全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-12
基金项目:本研究由国家自然科学基金项目“汉坦病毒胞膜糖蛋白受体或受体辅助分子的分离鉴定研究”资助(30400377)
作者简介:郭进军(1972-),博士,副主任医师,研究方向:分子病毒学
通讯作者:黄爱龙,Tel:23-68485230,E-mail:ahuang1964@yahoo.com.cn
一般认为,病毒与易感细胞表面受体结合是其感染细胞的首要环节[1]。目前对汉坦病毒(Hantavirus,
HV)细胞表面受体的研究显示,转染 β3整合素有助于病毒感染其宿主细胞,阻断 β3整合素则可以抑制或
减少病毒的入侵,表明 β3整合素可能是汉坦病毒的受体[2~5]。然而目前还没有直接的实验证据表明 HV胞
体外鉴定汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的相互作用
郭进军 1,2 李青岭 2,3 周倩云 2 曾爱忠 2 黄爱龙 2
(1重庆医科大学附属第二医院消化内科,重庆 400016;2重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部
重点实验室,重庆 400016;3重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,重庆 400016)
摘 要: 根据汉坦病毒76-118株M基因和 β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒 M56和Hela细胞 cDNA
为模板通过 PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81~140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23~133
片段 FLAG融合表达质粒。通过 SDS-PAGE检测 G2片段在 BL21表达菌中诱导表达及纯化的效果,Westernblot检测
β3整合素片段在真核细胞中的表达。将在BL21裂解上清中表达的G2蛋白N端81~140位氨基酸片段(G2N81~140)纯
化后与经过GST蛋白预处理的含有β3整合素片段的细胞裂解上清进行孵育,同时以未做任何转染的HEK293细胞裂
解上清和无关蛋白GST-TLM作为阴性对照,通过GSTPul-down验证G2蛋白与 β3整合素之间的相互作用。结果显
示在Pul-down所获蛋白复合物中检测到β3整合素27~133位氨基酸片段产物的存在。结果表明G2蛋白与β3整合素
之间可能存在有直接的相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒细胞膜受体提供了进一步证据。
关键词: 汉坦病毒受体 包膜糖蛋白G2 β3整合素 GSTPul-down
HantavirusG2Interactingwithβ3Intergrininvitro
GuoJinjun1,2 LiQingling2,3 ZhouQianyun2 ZengAizhong2 HuangAilong2
(1DepartmentofGastroenterologyandHepatology,theSecondAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,
Chongqing400016;2KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,MinistryofEducation,InstituteforViral
Hepatitis,theSecondAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016;3DepartmentofBiochemistry
andMolecularBiologyandBasicMedicalSciencesResearchInstitute,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016)
Abstract: GST-taggedfusionproteinexpresionvectorencodingtheenvelopeG281~140fragmentofHantavirus
76-118strainandFlag-taggedβ3intergrin23~133fragmentexpresionvectorwereconstructedbyPCR andgene
recombinationtechnologywiththetemplatesofplasmidM56andcDNA from Helacels.TheG2fragmentwas
expresedinE.coliBL21celsandtheproductwereanalyzedbySDS-PAGE.TransientexpresionofFlag-β3intergrin
expresionvectorinHEK293celswasdetectedbyWesternblot.TheGST fusedN-terminal81~140aminoacid
fragmentofG2protein(G2N81~140)wasfoundexpresinginthesupernatantofBL21cellysisandpurifiedby
GlutathioneSepharoseTM4B.Thesupernatantofcellysiscontainingβ3intergrin23~133fragmentwaspre-clearedby
GSTproteinandincubatedwiththepurifiedG2N81~140protein.TheinteractionofhantavirusenvelopeG2protein
withβ3intergrinwasidentifiedbyGSTpul-down.Non-transfectedHEK293cellysissupernatantandunrelatedprotein
GST-TLM wereusedascontrols.Theβ3intergrin23~133fragmentwasfoundinthepul-downcomplex.Theresult
showsthathantavirusG2mayinteractwithβ3intergrininvitro.
