全 文 ：河南农业科学，2016，45(10):151-154
Journal of Henan Agricultural Sciences doi:10． 15933 / j． cnki． 1004-3268． 2016． 10． 034
收稿日期:2016 － 04 － 02
基金项目:海南省中药现代化专项项目(ZY201417);三亚市院地科技合作项目(2014YD16，2015YD29);三亚市功能槟榔研究
重点实验室项目(L1411)
作者简介:刘书伟(1978 －)，男，河南平舆人，副教授，硕士，主要从事中药毒理、农产品加工研究及相关教学工作。
E － mail:hnlsw@ 163． com
* 通讯作者:王 燕(1979 －)，女，河南太康人，副教授，硕士，主要从事槟榔研究及相关教学工作。
E － mail:wysw119@ 163． com
石灰、蒌叶处理槟榔对小鼠生殖毒性及
体温的影响
刘书伟1，王 燕2* ，都二霞3，胡劲召2
(1．海南热带海洋学院 热带生物与农学院，海南 三亚 572022;2．海南热带海洋学院
热带生态环境保护学院，海南 三亚 572022;3．美国康涅狄格大学 医学院，康涅狄格州 法明顿 06032)
摘要:为探索添加蒌叶和石灰对槟榔毒副作用的影响，设置蒌叶 +槟榔、石灰 +槟榔、蒌叶 +石
灰 +槟榔、槟榔 4 个处理及空白对照(蒸馏水)，分别将不同处理的水提液(蒸馏水)对 SPF 级 KM
小鼠进行灌胃处理，每天 1 次，连续灌胃 14 d，测定小鼠的生精细胞凋亡指数、Bcl － 2 与 Bax蛋白表
达量及体温。结果表明，与空白对照相比，各处理的睾丸曲细精管中生精细胞凋亡指数均增高且差
异显著，其中槟榔处理的凋亡指数最大，其次是槟榔 +石灰，槟榔 +蒌叶 +石灰处理最小，槟榔处理
的凋亡指数是槟榔 +蒌叶 +石灰处理的 2． 6 倍;各处理的 Bax蛋白表达阳性率均增高，Bcl － 2 蛋白
表达阳性率均降低，其中槟榔处理变化幅度最大，槟榔 +蒌叶 +石灰槟榔处理最小，槟榔 +蒌叶 +
石灰处理的 Bcl － 2 /Bax值是槟榔处理的 1． 41 倍;各处理的小鼠体温均呈现下降趋势，槟榔 +蒌
叶 +石灰处理体温相对最高且降幅最小，与槟榔处理相反。可见，添加蒌叶或石灰能减弱槟榔对小
鼠的毒性作用。
关键词:槟榔鲜果;小鼠;细胞凋亡;体温
中图分类号:S859． 3 文献标志码:A 文章编号:1004 － 3268(2016)10 － 0151 － 04
Influence of Lime，Piper betle Processing Betelnut on Mice’
Genital Toxicity and Body Temperature
LIU Shuwei1，WANG Yan2* ，DU Erxia3，HU Jinzhao2
(1． College of Tropical Biology and Agronomy，Hainan Tropical Ocean University，Sanya 572022，China;
2． College of Tropical Ecological Environmental Protection，Hainan Tropical Ocean University，Sanya 572022，China;
3． Department of Medicine，UConn Health，Farmington，CT 06032，USA)
Abstract:To explore the toxic effects of betelnut after Piper betle and lime were added，the KM mice of
SPF were intragastricly administered with water extract solution from Piper betle + betelnut，lime + betelnut，
Piper betle + lime + betelnut and betelnut once a day and observed for 14 d． Spermatogenic cell index，Bcl-
2，Bax and body temperature of mice were measured． The results showed that spermatogenic cell apoptosis
