全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
抑制性消减杂交技术的应用
李小庆 景志忠
(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部兽医公共卫生重点实验室
甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州 730046)
摘 要: 基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制, 而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代
分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交 ( SSH )
技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究
中。近年来, 抑制性消减杂交 ( SSH )技术得到了相应的改进和完善, 而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新
进展。主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达 功能基因 DSN均一化技术 cDNA微阵列
Suppression Subtractive Hybridization Technique and
Progress in the Application
L iX iaoqing J ing Zhizhong
(Lanzhou Veterinary Research Institute CAAS, K ey Laboratory of A nimalParasitology of Gansu Province, K ey Laboratory of Veterinary Public
H ealth of M inistry of Agriculture, StateK ey Laboratory of Veter inary Etio log ical Biology, Lanzhou 730046)
Abstrac:t D ifferentia l expression of genes is the cen tralm o lecularm echan ism of regu la ting a ll k inds of life actions Among a ll the
techno log ies of iden tify ing diffe rentia l expressed genes, suppression subtractiv e hybr idiza tion( SSH ) is considered to be w ith h igh spec i
fic ity, low backg round, h igh sens itiv ity, convenient m an ipu lation, and had been w idely applied in life sc ience and m edic ine resea rch
fie lds In this paper, the princ ip le, m e thod, character istics and the research progress of SSH techniquew ere introduced
Key words: Suppression subtractive hybr idiza tion D ifferential express ion Functiona l genes DSN ( dup lexspec ific nuclease)
norm a lization m ethod cDNA m icroarray
收稿日期: 20081111
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30871884) ,国家高新技术 863项目 ( 2006AA10A203) ,甘肃省支撑计划项目 ( 0804NKCA076)
作者简介:李小庆 ( 1983) ,男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学
通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究; Em ai:l zh izhong@j yah oo com cn
上世纪 90年代以来,随着分子生物学技术的快
