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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
TAT-hEGF融合蛋白在 E． coli BL21(DE3)中
高效自我表达
智庆文1 苗爱玲2
(1中国人民解放军防化指挥工程学院，北京 102205;2山东省实验中学，济南 250109)
摘 要: 为了获得 TAT-hEGF融合蛋白在 E． coli BL21(DE3)中高效表达，构建了原核表达载体 pRSET-tat-hegf，将其转
化 E． coli BL21(DE3)得到重组工程菌 BL21(DE3)/ pRSET-tat-hegf。工程菌在无 IPTG 的诱导下实现了高效表达，TAT-hEGF
融合蛋白的表达量占总菌体蛋白的 45． 6%，主要以包涵体形式存在。
关键词: TAT-hEGF融合蛋白 人表皮生长因子 包涵体 E． coli BL21(DE3)
High and Self-expression of TAT-hEGF Fusion
Protein in E． coli BL21(DE3)
Zhi Qingwen1 Miao Ailing2
(1 Institute of Chemical Defense of CPLA，Beijing 102205;2Shandong Experimental High School，jinan 250109)
Abstract: To high produce human epidermal growth factor fusion protein(TAT-hEGF)in E． coli BL21(DE3) ，a pRSET-tat-hegf
prokaryocyte expression vector was constructed and transformed into E． coli BL21(DE3)． The recombinant engineering bacterium BL21
(DE3)/pRSET-tat-hegf could highly express TAT-hEGF fusion protein without IPTG induced． It was main formed inclusion body and
had a yield of 45． 6% of the total protein in the cells．
Key words: TAT-hEGF fusion protein Human epidermal growth factor Inclusion body E． coli BL21(DE3)
收稿日期:2009-12-25
作者简介:智庆文，男，博士研究生，研究方向:微生物基因工程;E-mail:zhqw6988@ 126． com
pRSET是一种常用的原核表达载体，目的基因
片段插入到多克隆位点处，在 IPTG 的诱导下重组
工程菌一般都能进行有效表达［1，2］。本研究将人表
皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)
的融合基因片段整合到 pRSET 的 Nde I 和 EcoR I
两酶切位点之间，探讨重组工程菌株 BL21(DE3)/
pRSET-tat-hegf能否在没有 IPTG的诱导条件下实现
高效自我表达。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 质粒和菌株 pRSET-A，为 Invitrogen 公司
产品;pCAM-35S-hEGF 为本实验室构建并保存;
pBS-T载体，大肠杆菌 TOP10 及 BL21(DE3)感受态
细胞为天根生物技术有限公司产品。
1． 1． 2 酶及生化试剂 限制性内切酶 Nde I 和
EcoR I 为 NEWBIO 公司产品;小量质粒提取和纯
化试剂盒，T4DNA 连接酶，一管便携式 PCR Mas-
terMix Taq，DNA Marker，蛋白质标准皆为天根生
物技术有限公司产品;异丙基-1-硫代-β-D-半乳
糖苷(IPTG)为 Bio-Basic Inc．产品。
1． 1． 3 LB 培养基 配制 1L 培养基的用量及产品
来源，Trytone 10 g /L 为 Oxiod 产品，Yeast Extract 5
g /L为 Oxiod产品，NaCl 10 g /L北京化工厂产品。
1． 1． 4 主要仪器 琼脂糖凝胶电泳仪为六一仪器
设备厂产品;JY92-II超声波细胞粉碎机为宁波新芝
生物科技股份有限公司产品;SDS-PAEG 蛋白电泳
仪为 Bio-Rad产品;Transilluminator 2020D凝胶成像
系统为美国冷泉港产品。
1． 2 方法
1． 2． 1 表达载体的构建 依据大肠杆菌偏爱的密
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
码子设计合成一对引物，在上游加入蛋白转导域
TAT(其氨基酸序列为 YGRKKRRQRRR)的核苷酸
序列和 Nde I酶切位点，下游加入 EcoR I 酶切位点
(划线部分)。上游引物序列:5-CATATGTACG-
GCCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTAATAGCG-
ATCGTCGTCGCCAGCGTCGTAAAAAAAATAGCGAT-
3，下游引物序列:5-GAATTCTTAACGAAGTTCCCA-3。
以 pCAM-35S-hEGF［3］为模板，PCR扩增出融合
目的基因片段 tat-hegf;将该片段连接到 pBS-T 载体
上，构建成一中间载体 pBS-tat-hegf;以 Nde I和
EcoR I 两内切酶分别消化 pRSET和 pBS-tat-hegf，回
收目的基因片段和载体片段连接，得到表达载体
pRSET-tat-hegf。表达载体的构建过程如图 1 所示。




