胞的敏感性。为抵
制细胞的防御,HIV-1已经将 Tat蛋白进化成了一
个有 RNA沉默功能的抑制子。试验证实 Tat通过
颠覆 Dicer将前体 dsRNA加工成 siRNAs能力而消
除细胞的 RNA沉默防御功能[13]。这些试验结果提
供了 RNAi参与抗病毒感染的间接证据。
3 RNAi抗病毒应用前景
RNAi是生物体古老而保守的一种抗病毒机
制。因此,科研工作者模仿生物体内产生 siRNA设
计、合成了 siRNA,来干扰病毒感染,以达到治疗病
毒病的目的。试验结果表明这些 siRNAs介导的
RNAi可以抑制病毒的复制、减少病毒 RNA的数量
和阻断病毒蛋白的表达。这方面的研究成果在病毒
病的治疗上显示了良好的应用前景。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive
andrespiratorysyndromevirus,PRRSV)是猪的重要
传染病病原之一,给世界养猪业造成了重大经济损
失。目前商品化疫苗还不能提供有效的保护,因此
开发新的制剂成为研究热点。Huang等[14]将表达针
对 PRRSV蛋白的 shRNA转入 MARC-145细胞,通
过病毒滴度 (TCID50),间接免疫荧光试验和实时
RT-PCR检测,表明与对照细胞相比,表达质粒
pSUPER-N3或 pSUPER-G1显著降低了病毒产量。
而且,pSUPER-N3和 pSUPER-G1组合处理,病毒的
抑制效应大大增强。这表明两个不同的 shRNA联
合用药具有协同效应,靶向 PRRSV不同区域的
RNAi可能成为有效的病毒控制策略。
口蹄疫给畜牧业造成了重大地经济损失,由于
现有疫苗和抗病毒药物效力的局限性,开发新的策
略非常迫切。RNAi是抑制病毒复制的有效途径。最
近研究表明,表达针对口蹄疫病毒(foot-and-mouth
diseasevirus,FMDV)结构蛋白 1D(Ad5-NT21)或针
对聚合酶 3D(Ad5-POL)shRNA的重组复制缺陷人
腺病毒 5型(adenovirustype5,Ad5)完全保护了猪
IBRS-2细胞免于同源 FMDV感染,而只有 Ad5-
POL抑制异源 FMDV复制,而且这些 shRNAs显著
降低了豚鼠和猪对 FMDV的易感性[15]。鉴于抗原易
变性,研究者针对 FMDV2B非结构蛋白高度保守
序列设计 shRNA,结果发现,在猪细胞上表达 2B
shRNA能至少有效沉默 4个 FMDV血清型。病毒
感染后,与对照细胞相比,在这些细胞上病毒 RNA
和蛋白合成显著下降,并且病毒产量也下降[16]。
乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)
和西尼罗河病毒(WestNilevirus,WNV)是引起高
致死率急性脑炎的嗜神经型虫媒病毒。选择 JEV
或WNV毒株间保守序列而制备的shRNA或siRNA,
能对相应毒株产生特异性保护;选择种间保守序
列,能保护小鼠免受两种病毒引起的脑炎。在病毒
攻击前或病毒攻击后用 siRNA治疗,一次颅内使用
慢病毒呈递的 shRNA或脂质体复合物 siRNA足以
保护致死性脑炎[17]。这表明 siRNA能用作广谱抗病
毒药治疗多种相关的病毒引起的脑炎。
随着人们对这一古老而保守的免疫系统的深
入理解,计算机和生物信息学辅助设计防止病毒逃
逸方法的发展及向靶细胞呈递核酸系统的不断改
进,这种进化精巧的病毒防御机制不仅有助于深入
理解宿主和病原的相互作用及探索病毒复制机制
的工具革新,而且也可能产生新的治疗方法。
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电泳(2D-CE),液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等新
型分离技术都是目前发展的主要方向。另一种策略
是以质谱技术为核心,直接鉴定全蛋白质组混合酶
解产物[26]。随着对大规模蛋白质组相互作用研究的
重视,发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测
技术也受到科学家的关注。此外,蛋白质芯片的发
展也十分迅速,并已经在临床诊断中得到应用[27]。
蛋白质组学的建立开辟了功能基因组学研究
的新领域,为研究蛋白质水平的生命活动展现了更
为崭新的思路和广阔的前景。可以说其发展受技术
限制,但同时也是受技术推动的。
随着生命科学及生物技术的迅速发展,生物质
谱不仅成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿
研究领域之一,更成为多肽和蛋白质分析最有威力
的工具之一[28]。串联质谱是肽序列分析的最先进方
法,但还存在一个问题,即分析串联质谱数据所代
表的序列是一项费时费力的工作,这就对序列分析
算法和软件等生物信息学交叉学科研究模式提出
了严峻要求。在发展新技术的同时,还应该重视现
有蛋白质组学研究技术的整合和互补,多种技术的
联合应用可以全面、系统、综合地分析蛋白质的特
征功能,强有力地推动人类基因组计划及其后基因
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