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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
一种简易高效的小麦叶片胞间液蛋白提取方法的建立
白婷1，2 张朝晖2 严伟1 徐世昌3 潘映红2
(1四川师范大学生命科学学院，成都 610066;2中国农业科学院作物科学研究所 国家农作物基因资源与
基因改良重大科学工程，北京 100081;3中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)
摘 要: 植物细胞间液中的蛋白在植物生长发育和抗病抗逆反应及其信号传导过程中发挥着重要作用，是植物学研究
的新热点。由于细胞间液含量低，容易因组织细胞损伤性受到胞内成分污染，高纯度的细胞间液蛋白的提取相对困难，参考
相关文献报道，建立了一种简易高效的小麦叶片细胞间液蛋白的提取方法。选取小麦品种“铭贤 169”幼苗叶片为材料，用 50
mmol /L NaAc缓冲液充分浸润，负压处理 20 min后，30 × g离心 5 min除去叶片表面缓冲液，随后 2 000 × g离心 15 min，收集小
麦叶片胞间液。将获得的小麦叶片胞间液冷冻干燥后，进行 SDS-PAGE分离分析。电泳胶图上显示出细胞间液提取物与叶片
组织提取物的蛋白质组成有极显著差异，使用 MALD-TOF /TOF MS技术分析 SDS胶上的细胞间液蛋白条带，共鉴定到 9 种非
高丰度或假定的蛋白，其中有两种是已报道过的植物细胞间液蛋白。试验结果表明，本方法简易高效，适用于小麦蛋白质组
学研究中高纯度的细胞间液蛋白的提取。
关键词: 细胞间液 小麦叶片 蛋白质 蛋白质组学 提取
Development of a Simple Method for Efficient Extraction of
Intercellular Fluid Proteins from Wheat Leaves
Bai Ting1，2 Zhang Zhaohui2 Yan Wei1 Xu Shichang3 Pan Yinghong2
(1College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610066;2The National Key Facility for Crop Gene Resources and
Genetic Improvement，Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081;
3The Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193)
Abstract: It has been recognized that the proteins of plant intercellular fluid play important roles in the process of growth，disease
resistant，degeneration resistant and signal transduction． However，it is not easy to extract these proteins for proteomics research，because
of the low abundance of intercellular fluid proteins and the difference of separation of intercellular fluid proteins from plant tissue． Refer-
encing previous reports，we developed a simple method for efficient extraction of proteins from wheat leaf intercellular fluid． With wheat
variety“Mingxian 169”as the material，young leaves were completely soaked in 50 mmol /L NaAc buffer and then vacuumed for 20
min． After that the buffer was removed by centrifugation at 30 × g for 5 min，and the intercellular fluid was collected by centrifugation at
2 000 × g for 15 min． Finally，the proteins were obtained by ultrafiltrating or freeze drying the intercellular fluid． SDS-PAGE was used to
detect and separate proteins extracted from wheat leaf intercellular fluid． Observed on electrophoresis gel，intercellular fluid proteins