index of treatments were increased and had a significant difference with the control，in which the betelnut
treatment was the biggest and was 2． 6 times of Piper betle + lime + betelnut treatment that was the
smallest，and lime + betelnut was between them． The positive expression level of Bax protein of the
treatments were up regulated，but Bcl-2 protein was down regulated significantly，which betelnut treatment
changed was the biggest，and Piper betle + lime + betelnut was minimum，but the Bcl-2 /Bax of the later
河南农业科学 第 45 卷
was 1． 41 times of the former． Body temperature of mice in four treatments were lower than CK and showed
a trend of decline，Piper betle + lime + betelnut treatment’s temperature was relatively higher and the
smallest decrease，in contrast with betelnut． In short，adding Piper betle or lime to betelnut could weaken
genital toxicity in mice．
Key words:betelnut;mice;cell apoptosis;body temperature
槟榔(Areca catechu L．)是棕榈科槟榔属的热带
常绿乔木，其果实因具有重要的药用价值而位居中
国四大南药之首［1］。槟榔是许多中药复方的组成
成分，如四磨汤、槟榔四消丸、柴胡舒肝丸等，其应用
较广泛。在兽医临床上，槟榔主要用于治疗绦虫、蛔
虫、钩虫等［2-4］，也可治疗牲畜的食积气滞、腹痛胀
满便秘、增加食欲等［5-7］，还可用于抗氧化、抗抑郁、
抗炎镇痛等［8］。2003 年，世界卫生组织国际癌症研
究中心(IAＲC)认定槟榔为Ⅰ级致癌物［9］。此后，槟
榔的使用安全性越来越受到质疑，国内外学者对槟
榔进行了较多研究，但之前的研究主要集中在槟榔
生物碱的药理及毒性方面，而对槟榔鲜果添加物的
研究较少［10-12］。关于槟榔毒性来源一直存在争议，
槟榔咀嚼地区一般把毒性来源归结于添加物上，但
缺乏科学依据。为此，针对槟榔常用添加物进行毒
性评价，采用鲜果槟榔传统食用的方法对小鼠进行
灌胃，研究小鼠对毒物较敏感的生殖器官的毒性变
化情况，以小鼠睾丸曲细精管中的生精细胞凋亡状
况来评价槟榔对小鼠的生殖毒性，并观察小鼠染毒
后体温的变化，评价槟榔添加物对其毒副作用的影
响，旨在为槟榔在兽药学领域的进一步产品开发和
利用提供理论支持。
1 材料和方法
1． 1 供试动物
4 周龄 SPF级 KM小鼠购于湖南斯莱克景达实
验动物有限公司，生产许可证号:SCXK(湘)2013—
0004。购入后置于海南省三亚市功能槟榔重点实验
室动物房养殖，以江苏省协同医药生物工程有限责
任公司生产的 SPF级小鼠专用维持饲料喂养，采取
自由采食、饮水的喂养方式，适应 7 d 后，选取表现
无异常、大小均匀的小鼠待用，体质量为(18 ± 1)g。
实验室室内温度(22 ± 3)℃，光照为 12 h /d，相对湿
度 60% ～70%。
1． 2 试验设计
按照食品毒理学实验室操作规范(中华人民共
和国国家标准 GB15193—2014)进行试验，选取 45
只 4 周龄、SPF 级、大小均匀的健康 KM 雄鼠，随机
分为 5 个处理，即槟榔 +蒌叶 +石灰处理、槟榔 +蒌
