全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-03-12
基金项目:国家自然科学基金项目“汉坦病毒胞膜糖蛋白受体或受体辅助分子的分离鉴定研究”资助(30400377)
作者简介:李青岭(1974-),女,硕士,研究方向:分子病毒学
通讯作者:黄爱龙,Tel:23-68485230,E-mail:ahuang1964@yahoo.com.cn
一般来说,病毒通过细胞膜上特异性受体入侵细胞是病毒感染细胞的起始环节[1]。到目前为止,人们对
汉坦病毒(Hantavirus,HV)宿主细胞膜上的受体已经进行了多方面的研究,其中研究最多、证据最为充分的
是细胞粘附蛋白 β3整合素,然而无论用 β3整合素的配体或抗体都无法完全阻断汉坦病毒对宿主细胞的
一个约30kD膜蛋白作为汉坦病毒候选受体的筛选
李青岭 1,2 冯涛 2 郭进军 1,3 黄爱龙 1
(1重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400016;2重庆医科大学基础医学院
生物化学与分子生物学教研室,重庆 400016;3重庆医科大学附属第二医院消化内科,重庆 400016)
摘 要: 目的:筛选汉坦病毒包膜糖蛋白G2可能的候选受体或受体辅助分子,方法:根据汉坦病毒 76~118株M
基因序列设计引物,PCR扩增和基因重组获得 G2全长及各功能片段的 GST融合表达质粒,SDS-PAGE检测它们在
BL21菌中诱导表达及纯化的效果。生物素标记汉坦病毒易感细胞 VeroE6和非允许细胞 CHO的细胞膜蛋白。将在
BL21裂解上清中有表达的G2蛋白N端 81~140位氨基酸片段(G2N81-140)纯化后与含有生物素标记的 VeroE6细胞
膜裂解液进行孵育,同时以非允许细胞CHO和无关蛋白GST-TLM做为阴性对照,通过GSTPul-down分离与G2蛋白
特异性结合的细胞膜蛋白。结果:一个约30kD的VeroE6细胞膜蛋白与G2N81~140片段之间存在着特异性的相互作
用。结论:该30kD蛋白可能是汉坦病毒细胞膜候选受体或受体辅助分子之一,是病毒入侵细胞的一个相关分子。
关键词: 汉坦病毒受体 包膜糖蛋白G2 GST Pul-down 生物素膜标记
A30kDSurfaceProteinwasScreenedasaCandidate
ReceptorofHantavirus76~118Strain
LiQingling1,2 FengTao2 GuoJinjun1,3 HuangAilong1
(1KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,MinistryofEducation,InstituteforViralHepatitis,theSecond
AfiliatedHospital;ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology
andBasicMedicalSciencesResearchInstitute,Chongqing400016;3DepartmentofGastroenterologyandHepatology,the
SecondAfiliatedHospital,Chongqing400016)
Abstract: Aim:Toscreenotherputativereceptorslocatedoncelsurfacetowhichhantavirusbinds.Method:GST-
tagged fusion protein expresion vectorsencodingtheenvelopeG2 fragmentsofHantavirus76~118 strain were
constructedbyPCR andgenerecombinationtechnology.TheG2fragmentswereexpresedrespectivelyinE.coliBL21
celsandtheproductswereanalyzedbySDS-PAGE.TheGST fusedN-terminal81-140aminoacidofG2protein
(G2N81-140)wasfoundexpresinginsupernatantofBL21cellysisandpurifiedbyGlutathioneSepharoseTM4B.Cel
surfaceproteinsofHantavirus-susceptibleVeroE6andnon-permisiveCHO celswerelabeledbybiotin.Thesupernatant
ofbiotin-labeledcellysiswereincubatedwithpurifiedG2N81-140protein.Thecelsurfaceproteinsbindingspecificaly
toG2N81-140werescreenedbyGSTpuldowntechnique.Non-permisiveCHO celsandunrelatedproteinGST-TLM
wereusedascontrols.Result:A30kDmembraneproteinofVeroE6celwasfoundbindingspecificalytoG2N81-140
fragment.Conclusion:The30kDsurfaceproteinmaybeaputativereceptorforHantavirus76~118strain.