were significantly different with total proteins extracted from wheat leaves． We divided the intercellular fluid proteins into 45 slim straps，
and detected them by MALDI-TOF /TOF MS． With this method，9 proteins were identified． Among the identified proteins，two have been
reported as plant extracellular proteins． The results indicated that the method is suitable for extracting intercellular fluid in proteomics
research．
Key words: Intercellular fluid Wheat leaf Protein Proteomics Extraction
收稿日期:2010-05-11
基金项目:国家自然科学基金项目(30971874) ，国家“863”高技术研究发展计划项目(2008AA10Z115) ，转基因生物新品种培育科技重大专项
(2009ZX08012-011B)
作者简介:白婷，女，硕士研究生，研究方向:蛋白质组学;E-mail:baiting134@ yahoo． com． cn
通讯作者:潘映红，男，研究员，E-mail:pyh51@ yahoo． com． cn
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
植物细胞间液简称胞间液，是指细胞之间的液
体物质［1］，其中包含的多种生化物质，对生化反应
途径或植物生长发育有重要作用［2 － 6］。目前，对植
物胞间液的研究主要集中在激发子、肽酶、凝集素等
几个方面。
普遍存在于胞间液中的激发子在植物生长发育
中具有重要作用。作为寄主与病原相互识别的最初
信号分子，病原菌的信号分子激发子在胞间液中启
动植物级联信号系统，调控防卫基因表达，表现出植
物的抗病性［7］。因此，激发子的各种性质对于研究
病原与寄主相互识别以及防卫基因的表达调控等分
子机制有重大意义。富集于植物胞间液中的肽酶影
响着细胞外源蛋白在胞外的聚集。当病原体侵入植
株或受到某种环境压力时，胞外肽酶就成为了植物
防卫反应所必须的生化物质，它们还参与在细胞膨
胀、程序性死亡、衰老、受伤和发育时的细胞壁重
建［8］。植物凝集素是分泌蛋白，不仅存在于植物种
子中，也存在于植物液泡和胞间液中［9］。Fik 等［10］
从白屈菜叶片及根提取胞间液，并纯化出凝集素，进
一步分析了凝集素与脱氧核糖核酸酶之间的关联
性，并发现二者在组成上相似。
我们力求建立一种简易高效的方法，提取产生
防卫反应的植株的胞间液，以获取其病菌激发子。
目前，国内外常用提取方法是负压处理叶片后离心
收集细胞间液［2 － 4，8，11 － 15］。本研究在众多方法的基
础上进行改良，通过对叶片处理方法、缓冲液类型、
真空度、离心力等参数条件的优化，旨在摸索出一种
简易高效的胞间液提取方法。
1 材料和方法
1. 1 材料
小麦品种铭贤 169，由中国农业科学院植物保
护研究所条锈病组提供。小麦种子经浸种、催芽后
温室培养，温度为昼 15 － 18℃ /夜 11 － 14℃，光照强
度 6 000 Lx，光照时间 14 h。
1. 2 方法
1. 2. 1 胞间液提取方法 取 1 叶期的小麦幼苗植
株，去除叶尖，将叶片切成 4 cm左右的小段，分别用
去离子水和缓冲液清洗叶片表面和切口两遍，然后
扎成小束。将叶片束全部浸入缓冲液中，抽真空至
叶片呈暗绿色水浸状。取出叶片束，静置滤去缓冲
液，再将其直立放置于 50 mL 离心瓶，使用 SW-24
型转子离子(除非特别指明，本研究离心获取叶片
胞间液时均使用落地式离心机 Sorvall Evolution RC
和 SW-24 型转子)离心除尽附着于叶片表面的缓冲
液。最后，以较高转速离心获得胞间液。将收集到
的胞间液分批加入到 0. 45 μm 超滤管中，使用台式
超速离心机 Sorvall Biofuge Primor，4 000 × g 离心去
除杂质，收集透过滤膜的含蛋白液体，冷冻干燥后
－ 20℃保存备用。
1. 2. 2 全蛋白提取 称取 2 g 一叶期的小麦叶片，
置于预冷的研钵中，加入液氮将其研磨成细粉后，加
入 3 － 5 倍的超纯水或乙酸钠缓冲液，4℃静置 2 h，
然后 40 000 × g离心 30 min，上清即为全蛋白粗品，
冷冻干燥后 － 20℃保存备用。
1. 2. 3 SDS-PAGE分离分析 选用美国 Bio-Rad 公
司 mini 垂直蛋白电泳仪分离蛋白质:配制 4%浓缩
胶和 12%的分离胶，以全蛋白样品为对照检测胞间
液提取物。蛋白质定量采用 Bradford 方法。上样量
为每孔 10 － 15 μg 蛋白，80 V 恒压运行 20 min 后，
再以 100 V 恒压运行约 40 min 至溴酚蓝指示剂移
出凝胶。凝胶以 40%乙醇、10%乙酸固定 40 min，
10%乙酸放大 30 min，考马斯亮蓝 R350 染色 1 h，
10%乙酸脱色 3 h。
