全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
植物染色体分带及其荧光原位杂交技术研究进展
高猛 1, 2 安玉麟 2 孙瑞芬2
( 1内蒙古农业大学,呼和浩特 010019; 2内蒙古农牧业科学院,呼和浩特 010031)
摘 要: 染色体分带和荧光原位杂交技术是植物研究中较重要和常用的技术手段。从它们的产生开始一直不断发展,
已应用到植物研究中的很多方面。介绍了这两个技术的发展、原理和在植物研究中的进展。
关键词: 植物 染色体 G iem sa C分带 荧光原位杂交
Advances in Chromosome Bands and Fluorescence in situ
Hybridization in P lant
GaoM eng
1, 2
An Yulin
2 Sun Ruifen2
(
1
InnerM ongolia Agriculture University, H uhhot 010019;
2
InnerM ongolia A cademy of Agr iculture and AnimalH usbandry Sciences,H uhhot 010031)
Abstrac:t Chromosom e bands and fluorescence in situ hybr idiza tion a re im portant and comm only used techn ique in plant re
search. They have been deve loped since they cam e to be used in m any aspects. In th is paper, prog resses, pr inc iple and prospects o f chro
m osom e bands and fluorescence in situ hybr id ization in p lant resea rch are rev iew ed briefly.
Key words: P lants Chrom osom e G iem sa C bands F luorescence in situ hybr id ization
收稿日期: 20100309
基金项目:国家向日葵现代产业技术体系 ( nycytx21)
作者简介:高猛,男,在读硕士研究生,研究方向:作物遗传育种; Em ai:l gaozesh i2008@ 163. com
通讯作者:安玉麟,男,研究员,硕士生导师; Em ai:l nkyanyu lin@ 163. com
1 染色体分带
染色体分带是一项用特殊的染料经一定程序对
染色体染色,使其出现深浅不一的带纹的技术。生
物细胞中有常染色质和异染色质之分, 在细胞分裂
过程中,异染色质的浓缩程度要比常染色质的浓缩
程度高。在染色体分带中, 经酸、碱、酶或高温的处
理后, DNA变性双链打开, 由于异染色质区的复性
速度快,易于染料结合染色较深, 而常染色质复性
慢,结构松散染色较浅,从而在染色体上出现深浅不
一的带纹。特定染色体有特定的带纹, 因此分带技
术可作为鉴别染色体组和单个染色体的手段, 从而
可以深入认识染色体结构成分和遗传的关系。
1. 1 G iem sa C分带和荧光显带研究的发展
染色体分带技术中最初的显带是荧光显带,上
世纪 60年代末发明了 Q显带技术, 它是将植物染
色体经芥子奎吖因 ( quinacrine mustard)处理后, 在
荧光显微镜下形成明暗不同的带纹。 1973年发明
了另一种荧光显带技术, Hoechst33258显带, 其原理
主要是基于染料分子与 DNA分子中的碱基作用,从
而显带。 1970年, Fardue和 Ga ll在研究中发现染色
体着丝粒区可特殊显带, 1971年 A rrigh i等在此基础
上建立了 G iemsa C分带技术。G iemsa显带最早是
在 1970年应用在哺乳动物染色体上, 1972年以后
应用在植物方面。 1974年 G ill和 K imber[ 1]最先报
导了黑麦染色体上的 C分带技术。随着制片技术
的发展,分带技术也在不断改进和完善, C分带技术