Keywords: Hantavirusreceptor EnvelopeG2protein GSTPul-down Membranebiotin-labeling
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
感染[2~5];另外的一些研究亦分离到了其它可能作为 HV的候选受体或辅助受体分子[5,6],但均无进一步的
实验研究来证实。由此推测,汉坦病毒的细胞膜受体除了 β3整合素外可能还存在有其他受体或受体辅助
分子。将 HV76~118株包膜糖蛋白 G2的各功能片段进行了原核表达,对 HV易感细胞膜进行生物素标记,
以 G2的功能片段作为探针通过 GSTPuldown技术分离可以与其结合的细胞膜蛋白,获取汉坦病毒 76~
118株的候选受体或辅助受体蛋白分子。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒 M56(pBR322)含有 HV76~118株全长 M基因,由第四军医大学微生物教研室转赠。原核表达载
体 GST-Moluc由美国芝加哥大学 TC-He教授馈赠。无关蛋白 GST-TLM融合表达载体由本研究室构建。菌
株 Top10及 BL21由本室保存。VeroE6细胞、CHO细胞由本室提供。GlutathioneSepharoseTM4B购自
AmershamBiosciences公司。生物素标记试剂(EZ-LinkSulfo-NHS-Biotin)、HRP标记的链酶亲和素(ImmunoP
ureStreptavidin,HorseradishPeroxidaseConjugated)及封闭液 (SuperBlockBlockingBufers)均购自 Pierce公
司。标准蛋白分子 Marker(PageRulerTMPrestainedProteinLadder)购自 Fermentas公司。蛋白酶抑制剂购自
Roche公司。各种工具酶均购自 TakaRa公司。质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒购自 Promega公司。GST-
TLM表达质粒由本研究室构建,作为无关对照。
1.2 方法
1.2.1 HVG2蛋白不同结构域 DNA片段的制备 参考 Genebank汉坦病毒标准株 (76~118株)M蛋白的
氨基酸和核苷酸序列,在对 G2蛋白进行跨膜区、疏水性以及二级结构等分析的基础上,设计了一系列用于
扩增 G2膜外区功能片段的引物。G2FOR5′TCAGAGACACCATTAACTCCTGTC3′,G2REV5′CCCTGAAATCC
ATTCCCCTG3′,用扩增 G2膜外区全长 452个氨基酸;G2-N234FOR5′TCAGAGACACCATTAACTCCTGTC3′,
G2-N234REV5′ACCTTTGTCTCTTGGACTCATG3′,用于扩增 G2蛋白 N端 234个氨基酸;G2-N116FOR5′
TCAGAGACACCATTAACTCCTGTC3′,G2-N116REV5′ACCCCAGCTCGTCTCATATTG3′,用于扩增 G2蛋白 N
端 116个氨基酸;G2-N81-234FOR5′GTTGGTAGTGCTTATAAAATTATC3′,G2-N81-234REV5′ACCTTTGTCTCT
TGGACTCATG3′,用于扩增 G2蛋白 N端 81~234位氨基酸片段;G2-N81-140FOR5′CTTAAAACATCCTTTCAC
TG3′,G2-N81-140REV5′TTTCAGTTGATCTAGGTATAAAC3′,用于扩增 G2蛋白 N端 81~140位氨基酸片段。
上述所有正向引物均添加 BamHI酶切位点,反向引物均添加 HindII酶切位点。以质粒 M56为模板,用
PCR扩增各片段,得到 HVG2蛋白不同结构域的 DNA片段。
1.2.2 GST融合表达载体的构建 原核表达载体 GST-Moluc在原核细胞中由适当浓度的诱导剂 IPTG诱
导表达 GST蛋白及其融合蛋白,且可以通过 GlutathioneSepharose纯化蛋白,因此可用来融合表达 HV包膜
糖蛋白 G2的功能片段。将载体用 BamHI和 HindII双酶切,纯化后与酶切处理后的上述 PCR产物连接。