1. 2. 4 胶内酶切与质谱分析 将 SDS-PAGE 分离
到的小麦叶片胞间液蛋白条带用干净刀片切下，再
分别将各蛋白质条带切成约 1 mm3的小颗粒，转入
离心管内，以超纯水洗涤两次，加入 25 mmol /L碳酸
氢铵和乙腈混合溶液约 100 μL (以 50 mmol /L碳酸
氢铵溶液和纯乙腈配制，50 ∶ 50) ，置于室温使凝胶
脱色大约 30 min。根据胶粒脱色情况，重复洗 1 － 2
次，至胶粒无色透明，除去液体，用 100%乙腈使胶
粒脱水至呈白色。除去乙腈，将离心管置于真空离
心旋转蒸发仪内，运行至胶粒完全干燥。加入
10 μL 浓度为 20 ng /μL的胰蛋白酶浸泡胶粒，在冰
浴下吸胀 40 min，然后加入 10 μL 的 25 mmol /L 碳
酸氢铵溶液于 37℃孵育过夜。酶切完毕后，吸取上
清液并转移至离心管内。每块胶内加入 2 μL 1%三
氟乙酸 /50%乙腈，常温下放置 10 min，将吸出的上
清与前一次的提取液合并、冷冻干燥［16］。用 10 μL
0. 1%的 TFA 充分溶解肽段，最后以 0. 6 μL 50%乙
441
2011 年第 7 期 白婷等:一种简易高效的小麦叶片胞间液蛋白提取方法的建立
腈 /0. 1% TFA 将肽段点到靶上。样品晾干后取 0. 6
μL 的饱和基质溶液覆盖在样品上，然后利用 au-
toflex型 TOF-TOF 生物质谱仪进行分析。质谱数据
通过 MASCOT 软件在 NCBInr 数据库进行搜索。
2 结果与分析
2. 1 浸提液的筛选
选用不同缓冲液浸没小麦叶片，负压处理 20
min，30 × g离心 15 min，收集 2 000 × g 离心 15 min
后得到的胞间液，完成蛋白提纯处理后等体积溶解，
最后用于 SDS-PAGE进行比较分析(图 1)。常用的
植物蛋白质提取液磷酸盐缓冲液在提取小麦叶片胞
间液蛋白时得率较低(图 1，泳道 4) ，可能与此条件
下酚类氧化有关，加入 PVPP后得率明显提高，但获
得蛋白的总量和条带数仍不是最多(图 1，泳道 5)。
使用超纯水和生理盐水作浸提液均能获得较多的胞
间液蛋白，但总体上一些条带呈弥散状，说明蛋白纯
度不够或存在干扰物(图 1，泳道 2 和 8) ，在这两种
浸提液中加入 PVPP 后蛋白得率降低(图 1，泳道 3
和 9) ，可能与蛋白质随酚类物质被 PVPP 吸附有
关。使用 50 mmol /L醋酸钠作浸提缓冲液提取的样
品的电泳条带最多且最为清晰(图 1，泳道 6) ，加入
PVPP后蛋白得率和条带数无显著改变(图 1，泳道
7) ，故在随后的试验中，直接选择 50 mmol /L醋酸钠
作为提取小麦叶片胞间液蛋白的浸提液。
1．超纯水提取的小麦叶片全蛋白;2． 超纯水;3． 含 1%
PVPP的超纯水;4． 50 mmol /L磷酸盐;5．含 1% PVPP 的
50 mmol /L磷酸盐;6． 50 mmol /L 醋酸钠;7．含 1% PVPP
的 50 mmol /L 醋酸钠;8． 0. 9% NaCl;9． 含 1% PVPP 的
0. 9%NaCl
图 1 使用不同浸提液提取的小麦叶片
胞间液蛋白的 SDS电泳图
2. 2 胞间液提取参数的选择
在制备植物叶片胞间液蛋白时，通常采用负压
处理叶片后离心收集细胞间洗脱液的方法，但对提
取参数的选择一直缺乏明确的报道。除了使用适宜
的浸提液，施加负压的大小和时间，以及离心力的大
小对获得高得率和高纯度的细胞间液蛋白有显著的
影响。我们使用过多种不同类型的真空泵进行负压
处理，发现很难控制负压大小，容易导致细胞破裂或
难以将浸提液压入叶片胞间，无法获得高得率和高
纯度的细胞间液蛋白(结果未显示)。使用 LABCON-
CO公司的真空浓缩仪(CentriVap Mobile System)抽
真空约 20 min，可使多数小麦幼苗叶片呈暗绿色水
浸状，表明浸提液已被压入胞间，进一步分析提取出
的蛋白质，在 SDS-PAGE 胶上未检测到小麦叶片全
蛋白的标志条带(图 1，图 2) ，说明这种负压处理方
法具有较好的适用性。在正式离心获取胞间洗脱液
前，进行一次低速离心处理，一方面去除叶面多余的
浸提液和叶片切口处破损细胞释放出的胞内蛋白，
提高胞间洗脱液的蛋白浓度和纯度，同时也可以去
除胞间洗脱液中的一类高丰度蛋白(结果未显示)。
使用不同离心力获得的小麦胞间液蛋白的 SDS-
PAGE分析结果(图 2，泳道 2)显示，可以使用较高
的离心力制备小麦叶片胞间蛋白，如 4 000 × g 离心
15 min。当对负压处理后的叶片先进行 30 × g 离心
时，获得的离心液较多但蛋白种类极少，主要得到的
是一类高丰度的胞间蛋白(图 2，泳道 3)。对 30 × g
离心过的叶片顺序使用 500 × g 和 1 000 × g 离心，
均可得到一定量的胞间蛋白(图 2，泳道 4 和 5)。当
直接进行 2 000 × g离心处理时，可获得较多的胞间
蛋白(图 2，泳道 6) ，对 2 000 × g离心处理过的叶片
进一步进行 3 000 × g离心时，得到的蛋白总量较少
且种类并无极显著的差异(图 2，泳道 7)。这些结
果说明小麦幼苗叶片以 50 mmol /L醋酸钠作为浸提
液，用实验室常规的真空浓缩仪负压处理 20 min
后，2 000 × g 离心 15 min 即可获得较完整的胞间液
蛋白。
2. 3 胞间液蛋白的大量制备和 SDS-PAGE分离
