全 文 ：收稿日期:2007-10-17
作者简介:陈冬(1981-),男,在读硕士,专业方向:动物遗传育种;E-mail:1199cdzy@163.com
通讯作者:吴登俊(1956-),男,教授,博士生导师,研究方向:动物分子遗传育种;Tel:0835-2885848;E-mail:wdengjun@sicau.edu.cn
前言
单核苷酸多态性(SNP),是指基因组 DNA中某
一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失
等变化,而且任何一种等位基因在群体中的频率不
小于 1%。通常认为 SNP只有两种类型,即双等位
基因(bialelic)。继限制性片段长度多态性(RFLP)
和微卫星多态性(microsatelitepolymorphism)这两
种遗传标记之后,成为第三代分子标记。据估计,大
约有 10亿个 SNP分子标记将被用于基因功能及与
疾病的相关性的关联研究 [1]。这么大的分析量,因
此对检测技术提出了极高的要求。
各种 SNP的检测方法区别很大,每种 SNP的
检测方法都可将之看成由两部分组成即区分 SNP
特异位点的原理方法和数据的检测分析手段。侧重
介绍了几种新出现的 SNP检测技术的原理,并对
SNP高通量检测技术的发展进行了展望。
1 SNP检测技术的原理
SNP检测技术发展很快,出现了许多 SNP检测
技术。大致基于以下 9种基本原理:(1)以构象为基
础;(2)基于 PCR;(3)RT-PCR;(4)等位基因特异性
杂交;(5)内切酶酶切技术;(6)引物延伸法;(7)寡
核苷酸连接反应;(8)基于光谱和电子信号技术;
(9)基于物理技术。
1.1 以构象为基础
这类方法是基于 SNP位点引入 DNA分子后引
起其构象的改变或者 Tm值的不同,从而表现在电
泳迁移率的不同或者和色柱的亲和力不同,而将突
变体检测出来。其主要有单链构象多态性(SSCP),
温度梯度凝胶电泳(TGGE),变性高效液相色谱分
析技术(DHPLC)。其中变性高效液相色谱分析技术
它是在 SSCP和 DGGE基础上发展起来的,具有半
自动化、快速、检出率高等特点,是一种新的高通
量、自动化筛查 SNPs的有效方法[2]。
1.2 以 PCR为基础
1.2.1 等位基因特异 PCR (AS-PCR) 根据 PCR
过程中要求引物和模板之间的严格互补配对来实
单核苷酸多态性检测方法的研究进展
陈冬 吴登俊
(四川农业大学研究生院,雅安 625014)
摘 要: 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为第三代遗传标记已经广泛应用于基因作
图、疾病相关性分析、群体遗传学及药物研究等领域。因此建立高度自动化和高通量的SNP检测分析技术十分重要。简要
介绍了国内外几种主要SNP检测技术的原理和检测分析手段,并对SNP高通量检测技术的发展进行了展望。
关键词: 畜牧、动物遗传与育种 单核苷酸多态性
ApproachesforSNPGenotyping
ChenDong WuDengjun
(AnimalDepartmentofSichuanAgricultureuniversity,Ya’an625014)
Abstract: AsthethirdgenerationofgeneticmarkersSNPs(singlenucleotidepolymorphisms)hasbeenusedextentivelyin
genemapping,disease-corelativityanalysis,populationgeneticsanddrugresearch.Consequently,arobust,flexibleandlow-cost
techniqueforSNPtypingisesentialtoanalyzealargenumberofSNPs.Herearesomemethodsfordectionreviewed.Moreover,
thewaytothehigh-throughputgenotypinginthefuturewasbrieflydiscused.
