全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2009年第 1期
收稿日期：2008-08-18
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30571557）
作者简介：陈谋通（1984-），男，硕士研究生，专业方向：微生物学；E-mail：chen.moutong@mail.scut.edu.cn
通讯作者：刘建军，女，研究员，E-mail：junii8@126.com
2003 年 4 月， 人类基因组测序的完成标志着
一个新的生物学研究时代——后基因组时代（post-
genomic era）的来临。 各种各样的真核生物完整基
因组序列的获得，为生物医学研究从“一基因一酶
假说”方法变更到在基因组或者泛蛋白质组水平上
分析基因或者蛋白质的策略奠定了基础。全基因组
的序列信息并不足以解释及推测细胞的各种生命
活动现象，蛋白质才是细胞活性及功能的最终执行
者， 蛋白质-蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥
功能的重要途径。后基因时代的难题在于通过绘制
组成型蛋白质图谱和蛋白质相互作用的动力学研
究来测定细胞内蛋白质补体即蛋白质组如何组织
成为功能性、高级有序的网络、以及构成细胞的所
有组成蛋白有多少，它们复杂的动态相互作用关系
如何调节等，这些问题的解决才能最终阐明细胞中
各种生命活动的机制。
生物体内各种生命信息由不同的基因经转录、
翻译传递到相应的蛋白质上并使其具有各自的生
化特性及生物学活性；但每个蛋白质并不是独立的
在细胞中完成被赋予的功能，通常与其它蛋白质相
蛋白质相互作用的研究方法
陈谋通 刘建军
（深圳市疾病预防控制中心，深圳 518020）
摘 要： 随着基因组测序工程数量的增加，未知功能蛋白质测序工作也呈现指数式增长。 生物学进程主要是由蛋
白质执行和控制的，因此，阐明未知或已知蛋白质的生物学功能和从细胞水平上确定细胞机制，已成为蛋白质组学研究
的主要目标。 目前，随着酵母[1]、果蝇[2]、线虫[3]相互作用图谱的相继完成，蛋白质相互作用研究方法也不断发展和完善。 综
述了当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法，包括酵母双杂交技术，GST pull-down 技术，免疫共沉淀技术和串联亲和
纯化技术等多种研究方法，分析了各种技术方法的优缺点以及各种方法的改进，在试验中可根据不同的要求和目的选择
适宜的方法。
关键词： 蛋白质相互作用 酵母双杂交 免疫共沉淀技术 串联亲和纯化技术
Research Techniques for Protein-protein Interactions
Chen Moutong Liu Jianjun
（Shenzhen Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen 518020）
Abstract： With the increasing number of genome sequencing projects being launched out，there is a concomitant
exponential growth in the number of protein sequences，the function of which is still being unknown. Biological
processes are mainly executed and controlled by proteins， thus， the elucidation of the biological functions of
known/unknown proteins and cellular mechanisms at the molecular level would be as main objectives of proteomics
research. Currently，with proteins interaction maps have been accomplished in the yeast[1]，Drosophila[2]，and even Caenorhab
ditis elegans [3]，the techniques used for revealing protein-protein interactions have been developped and improved
increasingly. In this article，research as on techniques used for understanding protein-protein interactions，including Yeast
Two-Hybrid System，GST pull-down，co-immunoprecipitation and tandem affinity purification，were summarized and
advantages，drawbacks and corresponding developments of each technique were analyzed as well.