图 1 表达载体 pRSET-tat-hegf构建流程
1． 2． 2 重组工程菌的诱导表达 通过热激转化法
将 pRSET-tat-hegf重组表达载体导入到 E． coli BL21
(DE3)体内，通过酶切、测序等方法验证所构建的工
程菌，验证正确无误后进行诱导表达。取 5 mL LB
培养液于试管中，加入 5 μL 工程菌液，37℃过夜培
养，然后加入 IPTG诱导 2 h，培养液中 IPTG 的终浓
度为 1 mmol /L，取 10 μL菌液加入等体积上样缓冲
液于沸水中煮 3 min，最后取 10 μL混合液上样进行
SDS-PAGE电泳。
1． 2． 3 培养温度对表达量的影响 为验证上述工
程菌在没有 IPTG 诱导情况下可以高效表达，本研
究对同一工程菌进行了如下处理，取 6 支试管分成
3 组，分别加入 5 mL LB 培养液，每组分别在 30℃，
33℃和 37℃条件下培养 16 h，然后在每组试管的其
中 1 支加入 5 μL IPTG 诱导 2 h，培养液中 IPTG 的
终浓度为 1 mmol /L，分别取 10 μL菌液加入等体积
上样缓冲液于沸水中煮 3 min，最后取 10 μL混合液
上样进行 SDS-PAGE电泳。
1． 2． 4 目的蛋白表达形式分析 为了分析目的蛋
白 TAT-hEGF 是可溶性表达还是包涵体形式表达，
本试验进行了 100 mL 菌体放大培养，接种量按 1 /
100 进行，37℃过夜培养，收集菌体后由 PBS 清洗 2
次，后加入 10 mL PBS充分悬浮菌体，在超声波粉碎
机中彻底粉碎菌体，离心分离上清和沉淀，沉淀由
PBS清洗 2 次后加入 10 mL 8 mol /L尿素溶解，再次
离心收集上清和沉淀，沉淀再用 10 mL 8mol /L尿素
溶解一次，分别取 5 μL上述溶液加入等量上样缓冲
液，沸水中煮 3 min进行 SDS-PAGE电泳。
2 结果与分析
2． 1 重组 pRSET-tat-hegf表达载体酶切检测
以 Nde I 和 EcoR I 两内切酶消化 pRSET-tat-
hegf重组载体，从琼脂糖凝胶电泳结果(图 2)可以
看出该载体被切成 2 部分，一部分大小在 3 000 bp
左右，是载体 pRSET的条带，另一部分在 200 bp 左
右，是目的基因片段 tat-hegf 的条带。另外，基因测
序没有发现基因突变(结果未显示)。

1，2． pRSET-tat-hegf 重组质粒;M． DNA marker
图 2 pRSET-tat-hegf酶切检测
2． 2 重组工程菌 BL21(DE3)/ pRSET-tat-hegf诱导
表达检测
本研究同时还构建了另一基因的表达载体 pR-
SET-tat-aldh2，同一条件下与重组工程菌 BL21
(DE3)/ pRSET-tat-hegf 同时进行诱导表达，结果
(图 3)显示，重组工程菌 BL21(DE3)/ pRSET-tat-
hegf无论是在诱导还是在没有 IPTG 诱导剂情况下
都进行了同样高效表达。而另一工程菌株 BL21
(DE3)pRSET-tat-aldh2 只有在有 IPTG 诱导剂的诱
导下才能进行有效表达。
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2010 年第 7 期 智庆文等:TAT-hEGF融合蛋白在 E． coli BL21(DE3)中高效自我表达