速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计
划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基
因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研
究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继
问世。这些技术不依赖于已知基因的位置和功能,可
以直接在基因组中从 DNA和 RNA水平获得有意义
的目的基因片段。其中包括差异筛选、消减杂交和
mRNA差异显示法,以及代表性差异分析法、抑制性
消减杂交和交互消减 RNA差别显示法 ( reciprocal
subtract ion differential d isplay, RSDD)等。抑制性消减
杂交 ( SSH )技术是一种比较、分离不同细胞系、不同
组织间或同一细胞系、同一组织在不同条件下差异表
达基因的方法。与其他技术相比, SSH技术具有特异
性强、灵敏度高、操作简便、周期短等优点。近年来,
无论在技术改良上还是在应用研究中,抑制性消减杂
交技术都取得了一些新进展。
1 抑制性消减杂交技术产生的背景
高等真核生物含有数万个不同的基因,但在特定
的发育阶段和组织细胞中只有约 15%的基因得以表
达 [ 1]。而这些基因的表达是按时间和空间顺序有序进
行的,这种基因的选择性表达称为基因的差异表达
2009年第 5期 李小庆等:抑制性消减杂交技术的应用
( differential expression)。基因的差异表达决定了生物
体的各项生命活动,它与组织、细胞的生物学性状和功
能密切相关,并已成为生命科学的重要研究课题。因
此要了解生命活动的分子调控机制,就必须将这些差
异表达的基因分离、克隆、鉴定以做进一步的研究。为
此,人们建立了一系列研究基因差异表达的方法,如差
异筛选、消减杂交、mRNA差异显示法、代表性差异分
析法、基因表达系列分析、抑制性消减杂交和表达序列
标签 (EST)、cDNA微阵列、(半 )定量 PCR等。
差异筛选 ( differential screening )和消减杂交 ( sub
tract ive hybridization)技术是早期建立的两项经典技术,
两者均适用于分离经特殊处理而被诱发表达的基
因,并且不需任何有关目的基因的核苷酸序列信息。
差异筛选虽然得到了一定的应用,但灵敏度低,需要
大量杂交滤膜,以鉴定大量噬菌斑或克隆片段,且两
套平行转移滤膜间必然存在 cDNA量的误差,故重
复性有限。消减杂交则是针对差异筛选的局限性,
为进一步提高筛选效率而出现的。该方法的敏感性
较高, 但需要大量的 DrivermRNA才能使消减杂交
充分进行,所回收的 cDNA量也很低,而且操作步骤
繁杂、灵敏度较低、重复性差。
1992年, L iang等 [ 1]建立了 mRNA差异显示法 (mR
NA differential display)。此项技术的特点是原理简单,
所用技术成熟,灵敏度较高,可同时比较两种以上不
同来源的 mRNA样品间基因表达的差异, 并同时检
测基因的上调和下调表达,但是该方法高达 70%的
假阳性率成了它的致命缺点,另外获得的差异片段
过短, 且多位于 3端。
1993年, L isitsyn等 [ 2]建立了代表性差异分析法
( representationa l difference analysis, RDA),它是在人类
基因组基因差异表达的分析研究过程中建立的,可以
有效地筛选出基因组间的差异基因或片段。该技术
结合了消减杂交和 PCR技术原理,保留了 mRNA差
异显示技术的快速有效的特点, 同时充分发挥了
PCR以指数级扩增双链模板,而以线性级扩增单链
模板的特性,通过消减和富集, 使目的基因片段得到
特异性扩增,降低了假阳性, 但灵敏度较低, 仍需多
次杂交和 PCR,步骤较为繁琐。
1994年, Hubank[ 3 ]将 RDA法进一步改良,即 cD
NA RDA法。它用识别四碱基的限制性内切酶代替
识别六碱基的限制性内切酶消化 cDNA,用于比较具
有相近遗传背景而表型不同的两组 cDNA之间的差
异序列。该方法的阳性率提高,但灵敏度仍较低。如
果两组 cDNA之间存在较大差异,以及某些基因在检
测子中存在上调表达时,此方法显示了其局限性。
Velcu lescu等 [ 4]报道了基因表达系列分析 ( serial
analysis of gene expression, SAGE)技术,这是目前惟
一以测序为基础的定量分析全基因组表达模式的技
术,主要用于比较不同发育阶段和疾病不同时期基因