叶处理、槟榔 +石灰处理、槟榔处理及空白对照处理
(CK，蒸馏水)。每个处理 9 只雄鼠。采用 4 个处理
的水提液和蒸馏水对小鼠经口灌胃。具体要求为:
小鼠禁食 8 h 后称其体质量后对小鼠灌胃，每天
1 次，灌胃剂量标准为 15 mL /kg，给药后禁食禁水
1 h后，自由采食饮水，连续灌胃 14 d，小鼠均为单只
单笼饲养。
1． 3 槟榔材料及制备
槟榔鲜果采摘于海南三亚吉阳区的槟榔种植
园，采收的槟榔茎部带宿萼，切开后有未成熟的种
子，外形椭圆、匀称，纵向直径为 5 ～ 6 cm，横向直径
为 3 ～ 4 cm，光泽好、绿色纯正。为防止槟榔水分挥
发，槟榔采用保鲜膜包裹，冷藏待用。将鲜果槟榔清
洗干净后晾干，切碎待用。用马弗炉烧制贝壳，制备
贝壳粉，然后把贝壳粉与蒸馏水混合制备成黏稠状
石灰待用。取碎槟榔、新鲜蒌叶和黏稠状石灰按照
质量比 144∶ 16∶ 9混合，取碎槟榔与新鲜蒌叶按照质
量比 9∶ 1混合，取碎槟榔与黏稠状石灰按照质量比
16∶ 1混合。分别取各混合物 500 g，并在各混合物中
加入等质量的蒸馏水，分别用研磨机粉碎研磨
5 min，静置水提 4 h，然后用双层纱布过滤，将滤液
分别置于经消毒后的离心管中，5 000 r /min 离心
10 min，然后采用 0． 22 μm除菌过滤膜过滤，滤液即
为供试水提液，水提液现用现制，2 h内处理完毕。
1． 4 测定指标
1． 4． 1 生精细胞凋亡检测 灌胃处理 14 d 后，脱
颈椎处死小鼠，迅速摘取小鼠双侧睾丸，采用脱氧核
糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法
(TUNEL)检测。将睾丸组织切片置于荧光显微镜
下观察，细胞核中具有棕黄色颗粒且背景清晰的细
胞视为阳性细胞，每张切片均选 20 个视野，计总的
生精细胞凋亡数，通过计算得出生精细胞凋亡指数。
1． 4． 2 免疫组织化学法检测睾丸组织 Bax和 Bcl －2
蛋白的表达 参照姜卓等［13］的方法进行检测。
10%中性甲醛固定睾丸组织，铬明矾处理组织切片，
然后进行石蜡包埋、切片、展片、烘片、脱蜡等处理，
采用武汉博士德生物工程有限公司生产的试剂盒按
说明书进行操作，应用 JD － 801 形态学显微图像分
析系统对结果进行分析。
251
第 10 期 刘书伟等:石灰、蒌叶处理槟榔对小鼠生殖毒性及体温的影响
1． 4． 3 体温 试验期间，应用北京海创高科科技有
限公司生产的 TH －212 生物体温计，从第 2 天开始
对小鼠的体温进行测量，每 2 d测定 1 次，共计测量
7 次。
1． 5 数据处理
差异性统计分析使用 SPSS 19． 0 统计软件处理，
单因素 ANOVA分析，数据以平均数 ±标准差表示。
2 结果与分析
2． 1 不同处理对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响
从图 1 可知，与 CK相比，其他 4 个处理的小鼠
睾丸曲细精管中的生精细胞凋亡指数均有不同程度
的增高;CK与槟榔 +蒌叶、槟榔 +石灰及槟榔处理
差异极显著，与槟榔 +蒌叶 +石灰处理差异显著。
与槟榔处理相比，添加蒌叶的 2 个处理生精细胞凋
亡指数均极显著降低，说明添加蒌叶后能降低槟榔
对小鼠生殖器官的损伤。槟榔 +蒌叶 +石灰处理细
胞凋亡指数值最小，槟榔处理细胞凋亡指数是其2． 6
倍，说明通过向槟榔里添加蒌叶和石灰，能减少槟榔
对小鼠的生精细胞的伤害。
不同小、大写字母表示在 0． 05、0． 01 水平差异显著
图 1 不同处理对小鼠睾丸生精细胞凋亡指数的影响
2． 2 不同处理对小鼠生精细胞的 Bcl －2 和 Bax蛋
白表达的影响
Bcl － 2 和 Bax蛋白均参与生精细胞凋亡［14-15］。
Bcl － 2 和 Bax 蛋白在功能上相互对立，Bcl － 2 蛋白
抗细胞凋亡，Bax蛋白促细胞凋亡，Bcl － 2 /Bax 值的
大小是决定细胞是否发生凋亡的重要指标。从表 1
可看出，Bcl － 2 和 Bax 蛋白在各处理中均有不同程
度的表达。在 Bax 蛋白表达阳性率方面，槟榔处理
最大，且与 CK差异显著;其他 3 个处理略高于 CK，
但差异均不显著。在 Bcl － 2 蛋白表达阳性率方面，
4 个具有槟榔成分的处理均小于 CK，其中 CK 与槟