已应用于很多植物,尤其是麦属植物中研究较为深
入。研究表明, 小麦染色体 C分带带型比较稳定,
并且重复性好 [ 2, 3]。杨瑞武等 [ 4]利用改良的 C分带
技术分析了矮杆波兰小麦的染色体带型,发现在非
同源染色体之间, 带型的数量、大小、强弱及其分布
情况存在明显差异。荧光显带也应用到很多植物
中, 并且其操作简单, 与其它的分带技术存在异同。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
L iu等 [ 5]发展的 DAPI荧光显带技术在染色体未经
化学处理的情况下,直接用 DAPI进行染色, 在植物
染色体上显示出类似与 Q带的丰富带纹,且带纹稳
定,无论是大基因组还是小基因组都能够很好地显
示出带纹。陈建民等 [ 6]对苜蓿染色体荧光分带时
发现 DAPI带型的数目和位置与 C带基本相似,两
个二倍体的 DAPI带型明显不同。
1. 2 植物染色体 G iem sa C分带和荧光显带
植物染色体 G iemsa C分带是染色体经过一定
的酸、碱、酶或高温处理后用 G imesa染料染色, 使染
色体在特定位置上出现深浅不一的带纹, 它是对染
色体的结构异染色质区域染色。C分带是植物染色
体研究中应用最为广泛的一种分带方法, 主要用于
染色体的鉴别和核型分析, 同时为物种亲缘关系的
鉴定提供依据 [ 7]。
荧光显带是是根据荧光染料与 DNA中 AT、CG
碱基结合能力的不同而在染色体上显示出带纹。如
DAPI( 4, 6d iam id ino2pheny lindole, 即 4, 6二2苯
基吲哚 )、DA远霉素 ( D istamycin A )等与 AT碱基特
异结合, CMA色霉素 ( Chromomycin A3 )、AMD即放
线菌素 D ( A ctinomyc in D )等特异性与 CG碱基结
合,利用这种特异性的结合使染色体上不同部位出
现荧光带纹。荧光显带反映了染色体中 DNA碱基
组成的不同和变化。但有学者研究表明在局部环境
下蛋白质可能会影响染料与 DNA的结合能力, 同时
也可能对荧光的激发和散射产生影响 [ 8, 9]。
G iem sa C分带技术在开创以来最先是在动物
细胞学研究方面应用的比较多,随着技术的不断改
进和完善,如今已经被广泛应用到植物研究中,而且
被应用到的植物种类越来越多,技术和方法也越来
越成熟,它在植物研究领域的应用主要有以下几个
方面。
1. 2. 1 植物染色体核型分析 以往进行的核型分
析只能根据染色体的形态特征 (长度、臂比、缢痕、
随体等 )进行区分, 这种常规的分析方法有其自身
的局限性,不能将物种的染色体一一区分开来。应
用分带技术进行植物染色体核型分析可以克服这些
缺点, 能够更加准确区分染色体, 准确分析核型,从
而为深入研究物种起源和遗传关系等提供重要的细
胞学资料。以研究最多的麦属为例, 普通小麦的染
色体大小和臂比相近,常规方法难以区分, G ill等 [ 1]
最早对小麦进行了 C分带, 对其染色体进行了区
分。Endo等 [ 10]又用改进的分带方法对普通小麦分
析, 结果除了 1A外的所有染色体都显示出特异带
纹,使得各个染色体都能清楚辨认。目前对于研究
最多的黑麦来讲, 其染色体 C带核型特征已经被确
定 [ 11- 13]。吴金华等 [ 14 ]对奥地利黑麦进行 C分带染
色体核型分析发现, 除了 2R和 4R长臂近端部约
1 /4处有带且 7R无中间带外, 其余带型与黑麦标准
C分带带型基本一致。刘光欣等 [ 15]对 8个大赖草
材料进行了 C分带研究,结果发现大部分染色体都
显示较强的末端带,着丝粒带和中间带则不丰富。
1. 2. 2 远缘杂交和染色体细胞学鉴定 由于不同
物种的染色体显带不同,因此已将 C分带技术应用
于植物远缘杂交和染色体工程研究细胞学鉴定中。
G ill和 K imber [ 16] 1974年首次利用 C分带技术识别
小麦的染色体易位, 鉴别出 6B /4A、1R /1D这类整
臂易位类型。Gustafson等 [ 17]于 1983年用 C分带方
法鉴定出小麦 -黑麦的易位系,由带纹的变化鉴定
出大麦 1RS染色体易位到小麦 1AL、1BL上,但无
法找到易位点, 易位长度也无法估计。 Darvery和