表达谱的变化,在定量分析各转录子表达水平及检测
低丰度表达基因方面具有明显的优势。 SAGE技术
的不足之处在于产生双标签时接头分子会持续存在,
这将很大程度上影响双标签的有效连接。为了高效
分析大量标签,除了需一定数量的有效克隆外, 每个
克隆所含的标签数必须尽可能多。
随着基因芯片技术的发展, cDNA微阵列 ( cDNA
m icroarray)技术 [ 5 ]也被应用于检测基因的表达, 其优
点是可以同时对大量基因,甚至整个基因组的基因表
达差异进行对比分析,是目前进行高通量基因表达分
析的最为有效的手段之一。但其存在假阳性率高、成
本高、技术水平有待进一步提高等不足之处。
为有效克服上述问题, D iatchenko等 [ 6]在 RDA法
的基础上发展了抑制性消减杂交技术。抑制性消减杂
交 ( suppression subtract ive hybridization, SSH )技术是基
于抑制性 PCR效应建立的用于分离差异表达基因片段
的最有效和最常用的方法之一,克服了 DDRTPCR法
的假阳性率较高和 RDA法消减杂交轮次较多等缺点,
适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因。
2 抑制性消减杂交技术的原理
抑制性消减杂交 ( SSH )技术是以抑制性 PCR
( suppression PCR)为基础, 将均等化检测子 cDNA
单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。简言
之, SSH技术的原理可概括为 消同富异 , 即消减
同源序列,富集差异序列。
抑制性 PCR是利用 DNA链内退火优于链间退
火且更稳定的动力学特性,使非目标序列片段两端的
长反向重复序列在退火时产生 锅柄样结构 ( pan
like structure),无法与引物配对, 从而选择性地抑制
了非目标基因片段的扩增。同时, 该方法应用了杂交
的二级动力学原理,即丰度高的单链 cDNA在退火时
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链 cDNA, 从
而使在杂交完毕后原来在丰度上有差异的单链 cDNA
达到均等化的目的。因此, SSH技术是抑制性 PCR
与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异
表达基因的方法。
3 抑制性消减杂交的主要技术流程
抑制性消减杂交技术的主要步骤包括 cDNA的
合成与酶切、接头连接、两轮消减杂交和两次抑制性
PCR扩增等。
31 cDNA的合成与酶切
分别提取实验组 ( Tester)和对照组 ( Driver)总
RNA、mRNA,反转录合成双链 cDNA,将两组 cDNA分
别用 R sa I(能识别四碱基的内切酶,该酶一般每隔
256 bp就有一个酶切位点 )酶切成最大平均长度 600
bp( 50~ 1 000 bp)的平末端双链 cDNA片段。
32 接头连接
将酶切后的 Tester cDNA分为两份, 一份与接
头 1连接,另一份与接头 2R连接。
33 两轮消减杂交
分别向连接不同接头的 Tester cDNA中加入过
量 Driver cDNA,在杂交液中进行第一轮消减杂交,
杂交完毕后形成 4种产物。第二次杂交时, 将第一
次两份杂交产物在新鲜变性 D river cDNA存在的条
件下同时混合杂交,进一步去除共有序列,杂交完毕
产物中形成一种新型分子, 它是对差异表达基因片
段进行指数扩增的模板。
34 两次选择性 PCR扩增
第二轮杂交完毕,将接头补平。第一次 PCR扩
增是用接头外侧序列作为引物结合位点, 其中只有
目标片段形成的新型分子两端连有不同接头, 以指
数级大量扩增;而其他分子不能扩增或只能线性扩
增。第二次 PCR扩增 (巢式 PCR )时,换用接头内侧
序列作为引物结合位点以进一步选择性扩增目标片
段,这样可极大提高扩增的特异性并降低背景,并使
最后的 PCR产物中绝大部分是新型分子。经过两
轮消减杂交和两次抑制性 PCR,目标片段已被大量
富集。 PCR产物可以直接用于克隆构建消减文库,
也可用于制备探针进行差异筛选。
4 抑制性消减杂交的技术评价
抑制性消减杂交技术的主要优点是可以同时实
现差异表达分子的均等化和消减, 均等化步骤使得
目标群体中 cDNA片段的丰度均等化, 从而使低丰
度差异表达基因高度富集; 而消减步骤消除了两个
群体中共同的 cDNA片段。
与 mRNA差异显示技术、cDNA代表性差异分析
技术相比, SSH技术只需两轮消减杂交和两次抑制性
PCR,便可有效地特异扩增差异表达的 cDNA片段。