大量制备小麦叶片胞间液蛋白样品时，采用 50
mmol /L醋酸钠作为浸提液，负压处理 20 min，(30 －
50)× g预离心 15 min，最后 2 000 × g 离心 15 min 制
备胞间洗脱液。将离心收集到的胞间洗脱液用 0. 45
μm超滤管离心处理(或用超滤膜包过滤)时，会损失
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
一些蛋白，但可去除部分干扰下一步分离的杂质，提
高电泳分离的分辨率(图 3)。在本试验中，上样量到
达 20 μg时，小麦叶片胞间液蛋白在 SDS-PAGE胶上
仍具有足够的分离度，可按顺序将电泳分离的蛋白分
切成 45条细胶带用于后续分析(图 3)。
1． 50 mmol /L醋酸钠提取的小麦叶片全蛋白;2 － 5． 50
mmol /L醋酸钠为浸提液，常规的旋转蒸发仪抽真空 20
min，分别使用不同离心力制备的胞间洗脱液蛋白，其
中，2． 4 000 × g 离心 15 min;3． 30 × g 离心 15 min;
4． 500 × g离心 15 min;5． 1 000 × g离心 15 min;6． 2 000 × g
离心 15 min;7． 3 000 × g离心 15 min
图 2 使用不同离心力获得的小麦胞
间液蛋白的 SDS电泳图
负压处理小麦叶片 20 min，2 000 × g 离心 15 min，冻干
后进行 SDS-PAGE 分离，共切出 45 条细胶带供后续分
析;1．上样量 10 g;2，3．上样量均 20 g
图 3 胞间液 SDS电泳图
2. 4 TOF-TOF质谱鉴定差异蛋白条带
将 SDS-PAGE分离的小麦叶片胞间液蛋白分切成
45 条带，分别用胰蛋白酶酶切后，采用 MALDI-TOF/
TOF二级质谱进行检测和数据库检索。鉴定到的蛋白
多数与植物叶片中高丰度的 1，5-二磷酸核酮糖羧化
酶 /加氧酶(rubisco)相关，或者属于一些假定蛋白或未
知蛋白(结果未显示)，准确鉴定到的 9种非高丰度或
假定的蛋白见表 1，其中 oxalate oxidase GF-2. 8 precur-
sor 和 pathogenesis-related protein为已报道定位于胞间
的蛋白，而某些蛋白在不同条带中被同时检测到。
表 1 胞间液蛋白条带鉴定结果
Strap Score Nominalmass Name Molecular function Cellular component
30 47 23711 oxalate oxidase GF-2. 8 precursor oxidoreductase activity;
nutrient reservoir activity
extracellular region;cell wall
39 182 19130 pathogenesis-related protein — extracellular region
32 68 33327 chlorophyllase chlorophyllase activity
intracellular membrane-bounded or-
ganelle
8 48 82912 alpha-L-arabinofura -nosidase /be-
ta-D-xylosidase isoenzyme ARA-I
hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl
compounds
—
9 67 72524 arabinoxylan arabinofuranohydro-
lase isoenzyme AXAH-II
hydrolase activity
—
23 289 35421 beta-1，3-glucanase
catalytic activity;hydrolase activity，h
—
28 121
29 101
26898 chitinase chitinaseactivity;hydrolase activity;act-
ing on glycosyl bonds
—
27 46
28 147
27458 chitinase 1
chitinase activity —
24 173
25 230
26 155
33438 peroxidase 4 peroxidase activity;iron ion binding cal-
cium ion binding electron carrier activi-
ty;oxidoreductase activity
—
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2011 年第 7 期 白婷等:一种简易高效的小麦叶片胞间液蛋白提取方法的建立
3 讨论
采用 50 mmol /L醋酸钠作为浸提液，负压处理
20 min，30 × g预离心 15 min，最后 2 000 × g离心 15
min分离出小麦叶片细胞间洗脱液，再进行超滤处
理去除干扰杂质后，即可获得小麦叶片胞间液蛋白。
通过 SDS-PAGE比较分析，可以确定小麦叶片胞间
液蛋白得率相对较高，且与小麦叶片全蛋白有明显
差异，表明本研究建立的小麦叶片胞间液蛋白提取
方法是简易高效的。MALDI-TOF /TOF 质谱分析仅