连接产物转化感受态 Top10细菌,提取质粒酶切鉴定,得到 G2蛋白 5个功能片段的融合表达质粒。
1.2.3 GST融合蛋白的诱导表达与纯化 将 GST-G2功能片段融合表达质粒与无关蛋白 GST-TLM融合表
达质粒分别转化入表达菌 BL21中进行小量诱导表达,以 SDS-PAGE鉴定表达效果。挑选在上清中有所表
达的重组蛋白表达质粒进行大量诱导表达。将过夜培养的含重组质粒的表达菌以 1:100比例在 LA培养基
中扩增,当表达菌生长到 OD值约 0.4时,加入 IPTG使其终浓度达到 50μmol/L,20℃诱导约 6h。同时将含
空载体 GST-Moluc和作为无关对照载体 GST-TLM的表达菌以同样方法扩增,OD值约 0.4时加入 IPTG使
其终浓度达到 1mmol/L,37℃诱导约 4h。诱导完成后,4℃10000r/min离心 15min。每 200ml菌液离心所得细
菌沉淀用 10mlPBS加 0.1%TritonX-100重悬(含有终浓度为 1mmol/LPMSF及蛋白酶抑制剂),冰浴中超声
裂解,裂解物在 4℃,10000r/min离心 20min,收取上清。上清中诱导产物用 GlutathioneSepharose亲和纯化,
纯化产物进行 SDS-PAGE确定其纯度,-80℃保存。
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2008年第4期
1.2.4 生物素标记并获取细胞膜蛋白 胰酶-EDTA消化生长状态良好的 HV易感细胞 VeroE6和作为对
照的 CHO非允许细胞,800r/min离心 5min。冰冷的 PBS洗涤细胞沉淀 3次移去培养基中含铵基的培养介
质和蛋白。每 25×106细胞用 1ml预冷的 PBS重悬,每 1ml细胞重悬液中添加 1.0mg生物素,使其终浓度达
到 2mmol/L。在室温下孵育混合物 30min,离心弃生物素溶液。用预冷含 100mmol/L甘氨酸的 PBS洗涤细胞
3次以移去过量的生物素和死细胞。将生物素标记的每 25×106细胞用 1.5ml细胞裂解液 RIPA(含有终浓度
为 1mmol/LPMSF及蛋白酶抑制剂)裂解,4℃摇床上孵育 30min。4℃14000r/min离心 10min,收集细胞裂解
上清,BCA法测定上清蛋白浓度,-80℃保存。
1.2.5 Pul-down分离与 GST-G2功能片段相互作用的细胞膜蛋白 冰上缓慢融解纯化后的 GST-G2蛋白、
GST蛋白和无关对照 GST-TLM蛋白及含生物素标记细胞膜蛋白的 VeroE6和 CHO细胞裂解上清。取总蛋
白约 4mg的细胞裂解上清分别加入纯化后的 GST蛋白 160μg,4℃摇床孵育 4h。加入预先用 RIPA平衡的
GlutathioneSepharose80μl,4℃轻摇孵育 4h,10000r/min冷冻离心 30s,静置 2min,收集上清。然后分别加入
GST-G2蛋白和无关对照 GST-TLM蛋白各 160μg于预处理后的 VeroE6细胞上清中,同时在对照细胞 CHO
上清中加入 160μgGST-G2蛋白,4℃轻摇孵育 4h。加入预先用 RIPA平衡的 GlutathioneSepharose80μl,4℃
轻摇孵育过夜,使其与蛋白充分结合。10000r/min冷冻离心 30s,静置 2min,收集 Sepharose。加入洗涤液并
轻柔颠倒 EP管,充分洗涤 Sepharose,10000r/min冷冻离心 30s,静置 2min,小心吸尽上清。每次洗涤 5min,
重复 6次。加入上样缓冲液,煮沸 5min后电泳。
1.2.6 生物素-链亲和素系统鉴定与 G2蛋白相互作用的细胞膜蛋白 电转仪转膜后,SuperBlockBlocking
Bufer10ml室温摇床封闭 10min。弃封闭液,0.05%TBST洗膜 3次,每次 5min。用 SuperBlockBlockingBufer
以 1:20000比例稀释 HRP标记的链酶亲和素,室温下与膜孵育 2h,洗膜同前。加入 ECL化学发光试剂,在
暗室里胶片曝光 1min进行显影。比较 GST-G2与 VeroE6相互作用的泳道中与其它对照泳道特异的蛋白
条带,从而鉴定 HV可能的候选或协同受体蛋白分子。
2 结果
2.1 HVG2蛋白功能片段 GST融合表达载体的构建