DDRTPCR技术通常产生高达 70%的假阳性率,而
SSH技术的阳性率可达 94%, 即假阳性率低 [ 7]。并
且利用镜像选择 (m irror orientat ion select ion, MOS)技
术可以将样品中的假阳性克隆比例降低 4倍,从而有
效地降低消减 cDNA文库中的假阳性率 [ 8]。L i等 [ 9]
将 SSH 技术和 NSC ( negat ive subtract ion cha in)技术
相结合,提高了 SSH技术的有效性。
另外, SSH 技术也具有灵敏度高的特点。在
mRNA差异显示法、cDNA消减杂交法和 RDA法中,
低丰度的 mRNA一般不易被检出, 而 SSH方法的均
等化和目标片段的富集, 保证了低丰度 mRNA也可
能被检出。这种富集作用使得低至每细胞一个拷贝
的分子也可能被检出。 SSH技术还利用 R sa将双
链 cDNA酶切成小片段,能更好地提高不同基因的
检出率,提高在消减杂交过程中相同分子的消除效
率和差异表达基因片段的分离成功率。只要有一个
cDNA片段被分离到, 就可以通过 RACE等方法获
得其全长 cDNA, 或者以这些基因片段为探针,从全
长 cDNA文库中钓出全长目的基因。
基于抑制性 PCR扩增技术, SSH技术克服了传
统消减杂交技术分离单链和双链 DNA时烦琐困难
的操作缺陷,即 SSH技术不需要通过任何物理方法
分离单链和双链 DNA的中间步骤, 而仅通过一轮消
减杂交即可使代表差异表达基因的目标 DNA片段
富集 1 000倍,具有操作方便快捷的特点。
SSH技术还可以与其他分子生物学技术相结合,
如 cDNA微阵列技术、反向 Northern杂交技术、实时
定量 PCR技术 [ 10]、RACE技术 [ 11]、基因组比较分析
法 ( genom ic comparat ive analysis) [ 12 ]等, 实现多种技
术的优势互补,以达到高效、灵敏和特异性地分离鉴
定差异表达基因的目的。Zhou等 [ 13]联合应用 SSH
技术和 cDNA微阵列技术成功地分离了差异表达的
基因。而结合反向 Northern技术, 一次就可以高通量
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2009年第 5期 李小庆等:抑制性消减杂交技术的应用
地筛选到几十个到上百个真正差异表达的基因片段。
但是, SSH技术也存在如下不足之处: ( 1) SSH技
术一次只能分析研究两个样品之间的基因表达差异,
且样品的差异应保持在一定的范围内,一方面要求是
细微差异,另一方面也要求两者之间存在足够的复杂
性,例如 Tester和 Driver群体中必须存在大于 2 ~ 4
倍的差异 [ 14]。 ( 2)消减文库中 cDNA已经被酶切, 所
以克隆的插入序列可能只是差异表达基因的片段,这
就需要应用 RACE或电子 RACE等技术来获得差异
表达基因的全长 cDNA序列。 ( 3) Tester中连接不同
接头的低丰度单链 cDNA与互补链杂交的几率很低,
不易被扩增和克隆。 ( 4)该技术需要几微克的 mRNA
(约 05~ 2 g ),更依赖于 PCR技术, 如果预扩增可
能会导致一些序列的丢失。若 mRNA量不足,很可能
检测不到低丰度差异表达基因的 cDNA。对于某些特
殊材料,获得如此数量的 mRNA可能比较困难。而
且, SSH技术要求来源样品保持新鲜,以防 RNA降解
造成信息的丢失。 ( 5)真核生物基因组较为复杂,
SSH技术尚无法直接对其基因组 DNA进行比较。
( 6) SSH技术无法筛选完全无酶切位点或酶切位点比
较少的基因序列。该技术建立在杂交基础上,对于非
酶切位点区域内的点突变、缺失或插入均不能有效发
现。 ( 7)接头连接等过程中会有 cDNA的损失。 ( 8)
仍然存在一定的假阳性率。 ( 9)该技术尚不能实现
较长 cDNA序列 (如 600 bp)的有效均等化 [ 14]。
此外,美国的Wanh等 [ 15]对 SSH技术的动力学特
征的数理计算及实验研究表明,要使 SSH技术有效地
扩增差异表达的基因,必须符合两个条件: ( 1)在 Tester
中差异表达基因所占的百分比必须超过 001%; ( 2)差
异表达的 DNA量超过正常表达的 5倍以上,即差异表
达基因在 Tester中的量最少是 D river中的 5倍以上。
针对 SSH技术存在的两方面的局限性, 即两个
cDNA群体对复杂性的要求和 cDNA片段的长度问
题, Peng等 [ 14]应用一种全新的方法,即来源于堪察加
半岛蟹的双链特异性的核酸酶 ( DSN )介导的转录组
消减法来鉴定两种组织或细胞型中差异表达基因的
全长 cDNA序列。这种新方法是基于双链特异性的