准确鉴定到的 9 种非高丰度或假定的蛋白，其余鉴
定到的蛋白多数与植物叶片中高丰度的 1，5-二磷
酸核酮糖羧化酶 /加氧酶(rubisco)相关，或者属于
一些假定蛋白或未知蛋白，提示小麦叶片胞间液蛋
白组成可能较为复杂，利用 SDS-PAGE 分离和现有
的数据库无法实现的快速质谱鉴定，有必要对胞间
液蛋白进行进一步的分离，如双向电泳分离和多维
色谱分离，并结合质谱测序和同源比对推测未知蛋
白的种类和功能。在已鉴定出的蛋白中，oxalate ox-
idase GF-2. 8 precursor 和 pathogenesis-related protein
为已报道过的定位于细胞间隙的蛋白，直接证明了
本研究的胞间液蛋白提取方法的有效性。这两种蛋
白分布在胞间液蛋白中的第 30 条带与 39 条带中，
可能与蛋白质的降价、修饰或高度同源性有关。本
研究工作为进一步开展深入的细胞间液蛋白质组学
研究提供了有价值的技术和线索。
参 考 文 献
［1］郭泽建，蒋冬花．植物病原菌激发子与信号识别机理．浙江大学
学报，2003，26(1) :1-7．
［2］Heitz T，Geoffroy P，Fritig B，et al． Two apoplastic alpha-amylases are
induced in tobacco by virus infection． Plant Physiol，1991，97 (2) :
651-656．
［3］ Kukavica B，Vucinic Z，Vuletic M． Superoxide dismutase，peroxi-
dase，and germin-like protein activity in plasma membranes and ap-
oplast of maize roots． Protoplasma，2005，226(3-4) :191-197．
［4］Maki H，Shigeki I，Eiji Y． Extracellular Trypsin-like proteases pro-
duced by Cordyceps militaris． Journal of Bioscience and Bioengineer-
ing，2005，100(6) :631-636．
［5］张志刚，邱德文，杨秀芬，等．极细链格孢蛋白激发子诱导棉花抗
病性及相关酶的变化．中国生物防治，2007，23(3) :292-294
［6］Ebel J，Cosio EG． Elicitors of plant defense responses． Int Rev Cytol，
1994，148:1-36．
［7］刘梅芳，朱晓程，肖华山．植物激发子及其信号传导之研究进展．
中国农学通报，2008，24(3) :215-220．
［8］Delannoy M，Alves G，Vertommen D． Identification of peptidases in
Nicotiana tabacum leaf intercellular fluid． Proteomics，2008，8(11) :
2285-2298．
［9］Lis H，Sharon N． Lectins in higher plants:in biochemistry of plants．
Proteins and Nucleic Acids，1981，6:371-466．
［10］Fik E，Dalgalarrondo M，Haertlé T，et al． Comparative biochemical
analysis of lectin and nuclease from Chelidonium majus L． Acta Bio-
chimical Polonica，2000，47(2) :413-420．
［11］Nelson CS，Rita F，Ca^ndido PR． Proteomics of ionically bound and
soluble extracellular proteins in Medicago truncatula leaves． Pro-
teomics，2007，7(12) :2070-2082．
［12］ Holden DW，Rohringer R． Proteins in intercellular washing fluid
from noninoculated and rust-affected leaves of wheat and barley．
Plant Physiol，1985，78:715-723．
［13］马云鹏，韩胜芳，陈琰，等．叶锈菌侵染的小麦细胞间隙液中激
发子的分离纯化．中国农业科学，2008，41(10) :3070-3076．
［14］王庆梅，王智圻，刘娟，等．感染叶锈菌的小麦细胞间隙液中激发
子的定性及初步分离．植物生理学报，2000，26(5) :427-432．
［15］徐建强，侯颖，曹远银，等．小麦秆锈病细胞间隙液的提取及注
射技术研究．西北农业学报，2006，15(2) :66-68．
［16］温福平．盐胁迫与赤霉素(GA3)处理下水稻幼苗的蛋白质组学
分析［D］．杨凌:西北农林科技大学，2009．
(责任编辑 李楠)
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