以质粒 M56为模板,用 PCR扩增 HVG2蛋白不同功能结构域的 DNA片段,PCR产物大小分别为
1356bp、702bp、348bp、459bp和 180bp,电泳位置与预期一致(图略)。将 PCR产物酶切后克隆入 GST-Moluc
原核表达载体,重组融合表达质粒用 BamHI和 HindII进行双酶切,分别产生 1352bp、702bp、348bp、459bp
和 180bp的 DNA片段,酶切后电泳结果与预期相符(图略)。
2.2 GST融合表达质粒在原核细胞中的诱导表达及
纯化
将融合表达质粒分别转化入表达菌 BL21中进行
小量诱导表达,表达产物超声裂解后进行 SDS-PAGE
检测,结果显示仅 GST-G2N端 81~140位氨基酸片段
(GST-G2N81-140)在上清中有表达(图 1),其余片段表
达产物均出现在包涵体中(结果未显示)。通常认为在
裂解上清中表达的可溶性蛋白有较强的生物学活性,
而以包涵体形式存在的蛋白缺乏生物学活性或活性较
低,复性后其功能域也不一定能完全恢复,活性蛋白产
量也非常少。进行 Pul-down的两个相关蛋白必须具备
生物学功能,因此挑选在上清中表达量高的 GST-
G2N81-140的单克隆菌及含对照质粒 GST和 GST-TLM
图 1 汉坦病毒 G2蛋白 N端 81~140位氨基酸片段
在 BL21中的诱导表
图中所示为表达菌全细胞裂解液的 SDS-PAGE电泳结果。1
为 ProteinMarker,2为未诱导的 GST表达菌,3为 IPTG诱导
的 GST表达菌,在 26kD位置处可见 GST表达条带,4为未诱
导的 GST-N81~140表达菌,5和 6为 IPTG诱导的 GST-N81-
140表达菌,在约 33kD位置处可见特异的表达条带
李青岭等:一个约30kD膜蛋白作为汉坦病毒候选受体的筛选 127
生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第4期
的单克隆菌进行大量诱导表达并用 Glutathione Sepharose进行亲和层析纯化。GST-G2N81~140融合蛋白和
GST-TLM融合蛋白的诱导表达及纯化结果见图 2A和图 2B,GST的诱导表达及纯化结果未显示。
图 2-A汉坦病毒 G2蛋白 N端 81~140位
氨基酸片段的纯化
图中所示为 GST-G2N81~140表达菌不同裂解成分以及纯化后
蛋白的 SDS-PAGE电泳结果。1为 Protein Marker,2为未诱导的
GST-G2N81~140表 达 菌 全 细 胞 裂 解 液 ,3为 诱 导 的 GST-
G2N81~140表达菌全细胞裂解液,4为诱导的 GST-G2N81~140
表达菌细胞裂解上清成分,可见在上清中有 GST-G2N81~140的
表达,5为 IPTG诱导的 GST-G2N81~140表达菌包涵体成分,6
为 IPTG诱导的 GST-G2N81~140表达菌细胞裂解上清经过
Glutathione Sepharose 4B亲和层析获得的 GST-G2N81~140片段
图 2-B对照融合蛋白 GST-TLM的诱导
表达以及纯化
图中所示为 GST-TLM表达菌不同裂解成分以及亲和层析
纯化后的 SDS-PAGE电泳结果。1为 Protein Marker,2为未
诱导的 GST-TLM表达菌全细胞裂解液,3为 IPTG诱导的
GST-TLM表达菌全细胞裂解液,在约 28kD处可见特异表
达条带,4为 IPTG诱导的 GST-TLM表达菌细胞裂解上清
成分,5为 IPTG诱导的 GST-TLM表达菌包涵体成分,6为
IPTG诱 导 的 GST-TLM表 达 菌 细 胞 裂 解 上 清 经 过 Glu-
tathione Sepharose 4B亲和层析获得的 GST-TLM蛋白
2.3 GST Pull-down技术分离与 G2N81~140片段相互作用的细胞膜蛋白
GST蛋白预处理已用生物素标记了的 VERO E6细胞膜裂解液和做为阴性对照的非允许细胞 CHO裂
解液。纯化后的融合蛋白 GST-G2N81~140为诱
饵,同时以无关蛋白 GST-TLM做为阴性对照,运
用 Pull-down技术分离与其相互作用的细胞膜蛋
白。将分离到的细胞膜蛋白进行 SDS-PAGE后,
用生物素-链亲和素系统显示。可见在 GST-