Keywords: Husbandy、animalgeneticsandbreeding Singlenucleotidepolymorphism
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
现对 SNP位点的检测。根据 SNP位点设计特异引
物,其中一条链(特异链)的 3末端与 SNP位点的
碱基互补(或相同),另外一条链(普通链)按照常规
的方法进行设计,用凝胶电泳就能够很容易地分辨
出扩增产物的有无,从而确定基因型的 SNP(图 1)
1.2.2 四引物扩增受阻突变体系 PCR技术(ARMS-
PCR) 在等位基因特异 PCR的基础上进行了改
进,针对 1个 SNP位点设计 2个延伸方向相反的
内侧引物和 2个外侧引物,用这 4个引物在一个
PCR反应中进行扩增。针对不同的已知突变,设计
适当的引物,可以通过 PCR方法和电泳图谱直接
达到区分突变性和野生性的目的。如图 1所示,其
中所增加的外引物实际上起到阳性对照引物的作
用,它可以有效地降低非特异性 PCR产物的扩增
和引物二聚体的形成[3]。
1.3 实时荧光 PCR技术(RT-PCR)
是一种通过检测 PCR过程中和 PCR之后产生
的荧光信号来区分等位基因类型的 SNP检测技
术,同时基于荧光能量转移原理(FRET)。每检测一
个 SNP位点需要一条探针,其 3端连有淬灭剂基
团,5端连有荧光剂基团,最终与 SNP位点完全匹
配时探针结构被破坏,从而发出荧光而被检测。其
主要包括 TaqMan探针技术,分子信标技术,Scorpion
探针。其中Scorpion探针的 3端通过一段称为 PCR
stopper(orPCRblocker)的寡核苷酸和 PCR引物的
5端相连结而构成,其作用是在 PCR过程中阻止
对探针部分的扩增,避免环状探针部分在无待检测
片段是通过扩增被打开而产生错误的荧光信号。确
保准确分型的难点在于探针的设计。
1.4 等位基因特异性杂交 (Alelespecifichybridization,
ASH)
是根据核苷酸探针和互补的目的片段进行杂
交是完全匹配和有错配两种情况下杂交复合体稳
定性的不同而将 SNP位点检测出来。包括了等位
基因特异核苷酸片段分析(ASO)、基因芯片和动态
等位基因特异性杂交(DASH)等。
1.4.1 基因芯片技术(Genechips) 基因芯片的基
本原理是利用寡核苷酸与不同靶序列变异配对的
杂交稳定性的差异,将微电子芯片制造技术与杂交
荧光显色技术相结合,在一小块硅片上高密度地集
成上万乃至更多的探针形成多重寡核苷酸微阵列,
通过与目的 DNA的杂交显色等方法检测 SNP[4]。
1.4.2 动态等位基因特异性杂交 (Dynamicalele
specifichybridization,DASH) 其原理是首先将标
记有荧光染料的探针与目标序列配对,当达到变性
温度时,荧光强度迅速减弱;存在错配碱基的互补
双链的变性温度低于不含错配碱基的双链;通过测
定互补双链的变性温度可以判断互补双链中是否
含有错配碱基。
1.5 内切酶酶切技术(Endonucleasedigestion)
基于此技术的SNP检测技术有RFLP、随机扩增
多态性 DNA(RAPD)、引物入侵分析技术(Invader
assay)和 UCAN等。RFLP和 RAPD是两种比较成
熟的技术,已经有很多相关介绍。
1.5.1 引物入侵技术 (Invaderassay) 基本原理
(图 2)是每一反应体系包括一对等位基因特异性
探针和一条位于待测 SNP位点上游的入侵探针纵
向杂交到 DNA是特异区域。如果等位基因特异性
探针与目标序列完全互补,则与入侵探针的 3端
在 SNP位点处重叠,靶特异切割酶就能识别这种
三级结构(精确入侵结构)并切除 5端,被切除的
尾序列带有荧光标记,它又可以作为入侵探针参加
下一轮反应,最后,通过检测荧光信号来区分等位
基因的类型[5]。
图 1 等位基因特异性 PCR原理图
图 2 引物入侵分析技术原理图
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2008年第2期
1.5.2 UCAN 用插入一段 RNA的 DNA作为聚合
酶反应的引物,引物的 3末端被化学基团封阻,此
反应中用到了 RNaseH。在进行 SNP检测时,若靶
DNA和引物中的 RNA完全配对匹配,RNaseH消