1．未经诱导的 BL21 /pRSET-tat-hegf;2． 经诱导的 BL21 /
pRSET-tat-hegf;3． 未经诱导的 BL21 /pRSET-tat-aldh2;
4．经诱导的 BL21 /pRSET-tat-aldh2;M． protein marker
图 3 重组工程菌诱导表达检测
2． 3 重组工程菌 BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf 不同
培养温度下的表达
第一组为 1 和 2 号，在 30℃培养，其中 1 号为未
诱导，2 号为诱导;第二组为 3 和 4 号，在 33℃培养，
其中 3 号为未诱导，4 号为诱导;第三组为 5 和 6
号，在 37℃培养，其中 5 号为未诱导，6 号为诱导;
SDS-PAGE电泳结果(图 4)清晰显示，重组工程菌
BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf在不同培养温度下诱导
能高效表达，不诱导同样能进行高效自我表达，并且
诱导菌的表达量也未见比不诱导菌有明显增加。

M． protein marker;1，3，5． 分别在 30℃、33℃、37℃未经
诱导;2，4，6．分别在 30℃、33℃、37℃经过诱导
图 4 重组工程菌 BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf
不同培养温度下的表达
2． 4 目的蛋白表达形式分析
重组工程菌 BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf 在没
有 IPTG诱导条件下过夜培养，对于处理后的各部
分菌体 SDS-PAGE 结果显示，目的蛋白 TAT-hEGF
主要以包涵体形式表达。图 5 中 1 泳道说明工程菌
表达良好，蛋白分析软件显示目的蛋白的表达量占
总菌体蛋白的 45． 6%，2 泳道为超声波粉碎菌体的
分离上清，上清液中几乎没有目的蛋白;从 3、4 和 5
泳道可以看出目的蛋白主要在沉淀中，沉淀由 PBS
清洗 2 次后剩余菌体蛋白的量已较少。沉淀能溶于
8mol /L尿素中，第一次溶解的量明显比第二次多，
但是，尽管进行充分搅拌仍然不能使所有的沉淀溶
解完全(图 5 中 5 泳道)。


1． BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf;2．细胞裂解菌体后取上
清;3．第一次蛋白溶解量;4．第二次蛋白溶解量;5．细
胞裂解菌体后的沉淀;M． protein marker
图 5 目的蛋白表达形式分析
3 讨论
本研究成功构建了重组工程菌 BL21(DE3)/
pRSET-tat-hegf，该工程菌株不但在 IPTG 的诱导下
表达良好，而且在没有 IPTG 的诱导下同样高效表
达。pRSET是常用的一种原核表达载体，它所用的
T7 启动子在没有 IPTG 的诱导下一般是不开放的。
本研究所构建的重组工程菌 BL21(DE3)/pRSET-
tat-hegf能高效自我表达的原因尚不清楚，但是这一
结果确是非常有意义的。目前 hEGF的生产主要通
过原核细菌的 IPTG诱导［4］或细菌的胞外分泌［5，6］，
表达量较低，纯化困难;真核主要通过甲醇诱导［7］，
生产中添加诱导剂不但增加费用，而且诱导剂一般
对人体有害，也不易将其彻底清除，这就增加了纯化
的难度。本研究结果省却了诱导步骤，不但简化了
诱导工艺还简化了纯化流程。
利用 pRSET构建的 hEGF的表达载体能自我表
达，而作为对照的 ALDH2却不能自我表达，对于其他
的基因还需要尝试。另外，载体构件———尤其是启动
子等关键结构是否发生了突变还有待进一步研究。
(下转第 100 页)
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
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(上接第 91 页)
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