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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
槟榔黄化病组织 RNA提取方法的比较
周亚奎 1, 2 杨云 1, 2 隋春 3 甘炳春1, 2 魏建和 3
( 1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所,万宁 571533;
2海南省南药资源保护与开发重点实验室,万宁 571533;
3中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193)
  摘  要:  为了从发生黄化病的槟榔茎、叶、花中提取到完整的 RNA, 采用了 CTAB法、T rizo l法和异硫氰酸胍法提取槟榔
黄化病组织 RNA。从 RNA的完整性、产率和纯度方面对这几种方法进行了比较, 结果表明,异硫氰酸胍法所得 RNA完整性较
好, 条带清晰无明显降解, OD260 /OD280介于 1
8- 2. 0之间, RNA得率较高,为 120
g /g以上,并能成功进行反转录制备 cDNA,
表明该 RNA可以进行后续分子生物学操作。
关键词:  槟榔 黄化病  RNA提取 异硫氰酸胍法
Comparison ofM ethods for Extracting Total RNA from
Yellow Leaf Disease T issue ofAreca catechu L.
Zhou Yaku i
1, 2
YangYun
1, 2
SuiChun
3
Gan B ingchun
1, 2
W e i J ianhe
3
(
1
Hainan B ranch Institute of M edicinal Plant, Chinese A cademy of M edical Sciences& Peking Union M edical College, W anning 571533;
2
Hainan ProvincialK ey Laboratory of ResourcesConservation and D evelopm ent of Southern M edicine, Wanning 571533;
3
Institute of M edicinal P lantD evelopment, Chinese A cademy of M ed ical Sciences& Peking UnionM edical College, Beijing 100193)
  Abstrac:t  In o rder to ex tract pure and integrate RNA from stem, leaf and flower ofA reca catechu L. , theCTAB, T rizo l and guan
idine iso th io cyana tem ethod w ere com pa red. A ccording to the integr ity, productiv ity and pur ity o f ex tracted RNA, the guan id ine isoth io
cyana tem ethod w as them ost appropr ia tem ethod of RNA extrac tion forA reca ca techu L. W ith this m ethod, the RNA bands we re clear
w ithout degrada tion, the ratio of OD260 /OD280w ere 1
8- 2. 0, and y ie ld o f tota lRNA 120
g /g. The RNA was su itab le fo rRTPCR and
cDNA synthes is, and can be used fo r the follow ingup m o lecular b io logy operations.
Key words:  A reca catechu L. Yellow lea f disease RNA ex traction Guanidine isoth iocyanate m ethod
收稿日期: 20100113
基金项目: 十一五 !国家科技支撑计划项目 ( 2007BA I27B03)
作者简介:周亚奎,男,硕士,研究方向:植物病理学; Ema i:l zhouyaku i163@ 163. com
通讯作者:魏建和,男,研究员,博士,研究方向:药用植物分子育种和栽培; Em ai:l jhw e@i im p lad. ac. cn
槟榔 Areca catechu L.属棕榈科,多年生药用植物,
是海南省第二大经济作物。而黄化病是严重危害槟榔
生产的一种毁灭性病害,对其发病原因及致病因子至
今没有一个明确的结论。传统植物病害检测方法已不
能解决这一问题,从基因组 RNA入手是可以帮助了解
更多关于槟榔黄化病的信息,开启新的思路。
提取高质量的 RNA是进行分子生物学研究的
基础, 关于植物 RNA提取的方法很多, 常用的有
CTAB法、T rizo l法、异硫氰酸胍法等, 这些方法已经
在很多植物上应用并成功提取出 RNA,但由于植物
化学组份的差异, 没有一种特定的方法适合于所有
