全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
PCR方法筛选淡紫灰链霉菌海南变种基因组粘粒文库
田云龙 1 　朱昌雄 1 　蒋细良 2 　郭萍 1 　刘雪 1
(1中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 ,北京 100081; 2中国农业科学院植物保护研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　以中生菌素产生菌淡紫灰链霉菌海南变种 ( S treptom yces lavendu lae var. hainanensis) B27菌株为材料 ,利用
pOJ446作为载体构建了 B27菌株的基因组粘粒文库 ,文库效价达到 4. 21 ×106 CFU /m l。随机挑取 12个克隆提取质粒 ,经
B am H I酶切电泳分析 ,插入片段大小约为 30～40 kb,符合建库要求的理论值。利用建立的基于 96深孔板 PCR技术的文库筛
选改良方法 ,成功快速地筛选到含有目标基因片段的阳性菌株。
关键词 : 　中生菌素 　生物合成基因 　基因组 　粘粒文库 　筛选
The PCR2based Screen ing of the Cosm id L ibrary from
S treptom yces lavendu lae var. ha inanensis
Tian Yunlong 1 　Zhu Changxiong 1 　J iang Xiliang2 　Guo Ping1 　L iu Xue 1
( 1 Institu te of Environm ent and Sustainable Developm ent in Agriculture, Chinese Academ y of Agricultural Science, B eijing 100081;
2 Institu te of Plant P rotection, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　The cosm id genom ic library of S treptom yces lavendu lae var. hainanensis B27 p roducing zhongshengmycin was construc2
ted by using pOJ446 as cosm id vector. The titer of the constructed cosm id library was 4. 21 ×106 CFU /m l. 12 colonies were p icked, and
their com id vectors were p repared and digested with B am H I. A s a result, the electrophoresis showed that the inserting DNA sizes ligated
into the vectors were 30 kb to 40 kb which could fulfill the research m ission. A PCR2based method for screening the cosm id library was
developed and four clones which carried target DNA sequence were successfully screened.
Key wo rds: 　Zhongshengmycin　B iosynthetic genes　Genom ic　Cosm id library　Screening
收稿日期 : 2009206224
基金项目 :国家“863”项目 (2006AA10A209)
作者简介 :田云龙 (19762) ,男 ,助研 ,博士 ,主要从事生物农药研究 ; E2mail: tianyl@ caas. net. cn
通讯作者 :朱昌雄 (19632) ,男 ,博导 ,研究员 ; E2mail: zhucx120@163. com　　中生菌素是一种由淡紫灰链霉菌海南变种 (S.lavendu lae var. hainanensis)产生的农用抗生素 ,它可抑制病原细菌菌体蛋白质的合成 ,并能使丝状真菌畸形 ,抑制孢子萌发和杀死孢子 [ 1, 2 ]。该抗生素是一种多组分抗生素 ,属于链丝菌素族 ,该族抗生素的结构几乎完全相同 ,不同之处只在于肽链中所含有的β2赖氨酸数目不同 (1～7个 )。在中生菌素生物合成基因克隆的前期研究中 ,尽管做了大量的工作 ,但是由于链霉菌基因组高 G/C含量的特点、以及所用方法的限制等因素 ,导致仅克隆到约 1 kb大小的基因片段 [ 3 ] 。为了克隆到完整的中生菌素生物合成基因 ,就需要使用新的方法。目前所知大多数抗生素生物合成基因是成簇存在的 ,大小在几 十 kb左右 ,构建基因组粘粒文库、并利用有效的方法对文库进行筛选是获取这些重要基因的有效途径。1　材料与方法1. 1　菌株和质粒淡紫灰链霉菌海南变种 (S. lavendu lae var. hain2anensis) B27菌株由本课题组保存。大肠杆菌 ( Esche2rich ia coli) XL 12B lue MRF’( Stratagene)用作粘粒文库的转化宿主。pMD192T ( TaKaRa)用于克隆 PCR产物。粘粒 pOJ446用于构建粘粒文库。1. 2　培养基高氏一号固体培养基用于 B 27菌株的固体培养。改良 YEME 用于 B27 菌株的液体培养 [3 ]。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