Gustafson( 1975)将 C分带技术用于识别小麦 - 黑
麦异附加系中的黑麦染色体, 成功地识别了 1R、
3R、4R、5R 和 7R, 而 2R仅在某些品系中得以
识别。
1. 2. 3 研究多倍体起源 多倍体现象在生物界非
常普遍,而且多倍化也是物种进化和形成的重要途
径之一。通过对植物染色体进行分带,研究染色体
形态和特征, 可以用于探讨多倍体植物的起源。
L inde
[ 18]通过染色体带纹相似性的比较, 发现大麦
属的异源四倍体 H ordeum reshevitzii ( 4x)可能是由
H. reshecitxz ii( 2x)与H. caliform icum ( 2x)相近种杂交
形成。高云红等 [ 19 ]对节节麦 -黑麦双二倍体以及
亲本节节麦、黑麦进行 C分带研究, 结果显示节节
麦 -黑麦双二倍体的 C带带型与亲本的基本相同,
说明该双二倍体含有双亲的完整的染色体组, 从而
在细胞学水平上证实了该多倍体种质的来源。
2 荧光原位杂交
荧光原位杂交 ( fluorescence in situ hybrid iza
tion, FISH )是一项分子生物学与细胞学相结合的技
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2010年第 10期 高猛等:植物染色体分带及其荧光原位杂交技术研究进展
术,目前在植物研究中的应用较为广泛。它是用特
异性的核酸重复序列作为探针,用一定方法将其进
行荧光标记,然后与被测目标进行杂交,通过荧光显
微镜下可以观察到特异的荧光信号, 从而对其进行
分析处理。
2. 1 荧光原位杂交技术的发展
1969年 Gall和 Pardue最先用放射性标记的 RNA
探针定位特定的靶 DNA序列,从而开创了 RNADNA
原位杂交技术。他们利用同位素标记的 DNA探针
对非洲爪蟾的核内 rDNA在细胞制片上进行检测。
由于同位素探针的高背景缺陷,限制了它对靶序列
的精确定位。在原位杂交技术的开创初期, 都是采
用放射性同位素标记探针, 需要用放射性自显影进
行检测,这种检测上的限制和当时分子克隆技术的
缺乏使得它不能得到广泛的应用。因此在随后的研
究中, 人们主要是在标记方法和探针类型方面进行
改良和探索。1975年, M anning等 [ 20]最先在分子杂
交中使用非放射性标记,用细胞色素 C将生物素与
RNA分子连接起来。 1977年, Rudk in[ 21 ]发明了用
间接免疫荧光检测目的 DNA的非同位素原位杂交
(N on isotopic in situ hybrid izat ion, N ISH )。 1981年,
Langer等 [ 22 ]首次采用生物素标记的核酸探针成功
地进行了染色体原位杂交。至此, 以荧光标记探针
进行基因原位杂交的技术趋于成熟。这项技术于
1985年由 Rayburn开始应用于植物研究中 [ 23] , 并不
断发展和完善,目前, 该技术已应用到植物研究的很
多领域。
2. 2 荧光原位杂交技术基本原理
荧光原位杂交技术的基本原理是在核酸碱基互
补配对原则的基础上, 利用一定的物理或化学方法
对核酸处理使其变性, 用荧光染料标记的核酸探针
( DNA或者 RNA序列 )与染色体或 DNA纤维上变
性后的单链序列互补配对,从而杂交在一起,然后用
与荧光分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结
合,通过一定的检测手段将荧光杂交信号在染色体
或者 DNA纤维上定位和分析。
2. 3 荧光原位杂交技术中的探针
随着荧光原位杂交技术的不断发展, 特异的探
针序列作为该技术中的一个关键, 针对不同植物和
不同的研究目的也有很多的改进, 主要是探针类型
和标记方法。
2. 3. 1 探针的类型 针对不同的研究对象或者目的,
荧光原位杂交技术中的探针大致有以下几种 [ 24- 28]。
( 1)染色体特异性重复序列探针: 在特异染色体类
型上重复元件可达 106拷贝数, rRNA基因、端粒重
复序列、着丝粒重复序列以及类似于 卫星、卫星
类等都已经被克隆,而且这种探针一般对应的靶
序列大于 1M b, 与靶位点紧密结合形成高度浓缩的