G2N81~140与 VeroE6细胞膜蛋白相互作用的泳
道中在大约 30kD蛋白位置出现特异条带,该条
带在 GST-TLM与 Vero E6相互作用泳道中和
GST-G2N81~140与 CHO相互作用泳道中均未出
现。由此可知,该蛋白与 G2N81~140蛋白之间存
在有特异性相互作用,该 30kD大小的 VeroE6细
胞膜蛋白可能是 HV的候选受体或辅助受体分
子,结果见图 3。
3 讨论
目前关于汉坦病毒细胞膜受体的研究已有很多,已经发现数个可能具有受体功能的细胞膜成分,报道
最多、证据较为充分的是细胞膜粘附蛋白 β3整合素。阻断 β3整合素可以有效抑制病毒的入侵,转染 β3
整合素则可以辅助或增强病毒的感染,但 β3整合素的配体及抗体都不能完全阻断病毒感染其宿主细胞[2~5],
这些均表明 HV还存在有其它的候选受体或辅助受体。近来 Dan Lei Mou等[5]证明 HTNA9株可以感染转
染有 αvβ3、αⅡbβ3和 β3的 CHO细胞时,发现除 β3整合素外该病毒还与一个约 70kD蛋白有着直接的相
互作用,该蛋白可能是 HV入侵宿主细胞的辅助受体。Tae-Yeon Kim等[6]通过病毒铺敷蛋白结合实验和竞
图 3 GST Pull-down分离与 G2N81-140片段
相互作用的 Vero E6细胞膜蛋白
图中所示为 GST Pull-down所获洗脱液的 Western Blot结果。1为
GST-TLM蛋白与 Vero E6细胞膜蛋白孵育后的 GST Pull-down洗脱
液,2为 G2N81~140片段与 CHO细胞膜蛋白孵育后的 GST Pull-
down洗脱液,3为 G2N81~140片段与 Vero E6细胞膜蛋白孵育后的
GST Pull-down洗脱液,可见在约 30kD处有一特异条带出现
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(上接第124页)
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将 NAS基因导入黑麦草,发现转基因植株对干旱和盐胁迫的抗性均显著增强。本实验室也已经将该 NAS
基因导入到匍匐翦股颖,获得了转化植株,并从开展的抗旱性鉴定工作结果看来,转基因植株与对照株并
没有显著性差异,但是转基因植株的抗旱性生理指标数普遍高与对照株,因此说明 NAS基因对于改善植
株的抗旱能力有一定的改善作用。
参考 文献
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13 徐炳成,山仑,黄占斌.中国草地,2001,23(2):55~61.
争性抑制实验发现一个约 30kD蛋白可能是 HV的又一候选受体。
GSTpul-down技术是在体外检测蛋白之间相互作用的方法之一,生物素-链亲和素系统又为标记和检
测细胞膜蛋白提供了有效的手段。因此,结合这 2种技术可以鉴定与 HV有着直接相互作用的宿主细胞膜
蛋白。汉坦病毒的包膜蛋白为糖蛋白,由 M基因编码、转录并翻译成一个蛋白前体,经过细胞器的转运和
进一步修饰切割后最终以 G1和 G2两个蛋白组分的形式存在,两者均有可能作为病毒入侵细胞的靶蛋白
与宿主细胞膜上的相应受体结合。对 G2蛋白的膜外区完整片段进行了原核表达,结果表明此膜蛋白基本
以包涵体形式存在,上清中含量极少,其原因有待进一步探讨。对该片段进行了不同的截短表达,结果显示
只有 N端 81~140位氨基酸片段在上清中表达量较高。将此片段的融合蛋白作为诱饵,与生物素标记的细
胞膜蛋白进行 GSTpul-down研究,并与对照组相比较,结果表明一个约 30kD的膜蛋白可以特异性与 G2
N端 81~140位氨基酸相结合。该蛋白分子量与 Tae-YeonKim等的研究结果相近,两者是否是同一种蛋白,
还需从氨基酸的序列、结构及功能上加以证实。为 HV可能通过多种途径、多个受体或受体辅助分子入侵
其宿主细胞进一步提供了证据。鉴于病毒包膜糖蛋白在原核细胞中的结构和功能与生理环境下可能存在
差别,GSTpul-down技术本身也存在不足,该蛋白作为病毒的候选受体还需要更直接的证据,并且对该蛋
白的结构性质及功能都需要进一步探讨。
参考 文献
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