化引物 RNA部分而去除封阻的 3末端,使 DNA聚
合酶的延伸反应得以进行。根据延伸反应的进行与
否就可以实现对 SNP的检测。
1.6 引物延伸(Primerextension)
通过加入不同类型的 dNTP或 ddNTP进行延
伸反应,根据延伸反应的信号来确定 SNP的类型,
主要有单碱基延伸技术 (SBE)和焦测序技术
(Pyrosequencing),等位基因特异性延伸等。
1.6.1 单碱基延伸技术又称为微测序(Minisequen-
cing) 其原理 (图 3)是设计一条引物位于待测
SNP位点的上游,该引物的 3端距离 SNP位点一
个碱基,加入不同荧光标记的 ddNTPs进行反应,只
有当加入的 ddNTP与 SNP位点碱基互补时,引物
才得以延伸,通过检测延伸碱基所发出的荧光来判
断 SNP的类型。
1.6.2 焦测序技术 (pyrosequencing) 是一种基于
生物发光分析法测定焦磷酸(PPi)的测序技术[6]。其
基本原理 (图 4)是引物与模板 DNA退火后,在
DNA聚合酶 (polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶
(ATPsulfurylase)、萤光素(luciferase)和三磷酸腺苷
双磷酸酶(apyrase)4种酶的协同作用下,依次加入
4种不同的脱氧核糖核苷酸(dNTPs),完成循环测
序反应。在进行下一轮延伸之前,需要加入三磷酸
酰苷双磷酸酶将未结合的 dNTPs和 ATP降解。基
于该技术的分析系统自动化程度高,通量大,速度
快,易于建立标准化操作,适合大规模 SNP研究及
分子诊断[7]。
1.7 寡核苷酸连接分析 (Oligonucleotideligation
asay,OLA)
OLA技术是通过两步来完成的[8],先用 PCR技
术进行扩增,再将 PCR产物变性为单链;然后加入
两条互补于待测 SNP位点一侧序列的等位基因特
异性探针和一条互补于待测 SNP位点另一侧序列
的公共探针;在 DNA连接酶的作用下,与目标
DNA单链完全互补的等位基因特异性探针和公共
探针发生连接反应。连接产物变性后作为探针的模
板进入下一个循环。
1.7.1 联合链式反应(combinedchainreaction,CCR)
这是一种利用 DNA聚合酶和 DNA连接酶两种酶
进行 DNA扩增反应的检测方法[9]。CCR反应分为 4
步:(1)DNA模板的变性;(2)引物和单链模板间的
退火;(3)DNA聚合酶催化引物延伸。(4)延伸引物
的 3端和下游引物的 5端间的连接。如果检测引
物的 5端和模板间没有完全匹配的话,延伸的外
侧引物就不能和检测引物连接起来,因而不能形成
全长的片段,从而实现对 SNP位点的检测。
1.7.2 滚环扩增 (Rolingcircleamplification,RCA)
技术 与OLA技术相结合可以进行 SNP检测,该技
术(图5)采用一对等位基因特异性开环探针(OCP)和
两条引物(RCA引物 I和 RCA引物Ⅱ)进行指数扩
增。反应过程主要包括两步,即在连接酶的作用下,
与目标序列完全互补的 OCP的 5端和 3端发生
连接反应,形成闭环 DNA序列;然后,RCA引物 I
和Ⅱ分别与闭环 DNA序列退火,并在 DNA聚合酶
的作用下进行等温延伸反应,进行指数扩增。在
RCA引物 I的两端分别标记荧光剂和淬灭剂,当它
与 OCP形成双链时,荧光剂与淬灭剂分开,释放荧
光而被检测[10]。
图 3 单碱基延伸原理
图 4 焦测序技术原理图
陈冬等:单核苷酸多态性检测方法的研究进展 95
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
1.8基于光谱和电子信号技术
现在应用最多的是质谱法(MALDI-TOF),其将
变性的单链 PCR产物通过与硅芯片上的化合物
SIAB共价结合后。在硅芯片上进行引物的退火、延
伸反应、突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不
相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的
不同质量在质谱仪上显示不同峰。将碱基进行一定
的修饰,可进一步提高敏感性[11,12]。
1.9基于物理技术
1.9.1 毛细管电泳技术 (capilaryelectrophoresis,