Key words： Protein-protein interactions Yeast two-hybrid Co-immunoprecipitation Tandem affinity purification
2009年第 1期
互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完
成特定的功能，而且有些蛋白质的功能只有在复合
体形成后才能发挥出来，如依赖于构象变化或翻译
后修饰的蛋白质功能。传统还原论方法主要集中在
研究在一个特殊的生理学环境下，研究一些新的基
因产物和它们之间的相互作用。 相反，更为整体的
研究策略目的在于理解复杂的生物学系统，比如在
细胞或者生物体水平上研究全部蛋白质之间相互
作用网络。若干大规模的蛋白质组技术已经发展到
可以绘制广泛的细胞内蛋白质之间相互作用图谱
的水平。 迄今已发展了包括酵母双杂交系统，噬菌
体展示技术，GST pull-down， 免疫共沉淀和串联亲
和纯化联合质谱分析的方法等多种研究方法为蛋
白质相互作用的研究提供了有效的分析方法，为蛋
白质组学研究奠定了坚实的基础 [4，5]。
1 酵母双杂交技术
1989 年，Fields 等 [6]报道了一种检测蛋白-蛋白
相互作用的遗传方法——酵母双杂交技术，它是利
用转录激活因子 GAL4 的特性建立的（图 1）。 GAL4
由位于 N 端 1~174 位氨基酸残基区段的 DNA 结合
域 （DNA binding domain，DNA-BD） 和位于 C 端
768~881 位氨基酸残基区段的转录激活域 （active
domain，AD）两个结构域组成，DNA-BD 能够识别位
于 GAL4 效应基因（GALL-responsive gene）的上游激
活序列 （Upstream activating sequence，UAS）并与之
结合 。 而 AD 则是通过与转录机制 （transcription
machinery）中的其它成分之间的结合作用 ，以启动
UAS 下游的基因进行转录。 DNA-BD 和 AD 单独分
别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上
充分接近时，则呈现完整的 GAL4 转录因子活性并
可激活 UAS 下游启动子， 使启动子下游基因得到
转录。因此，用诱饵蛋白 X 的核酸序列同 DBD 的核
酸序列融合表达 DBD-X，用 “猎物 ”蛋白 Y 的核酸
序列同 AD 的核酸序列融合表达 AD-Y， 形成两段
融合基因，当它们同时转化入同一酵母株内表达之
后，如果“诱饵”X 蛋白和“猎物”Y 蛋白在细胞核内
存在相互作用， 则使 DBD 和 AD 两结构域在物理
空间上靠近， 而重新形成完整的转录激活因子功
能，激活其下游基因表达。 因此，检测 GAL4 调控的
半乳糖苷酶的活性就可判断 X、Y 是否相互作用。
在检测蛋白质之间相互作用方面，酵母双杂交
系统具有非常高的灵敏度 ， 尤其对蛋白质间微弱
的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏
感地检测到。酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用
是基于酵母细胞内的试验，不需要经过提纯蛋白来
研究蛋白的相互作用，避免了提纯过程引起的蛋白
变性， 因而研究的是有生物活性的蛋白-蛋白相互
作用，反映体内的真实的相互作用情况。 Hurst 等 [7]
利用酵母双杂交的方法研究与乳腺癌转移抑制因
子 1（BRMS1）的相互作用蛋白，得到此蛋白为 Hsp90
伴侣蛋白。 Reddi 等 [8]利用酵母双杂交系统研究肝
炎 B 病毒反式作用因子 HBx 蛋白的自我偶联作
用， 结果发现 HBx 蛋白在分子环境中可以通过其
碳末端区域产生自我偶联作用。酵母双杂交技术也
应用于大规模蛋白质相互作用网络的研究，Lim 等 [9]
人利用此技术鉴定了 770 多个可能相互作用的蛋
白，有 75 对蛋白质产生相互作用，其中有 83%相互
作用的蛋白质在哺乳动物细胞中得到验证。
虽然酵母双杂交技术在研究蛋白质相互作用
中应用广泛，但是酵母双杂交技术也有其缺点：（1）
对相互作用蛋白在细胞内的定位要求严格，酵母双
杂交不能检测定位于胞浆内、细胞膜和通过分泌泡
图 1 酵母双杂交原理 [6]
a. 天然 GAL4 蛋白包含 DNA 结合和激活区域并且诱导 GAL1-
lacZ 转录；b. 杂合子中包含 DNA 结合区域或者激活区域并不能