区域,因此易于检测,它通常用于快速检测染色体非
整倍体,如单体和三倍体。 ( 2)单拷贝序列探针: 此
类探针针对基因组中单拷贝或者低拷贝的序列, 通
常是某个基因的 DNA克隆、RFLP或 RAPD标记或
是用大的插入片段,如柯斯质粒或酵母人工染色体标
记。这些序列可以来自质粒、粘粒、噬菌体 PI载体、
细菌人工染色体或酵母人工染色体克隆等。目前已
经有小到含有 2 kb目标序列的质粒探针用于 FISH,
然而由于杂交位点检测率随着探针大小的降低而降
低,所以其杂交效率很小 ( 20% - 50% ) [ 29]。 ( 3)总基
因组探针: 高等物种的基因组中含非常多的重复序
列,而真正编码的 DNA序列只占很小的比例, 而这
些高中度重复序列的不同也代表了物种的特异性,
然而并非所有的重复序列都有物种特异性, 因此,利
用某一物种的总基因组 DNA作为探针, 与另一物种
的染色体进行原位杂交, 可用于分析异源多倍体基
因组组成、起源、进化和其亲缘关系。 ( 4)染色体文
库探针: 由基因组 DNA文库中分离出的某一条或
某一区域的核酸片段组成, 可由克隆到噬菌体和粘
质粒上的染色体特异性大片段插入文库制取, 且此
种探针片段小,与相邻区域发生重叠及制片过程中
被破坏的可能性小。这类探针可用于中期染色体重
组和间期核结构分析,以及鉴定染色体的异位和畸
变等。 ( 5) RNA探针: RNA探针主要用于 RNA的
原位杂交技术中。主要包括 ssRNA探针和寡核苷
酸 RNA探针两种, 其中单链反义 RNA探针广泛应
用于组织切片和整体制备物上。由于 RNA原位杂
交是探针与细胞内的特定 mRNA杂交, 故 RNA探
针的敏感性更强,不需要变性, 它与目标 RNA形成
的杂交体比 DNA探针的更紧密, 同时, 它可用于
鉴别一些特定序列如两个相关密切的同源性 mR
NA (同型 mRNA )。RNA探针比 DNA探针更加具
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
有优越性, 尤其是有义链可作为非特异性杂交的
背景对照, 因此它的应用在 RNA原位杂交中最为
广泛 [ 30]。
2. 3. 2 探针的标记方法 在探针的标记方法方面,
F ISH的探针标记是由最初的放射性标记方法发展
而来的。放射性标记方法虽然要求不高, 且具有较
高的灵敏度,但是其信号分析比较困难,又有放射性
危害, 所以逐渐被非放射性标记所取代。FISH的标
记方法可分为直接法和间接法两种。直接法是将荧
光物直接标记到核苷酸上,杂交后可被检测到,而间
接法是先在 DNA探针上接半抗原,镜检前再用与半
抗原特异结合的蛋白质进行检测。直接法虽然操作
简单, 干扰少,但是它得到的荧光信号不能被放大处
理,因而灵敏度相对较低。直接法中常用的与核苷
酸直接结合的荧光素有异硫氰酸荧光素 ( F ITC )、罗
明达衍生物 ( TR ITC )、氨甲基香豆素醋酸酯 ( AM
CA )等。在间接法中常用的半抗原为生物素和地高
辛。其标记方法有很多如缺口平移法、随机引物法、
PCR或 RNA体外转录法, 标记长度一般为 200 -
400 bp。生物素是最早用到的中间标记物, 与生物
素结合的核苷酸探针可用结合有荧光素的亲和素
( av idin)和链亲和素 ( streptav idin )检测。由于在原
核生物和真核生物中普遍存在着内源性生物素的干
扰,抗生物素蛋白对非流动性基质存在非特异性结
合,因此提高了标记成本,降低了灵敏度, 于是后来
发展了以地高辛标记。地高辛标记的探针可用连有
荧光素的抗地高辛抗体检测,由于它灵敏度高,因此
得到广泛的应用。
2. 4 靶的类型
在荧光原位杂交中针对不同的研究对象和目的
与探针杂交的靶也有不同的类型。 ( 1) 中期染色
体: 最早应用以及应用最普遍的靶就是中期染色
体。由于在细胞有丝分裂中期的染色体可以用传统
的染色体制片技术获得, 而且可以非常清晰地观察
到单条染色体。随着染色体制片技术的逐渐发展和
成熟, 以中期染色体为探针的靶序列进行原位杂交
分析就更加简单,也使得原位杂交的技术应用范围
更加广泛。但由于中期染色体高度浓缩, 因此分辨
率相对较低 [ 31 ]。 ( 2) 间期细胞核: 相对中期的染