CE) 泛指在散热效率高的 20~100um的毛细管
内,在筛分机制(有或者无凝胶)和高强度电场的双
重作用下,DNA片段因离子表面积和分子外形的
变异导致的迁移率时间不同而检测 SNP。主要流程
是:PCR扩增目的片段-纯化-回收-4种荧光标记
(dNTP)测序反应-过柱去除多余的荧光和引物-测
序仪上电泳并用测序软件分析。可以直接测序检测
SNP突变类型及其位置,效率达到 100%。
1.9.2 原子探针显微镜测序 STM采用导电探针
扫描样品表面,分子之间形成的隧道电流通过可连
续移动的探头确定样品三维图像。AFM是通过测
量探针和 DNA样品表面间的作用力来确定分子表
面形状,不要求样品导电。原子探针显微镜具有直
接观测 DNA序列的能力,是一种新的高速测序方
法,但目前仍处于探索阶段[13]。
1.9.3 纳米探针电路检测 两个固定的微电极对
有 20μm间隙,有一短的“捕获”寡核苷酸的链和长
“捕获”寡核苷酸的链,目标寡核苷酸接触识别与其
互补的粘附于纳米金电极的寡核苷酸链识别元件
上,目标 DNA与捕获探针互补配对形成“三明治”
式杂交,溶液中有银和氢化醌,聚集到纳米金周围,
能发出可测量的电信号,这一系统以传统硅片上微
电极为基础,原则上可大量地同时检测分析,是一
种可视的、新的高通量 SNP分型法[14,15]。
2 检测分析技术
为了实现特异性 SNP检测,荧光共振能量转移
和荧光偏振是常用的两种信号指示系统,被多种检
测平台成功利用。除了荧光检测平台以外,凝胶电
泳、荧光检测、DNA芯片和质谱仪也被广泛用于
SNP的检测。值得一提的是在基因芯片的研究中,美
国 Nanogene公司研制了 Nanochip电子微阵列[16,17],
使数小时的杂交反应缩短到 20~30s秒钟,另外在
质谱分析中 Sauser提出的 GOODAssay[18]对质谱分
析进行了改进,通过化学修饰去除了纯化的步骤大
大节约了检测成本。
3 结语与展望
SNP的研究是目前人类基因组研究的一个热
点,其应用范围将更加宽广,对群体遗传学、制药
学、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都
将产生不可估量的影响。一个理想的检测 SNP的
方法必须具备以下优点:(1)适合自动化操作,简便
快速;(2)分析费用低,特殊试剂少;(3)反应要紧
密,不纯的样品也可以可靠的分析;(4)数据分析简
单,易于自动化;(5)反应的通量要大而灵活。每个
检测检测方法各有所长,现在为止还没有出现一个
符合上面全部条件的理想方法。因此,要根据情况,
灵活选择比较合适的方法。理想的方法必须依赖生
物化学、工程学和分析软件的进步。值得一提的是
Andreasson等在 2006年提出了针对 mtDNA混合分
析的基于焦磷酸测序技术的新方法[19],使得低成本、
高通量成为可能。随着相关科学技术的快速发展,
相信在不久的将来,很有希望发展一个理想的 SNP
检测方法。
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3 讨论
植物肌动蛋白是单一多肽链的球状蛋白,由 375~377个氨
基酸组成,分子量为 42kDa[12]。众多研究表明,Actin基因不论在
核苷酸还是氨基酸水平上都具有高度的保守性和同源性,这暗
示了 Actin作为看家基因在植物生命活动过程中起着非常重要
的作用。实验得到的霸王 Actin基因片段与其他植物 Actin基因
核苷酸序列的同源性均在 82%以上,而与氨基酸序列的同源性
则在 91%以上。由此可见,高等植物的 Actin是一种高度保守的
看家基因。无疑,实验结果再次证明了这一点。
生长在荒漠的多浆旱生植物霸王具有极强的抗逆性,可能
蕴藏着丰富的抗逆基因资源。而实验室已在霸王中成功地克隆
到了 2个耐盐抗旱功能基因的全长 cDNA。要深入研究这些基因的表达模式及调控机制,往往需要内标参
照,而 Actin基因是植物重要的内标之一。但是在 GenBank数据库中未能搜索到有关多浆旱生植物如霸王、
白刺、梭梭等的肌动蛋白基因序列,因此本研究结果填补了这方面的空白,同时丰富了肌动蛋白研究的资
料库,为进一步利用 RT-PCR方法,以 Actin基因为内标参照,研究其他基因 mRNA的表达奠定了基础。
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