单独诱导 GAL1-lacZ 转录 ；c. 蛋白 X 与蛋白 Y 的相互作用使得
结合区域和激活区域靠近诱导 GAL1-lacZ 转录
陈谋通等：蛋白质相互作用的研究方法 51
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
分泌到细胞外的蛋白而且融合表达可能会影响目
的蛋白修饰和折叠，尤其在研究异源蛋白相互作用
时 ，蛋白不一定能正确修饰和折叠，从而影响蛋白
的活性。（2）由于某些蛋白质本身具有转录激活功，
使"猎物"蛋白 AD 融合基因与“诱饵”蛋白 BD 融合
基因表达产物无需特异结合就能启动转录系统，从
而产生假阳性结果。 （3）DBD-X 和 AD-Y 不是通过
DBD-X-Y-AD 直接激活转录，而是通过第 3 种蛋白
或多蛋白的复合体把 X、Y 募集到一起，激活转录，
从而产生假阳性结果。 为了克服以上缺点，Kim 等 [10]
设计了一种新的酵母遗传筛选方法——一加二杂
交系统 （one plus two hybrid system），这个系统可以
高效率地筛选特异干扰已知相互作用蛋白的无义
突变，这种系统允许在同一细胞中存在双重报告系
统 。 分裂-泛素膜酵母双杂交系统 （split-ubiquitin
membrane yeast two-hybrid system） 主要是用于检测
膜蛋白的相互作用 [11]。 Vidalain 等 [12]为了解决高通
量酵母双杂交技术的假阳性问题，主要是通过阳性
酵母细胞的扩大培养消除污染猎物质粒的影响。
2 GST pull-down技术
体内稳定复合物中相互作用蛋白质的鉴定依
赖于基于亲和力的操作。该技术是通过以适当标签
和目的基因进行融合表达作为诱饵，从细胞提取物
中钓出与目的蛋白相互作用的蛋白。多组分蛋白质
复合物的分离主要利用固定在琼脂糖树脂的反标
签系统完成（表 1） [13]。 1988 年 Smith 等 [14]利用谷胱
甘肽-S-转移酶 （glutathione-transferase，GST）融合标
签从细菌中一步纯化出 GST 融合蛋白。 从此，GST
融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极
大的推广。 GST 融合蛋白 pull-down 方法是将诱饵
蛋白质和 GST 标签融合表达， 一步纯化后与含有
目的蛋白质的溶液进行孵育 ， 利用谷胱甘肽-
Sepharose 将 GST-融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀
下来， 然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质。 一般来说，
GST 融合蛋白 pull-down 方法用于两个方面 ： 一是
鉴定能与已知融合蛋白质相互作用的未知蛋白质；
一是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。
该方法比较简便， 避免了使用同位素等危险物质，
在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。 此外，
还有很多其它常用的蛋白标签，如与葡萄球菌蛋白
A 融合的诱饵蛋白可以通过固定有 IgG 的亲和柱
进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的诱饵蛋白可以
通过结合 Ni2+的色谱柱进行纯化。 Huang 等 [15]通过
构建 GST- p16INK4a 融合质粒 ， 鉴定了 ISOC2 是与
p16INK4a 相互作用的新蛋白质。 Xiao 等 [16]利用 His 标
签研究 PICK1 中 PDZ 和 BAR 两结构域之间的相互
作用。
融合蛋白亲具有高通量性、 高选择性的特点，
由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性（如
细菌、果蝇 、哺乳动物），该方法能够研究蛋白质在
复杂体系中的相互作用。但该方法的成功应用取决
于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性的重
组融合蛋白 ， 以及如何避免内源性诱饵蛋白的干
扰。
3 免疫共沉淀技术
利用非变性剂裂解完整细胞，细胞内许多蛋白
质间的相互作用可以保持下来，这样便可以用于检
测蛋白质之间的相互作用。 如果蛋白质 X 用其抗
体免疫沉淀，则在细胞内与 X 稳定结合的蛋白质 Y
也能沉淀下来。 蛋白质 Y 的沉淀是基于与 X 的物