色体来说间期的细胞核中的染色质浓缩程度要低很
多,因此其原位杂交的分辨率要比分裂期高。但由
于细胞核本身具有一定的空间结构使得分辨率在
50 kb左右,要突破这个限度就需要打破其原有的
结构,并且间期的细胞核不具有染色体结构,在应用
范围上也受到了一定的限制。 ( 3) 游离染色质: 前
面提到为了提高分辨率要打破细胞核的原有结构,
因此有人提出, 用碱性溶胞剂 ( a lkaline lysis buffer)
对处于 G1和 G2期之间的间期细胞核进行处理,释放
出游离的染色质丝, 人为地改变其结构, 使得其中
DNA的浓缩程度进一步降低。试验结果表明, 这种
方法能够使分辨率接近 10 kb, 能够分析 1M b范围
内的 DNA序列的位置关系。 ( 4) DNA纤维: DNA
纤维作靶是将单细胞的悬浮液涂抹在载玻片上, 然
后用碱性变性剂将染色体结构破坏,使 DNA分子与
复合的蛋白质分离开来,这样就形成了游离的 DNA
纤维,因此杂交后的信号不再是单个的点,而是许多
点组成的线,通过测量信号的长度能够估计出探针
分子的长度。这种以 DNA纤维为靶与探针杂交的
方法具有快速、直接和简便的优点,在 1M b的 DNA
范围内,其分辨率能达到 1- 2 kb, 但其不足之处在
于不能阐明靶序列相对于着丝粒、端粒和异染色质
块等染色体标记的位置和取向, 如果没有已知位置
的 DNA标记的共定位则不能鉴别染色体。
2. 5 荧光原位杂交技术的应用
2. 5. 1 亲缘关系的鉴定及多倍体的起源研究 在
物种亲缘关系的鉴定方面,在核型分析的基础上,通
过对基因组的整体分析检测可以更加明确地对其进
化关系进行比较。以分带技术的染色体核型进行对
比, 并且结合原位杂交技术, 用特异重复 DNA序列
作为探针进行原位杂交, 为研究相关类群之间的基
因组关系,鉴定体细胞杂种间的亲本基因组提供了
一种可选择的途径 [ 32 ]。 Schw arzacher等 [ 33]用非洲
黑麦 ( S ecale af ricanum ) 的基因组 DNA作探针, 与
杂种 ( Secale af ricanum !H ordeum chilense ) 的根尖
染色体杂交,发现有 7条大的染色体来自于非洲黑
麦, 另外 7条则来自于 H. ch ilense。同时, 还在间期
细胞核中发现不同来源的基因组在细胞核中不是随
机混合的,而是各自占据了一个确定的区域。U ozu
等 [ 34]以 O. aust raliensis特异重复序列 R IRE1作探
针,用荧光原位杂交技术对 O. sativa !O. aust ralien
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2010年第 10期 高猛等:植物染色体分带及其荧光原位杂交技术研究进展
sis的回交后代进行检测,十分清楚地区别出后代 25
条染色体中 12条来自 O. sativa, 13条来自 O. aust
raliensis。
其次,荧光原位杂交技术在同源和异源多倍体的
研究中得到很好地应用。多倍体物种在自然界广泛
存在,鉴别它们的供体基因组及外源染色体是亲缘关
系研究的重要方面。传统的染色体水平的研究是根
据核型和分带特征来推测不同物种之间的演化关系,
但是在一些时候,这些特征数据常常不稳定 [ 35] , 一些
属的植物之间核型较相似, 难以提供识别供体基因
组的有效依据,如菊属,而植物染色体的分带技术在
目前也没能做到像分析人类染色体带型那样稳定、
清楚。染色体原位杂交从理论上来说可以解决上述
问题。自 Schw arzacher[ 33]用 G ISH 的方法在杂种中
鉴别出供体基因组以后, 已在许多的作物及野生植
物中得到应用。燕麦 (Avena sativa ) 是一个典型的
异源多倍体种, 传统的核型分析和减数分裂染色体
配对行为的观察认为,它是由 AACCDD基因组组成。
A和 C分别来源于 A . strigosa和 A . ventricosa [ 36 ],剩
下的即为 D组,但不知来源于哪个二倍体种。分别
用 A . strigosa和 A . p ilosa的总 DNA作探针进行基
因组原位杂交,结果表明, A . p ilosa标记了 C组, A .