植物的 RNA提取 [ 1]。目前还没有关于槟榔组织
RNA提取的相关报道, 为了得到高质量的 RNA对
其进行后续研究, 本研究分别采用 CTAB法、T rizo l
法、异硫氰酸胍法提取槟榔黄化病组织 RNA; 对 3
种方法进行比较, 并通过反转录及 cDNA的合成对
提取的 RNA的质量进行检验。
1 材料与方法
1
1 材料
槟榔黄化病组织取自海南省万宁市槟榔园,
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
分别取茎、叶、花为 RNA提取材料。Tr izo l试剂购
自 Inv itrogen公司; 异硫氰酸胍、DEPC和 CTAB购
自北京鼎国生物公司; 反转录试剂盒购自 C lone
tech公司; 引物由上海生工生物有限公司合成; 其
他各种试剂均为 RNA试验专用。试验所用的玻
璃、金属等制品均在 180∀ 下烘 4 h以上。塑料制
品均用 0
1% DEPC水溶液中浸泡过夜并经高压灭
菌处理。其它仪器设备和试剂均保证干净且无
RNA ase污染。
1
2RNA  提取方法
1
2. 1 CTAB法 参考 Bekesiova等 [ 2]的方法稍作
修改。液氮研磨 0
1 g新鲜的槟榔组织, 快速转移
样品至盛有预热 CTAB提取液 [ 2% CTAB (W /V ) ,
2% PVP(W /V ), 25mmo l/L EDTA, 100mmol /L Tris
C l pH8. 0, 2mo l/L N aC ,l 3. 4mmo l/L Sperm id ine(亚
精胺 ), 2% ( V /V )巯基乙醇 ]的离心管中,立即涡旋
30 s, 65∀ 水浴 30 m in, 期间小心混匀 2- 3次。加
入 1 mL酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25#24#1 )并充分混匀,
4∀ , 10 000 r/m in, 离心 15 m in。将上清液转移至一
新的 2mL离心管中,重复抽提 1次。在上清液中加
入 1 /3体积的 8 mo l/L L iC,l使 L iC l的终浓度为
2 mol /L, - 20∀ 沉淀过夜。 4∀ , 10 000 r /m in, 离心
20 m in,弃上清, 用 70%乙醇小心洗涤沉淀 2次,室
温下风干。用 500
L DEPC水溶解沉淀, 转移至
1
5 mL 离心管中, 加入等体积的氯仿 /异戊醇
( 24#1), 充分混匀, 4∀ , 10 000 r /m in,离心 15 m in。
加入1 /10体积的 3 mo l/L NaA c( pH5. 2) , 2倍体积
的无水乙醇, - 20∀ 沉淀 2 h。4∀ , 10 000 r/m in,离
心 10m in,用 70%乙醇小心洗沉淀 2次, 室温干燥
后用50- 100
L DEPC水溶解,待测。
1
2. 2 异硫氰酸胍法 参考 Gehrig等 [ 3, 4 ]的方法
稍作修改。取 0
1 g新鲜组织置于研钵中, 加入液
氮, 迅速研磨成均匀的粉末。将粉末移入预冷的 2
mL离心管中,并向其中加入 0
75 mL异硫氰酸胍
变性液 [ 4 mo l/L异硫氰酸胍, 25 mo l/L柠檬酸钠
( pH7. 0 ) , 25 mmo l/L 十二烷基肌氨酸钠, 1%
( V /V )巯基乙醇 ] , 轻轻摇动离心管使混合均匀。
按顺序加入 1 /4体积 2mo l/L N aA c( pH 4. 0 )、1mL
水饱和酚 /氯仿 /异戊醇, 每加入一种试剂都轻轻
摇动离心管混合均匀, 最后将离心管盖紧, 倒转几
次混合均匀,室温放置 10m in。 4∀ , 10 000 r /m in,
离心 10 m in, 将上层水相转移至另一新离心管, 并
加入等体积的异丙醇, 混匀后置于 - 20∀ 沉淀 2
h。 4∀ , 10 000 r /m in, 离心 15 m in, 小心去除上清
液,沉淀溶解于 0
75 mL异硫氰酸胍变性液中, 加
入等体积氯仿 /异戊醇。 4∀ , 10 000 r /m in, 离心
10 m in。小心转移上清液, 加入等体积的异丙醇,
混匀后置于 - 20∀ 沉淀 2 h。4∀ , 10 000 r /m in, 离
心 15 m in,小心去除上清液。沉淀用 70%乙醇洗 2
次,晾干后溶于 50 - 100
L DEPC 水中, 置于
- 70∀ 低温条件下保存。
1
2. 3 改良的 T rizo l试剂法 参考王昆等 [ 5 ]方法。
取 0
1 g新鲜组织置于研钵中,加入液氮, 迅速研磨
成均匀的粉末,加入 1 mL Trizol试剂、1% 巯基乙
醇、1% PVP, 迅速混匀置冰上静止 5 m in。加入 50

L 2 mo l/L N aA c ( pH4. 2) , 200
L 氯仿 /异戊醇
( 24#1)震荡混匀, 再缓慢加入 150
L无水乙醇和
100
L 5mo l /L KA c( pH4. 8), 充分混匀,冰上静置
10m in。 4∀ , 12 000 r /m in, 离心 20 m in, 取上层水
相,加入等体积的 T ris饱和酚 /氯仿 ( 25#24) ,轻摇 5
m in。 4∀ , 12 000 r /m in,离心 10 m in,将上清液转移
到新管中,用氯仿 /异戊醇 ( 24#1)重复抽提至界面