榔处理差异极显著，与槟榔 +石灰处理差异显著，与
其他 2 个处理差异不显著;槟榔处理与槟榔 + 蒌
叶 +石灰处理差异极显著。在 Bcl － 2 /Bax 方面，4
个具有槟榔成分的处理均小于 CK;槟榔 +蒌叶 +石
灰处理、槟榔 + 蒌叶处理、槟榔 + 石灰和 CK 的
Bcl － 2 /Bax值分别是槟榔处理的 1． 41 倍、1． 29 倍、
1． 19 倍和 1． 73 倍。从以上分析可知，在诱导小鼠
睾丸生精细胞凋亡方面，与槟榔处理相比，槟榔 +蒌
叶 +石灰处理能降低凋亡基因蛋白 Bax 的表达，显著
地增强抗凋亡基因蛋白 Bcl －2的表达，使 Bcl －2 /Bax
值增大。说明添加蒌叶和石灰能明显减弱槟榔对小
鼠睾丸组织的伤害。
表 1 不同处理的小鼠睾丸组织 Bax蛋白和 Bcl －2 蛋白
表达及 Bcl －2 /Bax差异性
处理
Bax蛋白表达
阳性率 /%
Bcl － 2 蛋白表达
阳性率 /%
Bcl － 2 /Bax
槟榔 39． 59 ± 2． 06aA 23． 14 ± 1． 89cB 0． 59 ± 0． 07dC
槟榔 +蒌
叶 +石灰
35． 70 ± 3． 09abA 29． 49 ± 1． 96abA 0． 83 ± 0． 06abAB
槟榔 +蒌叶 37． 26 ± 2． 63abA 28． 17 ± 2． 60abAB 0． 76 ± 0． 07bcAB
槟榔 +石灰 38． 47 ± 2． 40abA 25． 52 ± 2． 78bcAB 0． 66 ± 0． 06cB
CK 33． 32 ± 1． 66bA 34． 17 ± 3． 17aA 1． 02 ± 0． 06aA
注:同列数据不同小、大写字母分别表示在 0． 05、0． 01 水平差异
显著。
2． 3 不同处理对小鼠体温的影响
从图 2 可以看出，整个试验期间，槟榔 +蒌叶 +
石灰处理、槟榔 +蒌叶处理、槟榔 +石灰处理、槟榔
处理的小鼠体温均低于 CK;随着灌胃天数的增加，
4 个具有槟榔成分的处理体温均呈现逐渐降低的趋
势，其中槟榔处理组小鼠体温降低最为明显。槟
榔 +蒌叶 +石灰处理体温降低幅度较小，且体温均
高于槟榔 +蒌叶处理、槟榔 +石灰处理和槟榔处理。
图 2 不同处理对小鼠体温的影响
3 结论与讨论
本研究结果表明:(1)槟榔水提液可诱导小鼠
生精细胞凋亡，槟榔 +蒌叶 +石灰处理、槟榔 +蒌叶
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处理、槟榔 +石灰处理、槟榔处理的小鼠生精细胞凋
亡指数增高，与 CK差异均显著。其中，槟榔处理凋
亡指数是槟榔 + 蒌叶 + 石灰处理凋亡指数的 2． 6
倍。此外，槟榔处理 Bax蛋白表达阳性率最大，且与
CK差异显著，其他 3 个处理略高于 CK，但差异不显
著;4 个具有槟榔成分的处理的 Bcl － 2 蛋白表达阳
性率均小于 CK，其中 CK 与槟榔处理差异极显著，
与槟榔 +蒌叶 +石灰处理差异不显著，同时槟榔处
理与槟榔 +蒌叶 +石灰处理差异极显著。说明添加
蒌叶和石灰，能减小槟榔对小鼠的伤害，不添加蒌叶
或石灰的槟榔使小鼠生精细胞凋亡指数较大，使生
精过程发生障碍，从而影响其生殖功能，其详细机制
还有待进一步探讨。(2)4 个具有槟榔成分的处理
的小鼠体温均不同程度低于 CK，并均呈现下降趋
势。其原因可能是小鼠基础代谢率降低，各器官功
能减弱，或者是各处理通过抑制小鼠下丘脑体温调
节中枢，而使体温调节功能下降。
胡怡秀等［16］曾报道，当槟榔碱水提液超过一定
剂量时，会能使小鼠精子数量显著减少、精子活动率
明显降低及精子畸形率明显升高，甚至会导致小鼠
性功能减低。高文平等［17］研究表明，槟榔碱能降低
正常男性体外精子运动能力，其毒性与浓度时间成
正比。刘书伟等［18］也表明，槟榔水提液影响小鼠体
质量、存活率及生精细胞凋亡指数，并与槟榔碱含量
呈正相关。以上研究与本研究的结果总体一致，说
明槟榔果中高剂量的槟榔碱对雄性小鼠的生殖系统
可能造成一定的危害，但有待进一步的试验研究。
同时本研究发现，向槟榔里添加蒌叶和石灰，能减弱
槟榔的毒副作用。但若把槟榔添加到饲料中时，同
时加入蒌叶或石灰是否对牲畜具有积极影响，需进
一步研究。
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