strigosa标记了 A和 D组, 进一步研究表明, A组和
D组的同源性要较 C组的高 [ 37]。亲缘关系研究中
还常根据杂种减数分裂时的染色体配对行为来判断
基因组的来源,但是当这种杂交由于某种原因而失
败时, 原位杂交就提供了一种有效的手段 [ 38]。M ili
um montianum ( 2n = 22) 是一个典型的二型核型
种,由 8条大的染色体 ( L- )和 14条较小的染色体
( S
-
) 组成。核型分析肯定了 S-的来源, 但无法确
定 L-是否来源于 M. vernale ( 2n = 8 ) 或其近缘种。
二倍体的 M. vernale无法和 M. montianum 杂交, 也
不能用减数分裂时染色体配对行为来分析 L-染色
体是否来源于M. vernale。当以M. vernale的总 DNA
为探针进行原位杂交,在 M. montianum 的根尖细胞
中发现所有的 L-染色体均显示了杂交信号, 而 S-
染色体没有信号,这就确定了异源四倍体种M. mon
tianum 的 L- 染色体来源于 M. vernale 或其近缘
种 [ 39]。在小麦属中, L iu等 [ 40]对不同的小麦类型和
普通小麦进行显带比较和原位杂交分析, 在其起源
和进化上也得到很好的分析结果。
2. 5. 2 基因定位 荧光原位杂交技术被广泛地应
用于植物特定的基因定位中。目前研究较多的是植
物基因组中核糖体基因 5S rDNA, 25S rDNA, 45S rD
NA等在染色体上的定位。马有志等 [ 41]以黑麦品种
Petkus的细胞核为模板,扩增了 45S rDNA基因中的
18S rDNA基因,并以其为探针, 采用荧光原位杂交
技术, 将 45S rDNA 基因定位在了染色体 1R的
1RS1. 3处附近 (即随体附近 )。廖进秋等 [ 42]以 45S
rDNA和 5S rDNA基因为探针对波兰小麦和矮兰麦
进行了荧光原位杂交分析, 结果表明, 高杆波兰小
麦、矮杆波兰小麦和矮兰麦的 45S rDNA基因位点
高度一致, 都在随体染色体短臂的核仁组织区
( NOR)显示出 4个位点, 5S rDNA基因在高杆波兰
小麦和矮兰麦染色体上表现一致, 都显示出 6个基
因位点,而在矮杆波兰小麦中显示出 8个,较前两种
多出 2个基因位点, 且独立于一对染色体短臂上。
王岚 [ 43]对诱导的多倍体新麦草进行原位杂交分析
发现,新麦草基因组中主要在 3对染色体上具有
45S rDNA位点,分别位于第 ∀、第 和第#染色体
短臂末端,初步推测是 NOR染色体。目前, 还分别
在火柴头 [ 44] (又称竹叶菜、饭包菜、兰姑草 )、苜
蓿 [ 9]、加州野生麦 [ 45]、百合 [ 46, 47]、沙田柚等 [ 48]植物
上实现了 45S rDNA基因的定位。另外, 对于一些
植物存在一定的如抗病,抗旱等良好的抗逆性状,这
些性状都是由其一定的抗性基因决定的。因此如能
够将这些特定的抗性基因进行定位分析,并将其提
取出来,再利用基因工程的手段对基因进行克隆杂
交, 从而可以在植物育种中有极大的帮助,使得得到
具有良好抗性的新的杂种后代成为可能。如今很多
抗性基因已经在许多植物中定位出来, 如王金平
等 [ 49]对小滨麦易位系小麦山农 0096进行抗条锈病
基因的定位研究, 将导入的抗条锈病基因定位在了
4A染色体上。钟筱波等 [ 50]用生物素标记的 Arabi
dop sis thaliana端粒重复序列探针 PatT4和地高辛标
记的番茄端粒联接重复序列 TGR1对番茄进行荧光
原位杂交,结果发现 PatP4探针杂交到所有番茄染
色体端粒上, TGR1只杂交在 24个端粒中的 20个