Keywords: HantavirusEnvelopeG2protein β3intergrin GSTpul-down
2008年第5期
膜蛋白与 β3整合素之间有直接的相互作用。已有的研究将 HV包膜糖蛋白 G2N端 81~140与 β3整合素
27~133位氨基酸片段共转染后进行免疫共沉淀,结果显示两者在细胞内有直接的相互作用(研究结果另
文发表)。将原核表达纯化的 G2N端 81~140位片段与转染有 β3整合素 27~133位片段的细胞裂解液孵
育,通过 GSTPul-down技术进一步验证两者在体外是否亦存在直接的相互作用,为 β3整合素作为 HV受
体提供进一步的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒 M56(pBR322)含有 HV76-118株全长 M基因,由第四军医大学微生物教研室转赠。原核表达载
体 GST-Moluc由美国芝加哥大学 TC-He教授馈赠。无关蛋白 GST-TLM融合表达载体由本研究室构建。菌
株 Top10及 BL21由本室保存。HEK293细胞、HeLa细胞由本室提供。GlutathioneSepharoseTM4B购自
AmershamBiosciences公司。标准蛋白分子 Marker(PageRulerTMPrestainedProteinLadder)购自 Fermentas公司。
蛋白酶抑制剂购自 Roche公司。工具酶均购自 TakaRa公司。质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒购自
Promega公司。脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000购自 Invitrogen公司。鼠 Anti-FlagM2抗体购自美国
Sigma公司。HRP标记的山羊抗鼠 IgG购自北京中杉金桥公司。MEM培养基和胎牛血清均购自美国 Gibco
公司。RT-PCR反应体系所用试剂购自 Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 G2蛋白原核表达质粒的构建及鉴定 原核表达载体 GST-Moluc在表达菌中由适当浓度的诱导剂
IPTG诱导表达 GST蛋白及其融合蛋白,且可以通过 GlutathioneSepharose纯化蛋白,因此可用来融合表达
HV包膜糖蛋白 G2的功能片段。参考 Genebank汉坦病毒标准株 (76-118株)M蛋白的氨基酸和核苷酸序
列,在对 G2蛋白进行跨膜区、疏水性以及二级结构等分析的基础上,设计用于扩增 G2膜外区 81~140功
能片段的引物:正向引物 5CTTAAAACATCCTTTCACTG3,反向引物 5TTTCAGTTGATCTAGGTATAAAC3。正
向引物添加 BamHI酶切位点,反向引物添加 HindII酶切位点及终止密码子 TAA。以质粒 M56为模板,
PCR扩增后 BamHI和 HindII酶切并回收目的片断,克隆至 GST-Moluc中,得到含包膜糖蛋白 G2膜外区
81~140位氨基酸片段的融合表达质粒(GST-G2N81-140)。
1.2.2 β3整合素真核表达质粒的构建及鉴定 根据文献报道,HeLa细胞含有 β3整合素蛋白表达。在对
β3整合素蛋白进行跨膜区、疏水性以及二级结构等分析的基础上,设计了扩增 β3整合素膜外区 27~133
位氨基酸片段的引物:正向引物5GGGCCCAACATCTGTACCAC3,反向引物5GATGTCCACAGGGTAATCCTC
CAC3。正向引物添加 HindII酶切位点,反向引物添加 EcoRI酶切位点及终止密码子 TAA。提取 HeLa细
胞总 RNA,逆转录为 cDNA。以该 cDNA为模板,PCR扩增后 HindII和 EcoRI酶切并回收目的片段,克隆
至 pFlag-CMV2中,获得 β3整合素膜外区 27~133位氨基酸片段的融合表达质粒(Flag-β3integrin-27~133)。
1.2.3 GST融合蛋白的诱导表达与纯化 将 GST-G2N81-140融合表达质粒转化入表达菌 BL21中进行小
量诱导表达,以 SDS-PAGE鉴定表达效果,挑选在上清中有表达的重组表达质粒进行大量诱导。将过夜培
养的含重组质粒的表达菌以 1:100比例在 LA培养基中扩增,当表达菌生长到 OD值约 0.4时,加入 IPTG
使其终浓度达到 50μmol/L,20℃诱导约 6h。同时将含空载体 GST-Moluc和无关对照载体 GST-TLM的表达
菌以同样方法扩增,OD值约 0.4时加入 IPTG使其终浓度达到 1mmol/L,37℃诱导约 4h。诱导完成后,4℃,
10000r/min转离心 15min。每 200ml菌液离心所得细菌沉淀用 10ml含 0.1%TritonX-100的 PBS重悬(含有
终浓度为 1mmol/LPMSF及蛋白酶抑制剂),冰浴中超声裂解,裂解物在 4℃10000r/min转离心 20min,收取
上清。上清中诱导产物用 GlutathioneSepharose亲和纯化,纯化产物进行 SDS-PAGE确定其纯度,-80℃保存。