理性相互作用，被称为免疫共沉淀。 该技术常用于
融合表达的带有蛋白标签的特异性抗体与目标蛋
白质或蛋白复合物结合，形成蛋白复合物沉淀。 将
蛋白质复合物溶解，再通过对蛋白标签具有特异吸
附作用的亲和色谱柱将蛋白复合物分离纯化出来，
进而通过二维电泳，SDS-PAGE 或质谱等技术鉴定
分离得到的蛋白。该方法常用来确定生理条件下目
的蛋白在细胞或组织内是否存在与其相互作用的
蛋白质，也可以应用于验证两个已知相互作用的蛋
白质。 Operana等[17]利用免疫共沉淀技术验证 UGT1A
蛋白质之间的相互作用， 证实了每个 UGT1A 蛋白
都可以潜在的形成同型二聚体。免疫共沉淀技术结

 
Poly-His Ni++
Biotin Streptavidin
Calmodulin-binding peptide Calmodulin(Ca++)
GST Glutathione
Specific epitope(FLAGc-mycHAetc. ) Monoclonal Ab

表 1 多组分蛋白质复合物分离常用的亲和标签和配位体 [13]
52
2009年第 1期
果还表明 UGT1A 可以与所有的 UGT1A 蛋白形成
异型二聚体，确证了在活细胞中利用荧光共振能量
转移（FRET）技术得到的结果。 Walker 等 [18]利用免
疫共沉淀技术发现死亡蛋白和 p53 蛋白形成的复
合物存在于白血病的血细胞的细胞质中而不存在
于正常血细胞中。
免疫共沉淀法所研究的相互作用蛋白均是在
宿主体内经翻译后修饰的天然蛋白，可以真实反映
正常生理条件下蛋白质间的相互作用。由于抗原抗
体的相互作用是在生理条件下检测的，所以有过量
表达引起的假阳性可以排除。但该方法需首先针对
目标蛋白， 制备出一定量的多克隆或单克隆抗体，
过程比较复杂。同时，与蛋白亲和层析相比，免疫共
沉淀的灵敏度不高，这是由于抗原浓度低于亲和层
析中的蛋白质浓度造成的，目的蛋白质只有达到一
定浓度才能与抗体结合形成沉淀。因此该法只适用
于研究具有高表达量的目标蛋白 ， 但是表达量过
高，会破坏相互作用的天然状态，所以应用范围有
较大局限。利用该方法检测蛋白质之间的相互作用
要求在一系列的清洗过程中保持复合体不变，因而
该方法可能检测不到细胞中处于动态平衡中的低
亲和与瞬间的相互作用，而且仅应用于从细胞中溶
解出来后仍存在于生理复合体中的蛋白质。因为该
方法可能出现假阳性的概率比较高，免疫共沉淀中
设置正确的对照非常重要。
验证免疫共沉淀试验结果的真实性主要从下
面几点考虑：（1） 抗原的沉淀是由本身抗体的结合
引起的，单克隆抗体不存在此问题 ，故建议使用单
克隆抗体。（2）确保抗体的特异性，就是在不表达抗
原的细胞溶解物中加入抗体也不会出现共沉淀现
象。（3）相互作用是真实的体内过程，而不是细胞裂
解的结果 [19]。
4 串联亲和纯化技术
强大 、灵敏度高的高通量质谱 （MS）技术的出
现，可以在飞摩尔（fm）以下的范围检测肽分子 ，常
用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合体亚基，
大大促进了细胞蛋白质组的生物化学纯化方法的
发展 。 但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复合
体，成为质谱在这方面应用的一个限速步骤。 1999
年 Rigaut 等 [20]共同提出了一套分离复合蛋白的新
方法--串联亲和纯化 （Tandem affinity purification，
TAP）， 兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化
方法的优点，为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一
条新途径 ，串联亲和纯化联合蛋白质质谱 （MS）鉴
定技术可以进行生物化学纯化，双分子和大分子蛋
白质复合体的分析。
串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被
分离纯化蛋白的一端加一个 TAP 标签， 该标签由
IgG 结合结构域 （ProtA）及一个钙调蛋白结合多肽
（CBP）组成，结构域与多肽之间由一个 TEV 蛋白酶
切位点隔开。通过基因重组将细胞内源性的目的蛋
白基因置换为带有 TAP 标签的基因， 温和裂解细
胞，抽提细胞总蛋白 ，将抽提的总蛋白加入 IgG 亲
和柱，TAP 标签的 ProtA 端会与 IgG 特异结合，在用
洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后，