澄清。向上清液中加入 2 /3体积的异丙醇和 1 /10
体积的 3 mo l /L N aAc ( pH5. 2) , - 20∀ 沉淀 3 h。
4∀ , 12 000 r /m in,离心 20m in, 沉淀经 75%乙醇洗
涤两次, 风干, 50
L DEPC水溶解。加入 150
L
0
3 mol /L N aC ,l混匀, 室温离心 20 m in, 吸取上清,
加入 2倍体积无水乙醇和 3 mo l /L NaA c( pH 5. 2),
- 20∀ 沉淀 30 m in。 4∀ , 12 000 r/m in, 离心 20
m in, 沉淀经 75%乙醇洗涤 2次, 风干, 50
L DEPC
水溶解。
1
3 RNA的纯度、完整性及质量检测
1
3. 1 RNA的纯度及完整性 用 1%琼脂糖凝胶
电泳, 120 V, 25 m in, 检测 RNA的完整性。用紫外
可见分光光度计测定 RNA 的 OD 值和浓度
(
g /
L) ,根据数值分析 RNA的纯度。
1
3. 2 cDNA双链合成 对不同方法提取的 RNA
分别进行反转录及双链合成,按 C lonetech公司的说
明书进行操作。反转录第一条 cDNA的合成使用随
机引物 5∃GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN3∃,
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2010年第 8期 周亚奎等:槟榔黄化病组织 RNA提取方法的比较
第二链扩增使用引物 5∃CGCCGTTTCCCAGTAG
GTCTC3∃,取 1
L第一链产物作为模板, 95∀ 预变
性 1 m in,先进行 5个循环 ( 95∀ 变性 5 s, 25∀ 退火
5 s, 68∀ 延伸 6m in) ,再扩增 25个循环 ( 95∀ 变性
5 s, 55∀ 退火 5 s, 68∀ 延伸 6 m in ) , 最后再延伸
5 m in。反应完成后, 取 5
L电泳检测结果。
2 结果
2. 1 RNA完整性分析
电泳结果 (图 1)显示, 改良的 T rizo l法可以从
茎、叶、花中提取到 RNA,但是降解严重。CTAB法
只能提取出花中的 RNA, 且也存在降解现象。只
有改良的异硫氰酸胍法从槟榔的茎、叶、花组织中
提取出总 RNA,带型清晰, 28S rRNA和 18S rRNA
的条带比例合适, 没有降解。经紫外分光光度计
测定 230 nm、260 nm、280 nm 的 OD值, OD260 /
OD280介于 1
8- 2. 0之间, OD 260 /OD230大于 2. 0,
表明所提的 RNA纯度较高,而且 RNA的产率也明
显比前两种方法提取的产率高, 达到 120 - 200

g /g之间。每种方法均通过 3次以上试验, 具有
可重复性。
A.改良的 Trizol试剂法; B. CTAB法; C.异硫氰酸胍法;
1.茎; 2.叶; 3.花
图 1 不同提取方法提取槟榔黄化病组织 RNA电泳图
2. 2 RTPCR
为了进一步证明 3种方法提取的总 RNA的纯
度和完整性,分别以 3种总 RNA为模板,使用 Super
SMART PCR cDNA Synthesis试剂盒进行 cDNA合
成。从扩增结果 (图 2)可以看出, 异硫氰酸胍法扩
增得到的双链 cDNA片段大小主要分布在 0
2- 2. 0
kb之间, 表明提取的总 RNA质量较好, 基本无降
解。CTAB法扩增没有得到任何片段 (图略 )。
M. DL 2000 DNA M aker; 1 - 3.分别为改良的 Tr izol法提
取的茎、叶、花; 4 - 6.分别为异硫氰酸胍法提取的茎、
叶、花
图 2 改良的 Trizol法和异硫氰酸胍法
总 RNA进行 RTPCR电泳图
3 讨论
提取完整的植物总 RNA, 选择合适的材料是关
键,要尽可能的有代表性,所以选取槟榔 3个不同组
织进行提取 RNA。
槟榔组织中含有大量的多糖和酚类物质,在氧化
条件下,酚类物质会产生褐化效应 [ 6, 7] ,被氧化成多醌
后不可逆地结合到核酸上并与 RNA共沉淀, 导致提
取得到的 RNA质量较差。笔者在采用改进异硫氰酸
胍法提取 RNA时发现, 提取过程中加入巯基乙醇能
明显改善褐化现象,并提高 RNA的质量,而且巯基乙
醇作为强还原剂能防止多酚氧化, 还可以打断多酚氧
化酶的二硫键而使之失活。异硫氰酸胍是已知的作
用最强的蛋白变性剂,它在裂解细胞的同时能迅速使
RNA酶失活,很好的抑制了 RNA酶的活性。十二烷
基肌氨酸钠是强的蛋白变性剂,和酚一起对蛋白起作
用,同时也可抑制 RNA酶的活性。在提取过程中加
入 N aA c以及偏酸性的苯酚,也有助于除去 DNA的干
扰。该方法具有提取快速,所需操作时间短等特点,
减少了 RNase污染的几率。
不同的植物材料内含物质组分及含量有很大不
同,需要有针对性地选择不同的 RNA提取方法。本
研究针对槟榔组织的特点, 在采用改进的异硫氰酸
胍法提取到较高质量的 RNA, 并在此基础上成功进
行了双链 cDNA的合成,为后续研究打下了良好的
基础, 也为其他类似植物的 RNA制备提供了理论
参考。 
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
参 考 文 献
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