1.2.4 β3整合素重组表达质粒在 HEK293细胞中的表达 采用脂质体 LipofectamineTM2000将 β3整合素
重组表达质粒 Flag-β3integrin-27~133转染于 HEK293细胞中,并以空载体 pFlag-CMV2作为对照。HEK293
郭进军等:体外鉴定汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的相互作用 137
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
细胞用含 10%胎牛血清的 MEM培养基在 37℃,5%CO2孵箱中培养。具体方法:将 HEK293细胞接种至 6
孔板中,约 24h后细胞融合至 90%。然后将质粒和脂质体分别以一定比例稀释于无血清无抗生素的 MEM
培养基中室温孵育 5min后,将两者混匀并继续孵育 20min。将混合液分别加入待转染细胞孔中,6h后弃去
转染液,换以含血清含抗生素的新鲜培养基继续进行细胞培养。48h后,弃去培养基,冰冷的 PBS洗涤细胞
2次,每孔加入 100μlRIPA细胞裂解液(含有终浓度为 1mmolPMSF及蛋白酶抑制剂),冰上裂解 5min。将细
胞裂解液移入 1.5mlEP管中,4℃,14000r/min离心 5min,分别收集上清和沉淀,加入上样缓冲液,煮沸
5min后进行 SDS-PAGE。电转仪转膜后,5%脱脂奶粉封闭 1h,分别加入 1:1000稀释的鼠抗 FLAGM2单克
隆抗体,室温孵育 2h后,0.05%TBST洗膜 3次,5min/次,加入 1:50000稀释的羊抗鼠 IgG,室温下孵育 1h,
洗膜同前,加入 ECL化学发光试剂,在暗室里胶片曝光 1min进行显影。
1.2.5 GSTPul-downassay验证 G2蛋白和 β3整合素相互作用 冰上缓慢融解纯化后的 GST-G2N81-140
蛋白,GST蛋白,无关对照 GST-TLM蛋白,未做任何转染的 HEK293细胞裂解上清及转染有 Flag-β3
integrin-27~133片段的细胞裂解上清。取总蛋白约 4mg的细胞裂解上清分别加入纯化的 GST蛋白 160μg,
4℃摇床孵育 4h,加入预先用 RIPA平衡的 GlutathioneSepharose80μl,4℃轻摇孵育 4h,10000r/min冷冻离
心 30s,静置 2min,收集上清。分别加入 GST-G2N81-140蛋白和无关对照 GST-TLM蛋白各 160μg于预处理
后的细胞裂解上清中,4℃轻摇孵育 4h。加入 RIPA平衡的 GlutathioneSepharose80μl,4℃轻摇孵育过夜,使
其与蛋白充分结合。10000r/min冷冻离心 30s,静置 2min,收集 Sepharose。加入洗涤液并轻柔颠倒 EP管,充
分洗涤 Sepharose,10000r/min冷冻离心 30s,静置 2h,小心吸尽上清。每次洗涤 5min,重复 6次。加入上样
缓冲液,煮沸 5min后进行 SDS-PAGE。电转仪转膜后,用 Anti-FLAG抗体检测沉淀复合物中 β3整合素膜外
区 27~133片段融合蛋白的存在,从而检测 G2蛋白和 β3整合素功能片段之间的相互作用。
2 结果
2.1 GST-G2N81-140与 Flag-β3integrin-27~133融合表达载体的构建
如方法中所述,PCR扩增 HVG281-140与 β3整合素膜外区 27~133位功能结构域的 DNA片段,双酶
切纯化后进行连接与转化,重组融合表达质粒进行双酶切鉴定,酶切后电泳结果与预期相符(图略)。
2.2 GST-G2N81-140片段在原核细胞中的表达与纯化
将 GST-G2N81-140融合表达质粒转化表达菌 BL21中,经过适当温度和适当浓度 IPTG诱导,表达产物
冰浴中超声裂解后进行 SDS-PAGE检测表达效果。结果显示 GST-G2N81-140在上清中有表达,通常认为在
裂解上清中表达的可溶性蛋白有较强的生物学活性,
因此挑选在上清中表达量较高的 GST-G2N81-140的
单克隆菌及含对照质粒 GST和 GST-TLM的单克隆菌
进行大量诱导表达,表达产物用 GlutathioneSepharose
进行亲和层析纯化。GST和 GST-TLM表达纯化结果
未显示,GST-G2N81-140融合蛋白诱导表达及纯化结
果见图 1。
2.3 β3整合素膜外区 27~133片段在真核细胞中的
表达
将 β3整合素膜外区 27~133片段的重组表达质
粒转染 HEK293细胞,并以空载体 pFlag-CMV2作为
对照。转染 48h后收集细胞,用 RIPA细胞裂解液裂解
细胞后收集上清进行 SDS-PAGE。电转仪转膜后通过
Westernbloting验证了其表达。结果显示 β3整合素膜
图 1 汉坦病毒 G2膜蛋白 N端 81~140位
氨基酸片段的表达纯化
图中所示为 GST-N81-140表达菌不同裂解成分以及纯化后
的 SDS-PAGE电泳结果,1为 ProteinMarker,2为未诱导的