核酸酶的分子丰度均等化策略和抑制性消减杂交的
消减方法而建立起来的。这种方法几乎可以消减掉
Tester和 Driver中所有的共同序列,可以准确地鉴别
Tester和 Driver群体, 并可富集 Tester中差异表达的
全长 cDNA序列, 而在此之前,通过 SSH技术只能获
得差异表达的基因片段。因此,这是 SSH 技术发展
史上的一次突破。
5 抑制性消减杂交技术的应用
自 1996年首次报道以来, SSH技术不断得到改
进与完善。因为具有特殊的优点, SSH技术已广泛
地应用于动物、植物、微生物等生命科学的诸多领
域, 范围也涉及到基础理论研究和应用研究等方面。
51 SSH技术在医学领域中的应用
相比较而言, SSH 技术在医学上的应用更为广
泛和成熟,特别是应用于医学、感染病学、免疫学、系
统发育和耐受现象等方面的研究中。
目前,国内外学者已将 SSH技术应用于肿瘤组
织或细胞相关基因和其他疾病相关基因的分离克
隆、药物和某些毒物的靶基因以及某些耐药相关基
因的研究。其中,肿瘤相关基因的研究包括癌基因、
抑癌基因、肿瘤转移特异性基因、肿瘤细胞信号转导
基因、肿瘤激素受体相关基因、肿瘤细胞凋亡相关基
因等的克隆与功能鉴定,内容涉及肿瘤的发生发展、
转移、信号转导、凋亡及治疗等多个方面 [ 16]。
在感染病学研究中, SSH技术主要应用于细菌
毒力相关基因、病原体感染后的应答基因、与病原体
发育阶段相关的基因及病毒基因在肿瘤发生中的作
用等方面的研究 [ 17 ]。此外, SSH技术在免疫学、发
育调节、耐受现象、衰老、干细胞和组织损伤及修复
等研究中也有广泛的应用。
52 SSH技术在动物上的应用
在动物疫病方面, SSH技术主要用于研究感染
病原体后不同阶段或不同的组织器官,以及在各种
应激环境压力下的基因表达差异情况,分离鉴定动
物的抗病 [ 18]和免疫相关基因, 以便于揭示病原体致
病性和机体免疫防御的分子机制, 从而为动物疫病
的预防、诊断和治疗提供理论依据。
SSH技术在动物上的应用还体现在遗传育种、
组织器官和细胞的分化、生长发育、免疫调控、代谢
调控等研究中和分离不同器官组织之间、个体不同
发育阶段以及受外界因子作用而差异表达的基因等
分子遗传学和基因克隆的许多研究领域。最近, 在
不同亚科的动物胚胎的杂交克隆研究中也有该技术
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
的应用报道 [ 19]。
53 SSH技术在植物上的应用
SSH技术在植物上的应用主要包括两个方面:
一方面涉及植物的生长发育及组织特异性研究,即
用于分离植物生长发育过程中不同发育阶段和不同
组织器官中的特异性表达的基因, 这为揭示植物生
长发育过程的分子机制提供了有效手段; 另一方面,
在植物抵抗各种胁迫, 包括生物 [ 20] 和非生物因
素 [ 21]的研究领域中,这项技术也已成为研究基因差
异表达的重要工具, 有助于揭示植物抗逆的分子机
制。目前, SSH技术已开始应用于研究共生菌与植
物间的相互作用 [ 22 ]、分离与次生代谢产物合成相关
的基因 [ 23]和优势种质资源的鉴定等方面。
54 SSH技术在微生物和寄生虫研究中的应用
在微生物研究方面, SSH 技术主要用于鉴定微
生物的特异性序列、研究微生物的致病性和耐药性、
鉴定特定生长发育阶段差异表达的基因以及病毒与
其他微生物的研究等。
目前, SSH技术在寄生虫学研究中的应用不是
很多, 主要用于寻找与寄生虫, 如原虫、蠕虫、节肢动
物 [ 24]生活史不同发育阶段相关的差异表达基因和
与寄生虫抗药性相关的差异表达基因, 新基因的鉴
定,寄生虫与其所传播病原体的协同演化 [ 25 ] ,以及
其他相关基因的研究,如与不同虫株、不同宿主或性
别差异相关的基因等。
6 展望
高等生物的所有生命现象,如个体的生长发育、
组织器官的分化、疾病的发生发展等都是基因差异
表达的结果。基因表达的变化是调控细胞生命活动
过程的核心机制。因此, 要认识这些生命现象的分
子调控机制,就要对差异表达的基因进行分离、克隆
和鉴定,并对它们的结构与功能进行深入的研究。
综上所述,抑制性消减杂交 ( SSH )技术是一种
高效快捷地分离和鉴定差异表达基因的有效方法,
为寻找差异表达基因和发现新基因提供了一个非常
有利的工具。目前, SSH技术在医学和实验动物基
因克隆等诸多方面已有较成熟的应用, 而且随着该
技术的不断完善与发展, 它在分子生物学和基因工
程中的应用潜能将得到进一步的体现, 在动物疾病
的预防和诊治及人类社会的公共卫生建设等许多方
面将得到越来越广泛的应用。
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