上,其中第 1、2、7条染色体的长臂和第 2条染色体
的断臂不含 TGR1序列。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
2. 5. 3 易位系鉴定 利用荧光原位杂交技术与分
带技术结合能够对于植物中的易位系做到更加全面
的鉴定,没有易位片段的长度的限制。石云素等 [ 51]
用 FISH技术检测了小麦背景中的 1B /1R易位。他
们以黑麦总基因组 DNA做探针, 检测了小黑麦 !普
通小麦的 3个衍生系 930553、930560、930612的黑
麦染色质,发现都有 1RS染色体臂与一小麦染色体
臂发生易位,且断点在着丝点附近。元增军等 [ 52]对
小麦和黑麦的易位系杂交后代 ( 1RS1RL与 6VS
6AL易位系杂交 )用 C分带和双色荧光原位杂交技
术进行了鉴定,在 F2中鉴定出小麦 - 黑麦 -簇毛麦
双重易位纯合体,且证实该易位系具有良好的细胞
学稳定性,从而得到了有正常育性,有良好的农艺性
和白粉病抗性的易位系。
2. 5. 4 转基因植物外源基因的检测 随着现代基
因工程技术的发展,转基因植物不断增多, F ISH技
术不仅能用于检测外源基因是否存在, 而且还能将
外源基因直接定位在染色体的相应位置并确定其拷
贝数, 同时也是转基因植株的遗传不稳定性、细胞基
因表达和调控机理的重要研究手段之一。金危危
等 [ 53]利用荧光原位杂交,在供试 8个转基因水稻株
系的染色体上检出了转入的外源基因 barnasepsI片
段,其中两株系各检出了两个不同的信号位点,而其
他株系均只检出一个信号位点,所有染色体着丝粒
区都没有杂交信号。结合 Southern杂交及表达分析
发现, 大多数株系中, 整合在染色体端部区的 bar
nasepsI基因表现为高水平表达, 而靠近着丝粒区
的则表现为低水平表达, 表明表达水平与转基因整
合位置可能一定程度的相关性,表达水平与拷贝数
无明显相关。 Jin等 [ 54]利用荧光原位杂交技术检测
并定位了转入水稻中的杀虫蛋白基因, 杂交信号分
散于距着丝粒 26. 2 - 95. 2之间。W ang等 [ 55 ]利用
该技术研究了转基因矮牵牛中 TDNA的插入位置,
发现 TDNA大部分整合在着丝粒远端常染色质区。
Pedersen等 [ 56 ]利用 F ISH技术找到了 TDNA在转基
因大麦、小麦和小黑麦染色体上优先整合的位点,整
合趋向于染色体的远端区。大量的 FISH 研究表
明,外源基因在染色体上的整合不是随机的,而是优
先整合到染色体的远端区。FISH技术特别是 F iber
FISH技术还可以显示转基因位点的结构 [ 57]。目前
的研究表明,小麦中外源基因可能有 3种插入形式,
分别为串联重复整合、串联重复拷贝之间夹杂着基
因组和单个转基因拷贝。有报道根癌农杆菌转化中
外源基因的插入位点数少,一般只有 1个,而基因枪
转化中可看到 1个以上的外源基因插入位点 [ 58]。
鉴于转基因植物的遗传不稳定性, 整合位点与其表
达有关,对于整合位点的确定对于稳定的表达具有
一定的意义。FISH技术在基因工程方面的应用结合
C分带技术,使得操作起来更加全面准确,因为在这
方面的要求比较高的灵敏度和精确度。Schw arzacher
等 ( 1992)在小麦中定位了外源染色体、染色体片段
和染色体的结构变异等。 Cuadrado等 ( 1996)采用
C分带原位杂交技术,成功地鉴定了小麦中黑麦基
因的遗传渗透。
2. 5. 5 染色体识别 在对许多植物的染色体核型
分析研究中,仅仅靠外部形态结构很难对各条染色
体进行精密的分析,尤其对于一些染色体外型比较