GST-N81-140表达菌全细胞裂解液,3为 IPTG诱导的 GST-
N81-140表达菌全细胞裂解液,4为 IPTG诱导的 GST-N81-
140表达菌细胞裂解上清成分,可见在上清中有 GST-N81-
140的表达,5为 IPTG诱导的 GST-N81-140表达菌包涵体成
分,6为 IPTG诱导的 GST-N81-140表达菌细胞裂解上清经过
GlutathioneSepharose4B亲和层析获得的 GST-N81-140片段
138
2008年第5期
外区 27~133片段的表达产物在相应位置出现条带(图 2)。
2.4 GST Pul-down体外验证 G2N81-140与 β3整合素
27~133片段的相互作用
将纯化的 GST-G2N81-140片段与经过 GST蛋白预处理
的转染有 β3整合素 27~133片段的细胞裂解液孵育。同时
以经过同样处理未经转染的细胞裂解液和无关对照蛋白
GST-TLM作为阴性对照,通过 Pul-down验证两者之间的相
互作用。结果显示 GST-G2N81-140蛋白与 β3整合素 27~133
细胞裂解液孵育并进行 Pul-down后,蛋白复合物中可检测
到 β3整合素 27~133片段存在,提示 G2蛋白与 β3整合素
之间可能存在有直接的相互作用(图 3)。
3 讨论
整合素家族是细胞表面受体重要成员之一,该家族粘附
分子是由 α和 β亚单位通过非共价键连结形成的异源二聚
体。其中 β3整合素主要存在于内皮细胞和血小板上,大部
分位于细胞外,为配体结合部位,胞质区较短,是结合细胞骨
架成分的部位[6]。研究表明整合素可作为一些病毒的受体或
辅助受体,在病毒的吸附和入侵细胞过程中起着重要的作
用[1,2]。目前对汉坦病毒受体的研究表明细胞膜粘附分子 β3
整合素可能是其受体之一,阻断 β3整合素可以有效抑制病
毒入侵,转染 β3整合素则可以重建病毒感染能力[2~5]。所有
上述研究均是在活病毒水平上进行的,病毒膜蛋白与 β3整
合素相互作用的位点以及两者之间是否有直接的相互作用,
目前均无实验证据支持。通过 GSTpul-down技术在体外验证了两者之间的相互作用。
GSTpul-down技术是检测蛋白质相互作用的重要方法之一。该技术将一种已知蛋白与 GST标签融合
表达作为诱饵,与其它已知蛋白或未知蛋白孵育,通过 pul-down验证它们之间特异性的相互作用。汉坦病
毒包膜糖蛋白作为病毒入侵细胞的靶蛋白,由 M基因编码并最终以 G1、G2两个组分形式存在,两者均可
能与各自相应的膜受体结合感染细胞致病。本研究对 G2蛋白膜外区 81~140功能片段进行了 GST融合表
达,结果表明其在上清中大量存在。因此,将此片段的融合蛋白做为诱饵,与 β3整合素膜外区 23~133功能
片段进行 GSTpul-down研究,并与对照组相比较。结果显示 pul-down所获蛋白复合物中检测到 β3整合
素 27~133位氨基酸片段产物的存在,提示 G2N端 81~140位氨基酸片段与 β3整合素膜外区 27~133位片
段之间可能存在直接的相互作用。研究结果为 β3整合素作为汉坦病毒的受体提供了进一步的证据。鉴于
原核表达产物缺乏翻译后加工修饰过程,不能形成糖基化的蛋白质,其蛋白的结构特性与生理情况有较大
不同,pul-down技术本身也存在着不足,β3整合素与 G2蛋白结合的特异性还需提供更多的证据。
参考 文献
1 DimitrovDS.Cel,2000,101:697~702.
2 GavrilovskayaIN,ShepleyM,ShawR,eta1.ProcNatAcadSciUSA,1998,95(12):7074~7079.
3 GavrilovskayaIN,BrownEJ,GinsbergMH,eta1.JVirol,1999,73(5):3951~3959.
4 GavrilovskayaIN,PcreshniT,GeimonenE,etal.ArchVirol,2002,147(10):1913~1931.
5 MouDL,WangYP,HuangCX,etal.BiochemBiophysResCommun,2006,339(2):611~617.
6 龚非力.基础免疫学.武汉:湖北科学技术出版杜,1998,159~174.
图 2 β3整合素膜外区 23~133片段
真核表达的 Westernblot结果
图 3 G2蛋白 81-140位与 β3整合素 27~133
位氨基酸片段 Pul-down结果
图中所示为 GSTPul-down所获蛋白 WesternBlot结
果,1为 G2N81-140片段与未转染的 HEK293细胞裂
解液孵育后所获结果;2为 G2N81~140片段与转染
有 β3整合素 27~133位片段的细胞裂解液孵育后所
获结果,在沉淀复合物中可见 β3整合素 27~133位
片段的存在;3为无关对照蛋白 GST-TLM与转染有
β3整合素 27~133位片段的细胞裂解液孵育后所获
结果;4为 β3整合素 27~133位片段的表达产物
郭进军等:体外鉴定汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的相互作用 139