再用含有 TEV 蛋白酶的洗脱液将蛋白质复合体切
割下来。 在钙离子参与下，被切割下来带有 CBP 的
蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合， 充分洗脱，就
可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质，最后得
到高纯度的目的蛋白复合体（图 2） [21]。
由于 TAP 标签的高度特异性以及采用两步洗
脱纯化法，在纯化过程中不需要强烈冲洗，因此可
以更好地保持了较不稳定的蛋白质复合物，而且非
特异蛋白的量也会很低，这是一步纯化法所不能比
拟的。 通常，在适当的表达载体上 TAP 标签可以接
到目的蛋白的 C-末端或者 N-末端， 表达载体可以
瞬时或者稳定地转入感受态细胞或者生物。构建的
标签-目的蛋白表达载体最好能够替代内源野生型
基因。 值得注意的是，目的蛋白的过量表达经常会
导致蛋白的非特异性变化或者宿主蛋白与非天然
蛋白相互作用。所以，在构建表达质粒时，最好使用
图 2 串联亲和纯化（TAP）纯化
A.重组在碳末端标签融合蛋白的结构 ；B.串联亲和纯化的步骤
陈谋通等：蛋白质相互作用的研究方法 53
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
目的蛋白的天然启动子来控制其在宿主细胞中的
表达。 TAP 标签融合蛋白的方法并不适用于所有蛋
白 ，最初的 TAP 标签蛋白分子量约为 20 kD，由于
其分子量过大可能给蛋白的功能或其相互作用带
来负面影响 [22]。 Gavin 等 [23]发现当 TAP 标签连接在
目的蛋白 C-末端的时候， 酵母蛋白有大约 18%失
去活性， 这表明 TAP 连接在目的蛋白的 C-末端时
会影响蛋白的功能。 为了克服这一缺点，必须采取
其他策略，比如把标签连接在目的蛋白的 N-末端、
改用小分子量的标签或者将串联标签的组分标签
蛋白做相应的改变。
经过串联亲和纯化的目的蛋白 ， 通过 SDS-
PAGE 或者双向电泳分离之后，找出与目的蛋白相
互作用的蛋白质，采用质谱分析的方法对其进行分
析鉴定。 Knuesel 等 [24]通过构建 pRAV-FLAG TAP 哺
乳动物表达载体的方法鉴定 HSP70 蛋白是 SMAD30
的特异相互作用蛋白。 Rohila 等 [25]利用 TAP 方法验
证水稻蛋白激酶的相互作用，结果发现 56%的 TAP
标记的蛋白激酶可以与其它蛋白质相互作用，证明
了 TAP 标签在水稻植物中研究蛋白的相互作用是
有效的。由于在高等真核细胞中存在内源表达的蛋
白质，与融合蛋白在细胞内竞争与其相互作用的蛋
白，从而降低了融合蛋白与其相互作用蛋白的结合
效率，使得该技术在高等真核细胞中的应用受到限
制 。 为了解决这个问题 ，Foler 等 [26]将 TAP 技术与
RNAi （RNA interference）技术联用 （iTAP 技术 ），使
得内源基因沉默，由于 mRNA 序列的不同，果蝇细
胞中带有 TAP 标签的目的蛋白 mRNA 不受 RNAi
的影响得以表达，从而避免了细胞中内源蛋白的干
扰。
5 其它技术方法
除以上介绍的方法外，还有其它研究蛋白质相
互作用的方法， 比如基于生物信息学的分析方法 [27]，
化学交联技术 [28]，蛋白质微阵列 [29]等方法。
随着蛋白质组学时代的到来，蛋白质功能研究
越来越受到研究者的重视，揭示蛋白质之间的相互
作用关系，建立相互作用的网络图，已成为蛋白质
研究领域中的热点，蛋白质相互作用的研究方法非
常多，各种研究蛋白质相互作用的技术也在不断地
改进和发展。但是，每种技术都有自己的优缺点，研
究者需要根据自己的试验需要和目的选择合适的
技术方法。由于蛋白质相互作用的研究容易出现假
阳性和假阴性的结果，所以同时选择两种以上的研
究方法进行研究结果的验证是十分必要的。总的来
说，选择一种好的蛋白质相互作用研究方法应该从
下面几个方面考虑：（1）具有特异性，可以鉴定特异
作用的蛋白质。 （2）尽量避免假阳性和假阴性的结
果。 （3）能够尽量的反映蛋白质在生理状态下的相
互作用。 随着计算机技术的发展，最近已有研究者
通过计算机模拟蛋白质相互作用网络，从而发现更
多有相互作用的蛋白质，但这仍然需要利用以上提
到的实验方法进行验证。研究蛋白质相互作用方法
的不断增多和改进，将为揭示蛋白质功能提供强有
力的工具。
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