单一,而且非常细小的植物更是如此。随着染色体
分带技术和 F ISH的发展,利用 C分带和 FISH技术
相结合对染色体处理分析, 根据各条染色体的不同
带型,比较其数量和位置的差别, 能够较精确地对染
色体识别分析。在 G ill对小麦染色体显带研究的基
础上, R ayburn和 G ill[ 59]用生物素标记的 pAS1克隆
基因作探针,对小麦的 D组染色体进行了杂交鉴定,
从而将其与 A组和 B组染色体区别开来。次年又用
pSC119探针杂交得到了相同的结论。Snowdon等 [ 60]
在甘蓝的复合种油菜中,将 5S rDNA和 25S rDNA看
家基因家族原位杂交到了其染色体组上,并区分开
了其 19对染色体中的 10对。Robert等 [ 61]于 2006
年又将这两种看家基因家族定位到了多种芸薹属植
物的染色体上,从而针对这一属的植物核型不好分
析的特点,对染色体进行精确的识别。同年,王太霞
等 [ 62]以 5S rDNA和 25S rDNA为探针进行 FISH试
验, 区分了甘蓝 9对染色体中的 3对, 同时以 Co t1
(一个物种基因组中的高度重复序列及中度重复序
列的总称 ) DNA为探针进行 F ISH,二者结合对甘蓝
染色体进行了精确的核型分析。
2. 5. 6 绘制植物基因物理图谱 由于能利用杂交
信号精确地将基因序列定位在染色体上,明确特定
基因序列与染色体上端粒、着丝粒间的相互关系,荧
72
2010年第 10期 高猛等:植物染色体分带及其荧光原位杂交技术研究进展
光原位杂交技术已经被广泛地应用在植物基因物理
图谱的绘制中,尤其在高度重复基因位置的鉴定中,
DNA原位杂交技术具有特殊的价值, 因为这些重复
基因序列很难用其它方法来作图 [ 32]。 FISH物理作
图具有许多优势,它可以直接显示不同 DNA序列的
排列次序并测量它们之间的物理距离; 可提供不同
水平的空间分辨力;不需要特殊的细胞学材料,因而
可适用于许多物种;尤为突出的是,它能比较简便地
将连锁遗传图和物理图整合,构建植物基因组的分
子细胞遗传学图。 Cheng等 [ 63 ]采用水稻 10号染色
体上 18个 RFLP锚定的 BAC克隆,结合 rDNA和着
丝粒序列 pRCS2,对该染色体进行了粗线期 FISH物
理作图,并将物理图与该染色体的遗传图进行了完全
的整合。在高粱中, 采用多探针 FISH技术已绘制了
1、2和 8号染色体的分子细胞遗传学图谱 [ 64, 65]。此
外, 采用同样的作图策略对苜蓿 [ 66]、甘蓝 [ 67]和百脉
根 [ 68]进行了物理作图分析,并与遗传图进行了整合。
S tephens等 [ 69]采用高灵敏度的 TSA ( tyram ine signal
amp lificat ion) FISH技术, 直接对大麦的 RFLP ( cD
NA克隆 )进行了物理作图尝试, 显示这种技术可以
作为大基因组 FISH 物理作图的一种可选择的方法。
C lark等 [ 70]用荧光原位杂交的方法在大麦第 5号染
色体上制作出 B醇融蛋白位点的物理图谱。
参 考 文 献
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∃中国生物工程杂志 %征稿
国家一级学会 & & & 中国生物工程学会会刊 ∃中国生物工程杂志 % ( CH INA B IOTECHNOLOGY )创刊于
1976年, 是科技部中国生物技术发展中心、中国生物工程学会和中国科学院文献情报中心主办的国家级生
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