Luria2Bertani(LB)培养基用于培养大肠杆菌。Terrific
B roth ( TB )培养基用于文库扩增及保存。
1. 3　酶和主要试剂
Gigapack III XL packaging extract包装蛋白为
Stratagene公司产品 ; Q IAEX II Gel Extraction Kit为
Q iagen公司产品。λDNA2Mono Cut M ix、λDNA2H ind
III D igest DNA Marker、Sau3A I、B am H I、Hpa I、Spe I、
X ba I等限制性内切酶、T4连接酶、小牛肠碱性磷酸
酶 (C IAP)等为 NEB公司产品。RNA酶、溶菌酶和
G418抗生素等为 Am resco公司产品。2 ×EasyTaq
PCR SuperM ix为全式金公司产品。
1. 4　采取盐析法提取链霉菌总 DNA [ 4 ]。
1. 5　粘粒文库的构建、扩增和保存
按照《分子克隆 》(第 3版 )所述进行粘粒文库
构建 ,并在液体培养基内扩增和保存 [ 5 ] 。先筛选
基因组酶切的合适条件 ,分别用 0. 01、0. 03、0. 05、
0. 07、0. 09、0. 1、0. 15、0. 2 个 S au3A I酶单位 /μg
基因组 DNA 进行消化 ,然后进行脉冲场电泳分
析。利用筛选到的条件进行大量酶切 ,将大量酶
消化产物进行脉冲场琼脂糖凝胶电泳后 ,用 Q I2
AEX II Gel Extraction试剂盒回收 30～40 kb DNA
片段。将回收的 DNA片段进行浓缩和去磷酸化 ,
去磷酸化的 DNA 片段与经去磷酸化处理的载体
pOJ446进行连接 ,用包装蛋白包装连接产物 ,再把
包装物转染到宿主细胞 E. coli XL 12B lue MRF’
中。根据 Gigapack III XL packaging extract试剂盒
的使用说明进行检测。
1. 6　鉴定文库质量
文库液涂于含 10μg/m l G418的 LB 平板上 ,
37℃过夜培养 ,挑取 12个克隆 ,分别接种于含有
10μg/m l G418的 LB液体培养基 , 37℃, 220 r/m in
振荡培养 16 h,利用 SDS碱裂解法 [ 5 ]小量提取重组
粘粒 DNA。将提取的质粒 B am H I酶切后 , 0. 5%琼
脂糖凝胶电泳分析。
1. 7　文库筛选
对 Israel等 [ 6 ]和徐军望等 [ 7 ]筛选噬菌体文库的
方法进行改进。利用已知的 zpsA基因片段 (基因登
录号 : DQ008590)设计一对特异引物。
S473: 5′2CTG TTC ACC TCG GGG TCC AC23′
R806: 5′2ACC TCC AGC ACC CCC GCA C23′
PCR反应体系 : 1 μl文库菌液 ; 10 μmol/L 的
正、反向引物各 0. 5μl; 12. 5μl 2 ×EasyTaq PCR Su2
perM ix;补水至 25μl。反应条件 : 96℃预变性 2 m in;
94℃ 1 m in, 57℃ 1 m in, 72℃ 1 m in 30 s; 32个循环 ;
72℃延伸 10 m in。同时设置不加模板的阴性对照和
加入 10 ng基因组 DNA作为模板的阳性对照。
利用建立的 PCR条件 ,通过改变加入菌体的数
目 ( PCR模板 )来定量文库中目标基因的丰度 ,能产
生 PCR产物的菌体最小数目就是试验确定的目标
基因在扩增文库中的丰度。
96孔深孔板筛选 :取含有一个或两个目的基因
拷贝的文库菌液 ,加入到含有 10 μg/m l G418 的
8 m l LB液体培养基中 ,混合均匀 ,按 8 ×8矩阵分装
到 96孔深孔板中 ,每孔 100μl,胶粘密封膜封口。
37℃, 220 r/m in振荡培养 16 h。使用合并法进行
PCR扩增及分析 ,即横向 8行 8孔各取 5μl菌液混
合后取 1μl作为 PCR模板 ,纵向 8列 8孔各取 5μl
液混合后取 1μl作为 PCR模板 ,基于 8行和 8列共
16个 PCR结果初步定位阳性孔。再对阳性孔所在
的行与列的 8个孔重复进行 PCR,根据 PCR结果精
确定位阳性孔。第二轮 96孔深孔板筛选 :确定阳性
孔中菌体浓度 ,用其中约为上一轮 1 /20的菌体数
量 ,开始下一轮的筛选 ,方法同第一轮。经过 5轮筛
选 ,将目的基因得到富集的阳性孔中的菌液按梯度
稀释 ,分别涂布在含有 10μg/m l G418抗生素的 LB
平板上 ,随机挑取一定数量菌落进行菌体 PCR。
对筛选得到阳性菌株提取质粒 ,以此质粒 DNA
为模板进行 PCR,对 PCR产物进行测序 ,验证阳性
菌株的正确性。
2　结果与分析
2. 1　粘粒文库的构建
利用脉冲场电泳 ,确定了限制酶 Sau3A I酶切基
因组 DNA的最佳条件为 0. 05个酶单位 /μg DNA。
本研究获得了共 500μl原始文库液 ,效价达到 4. 21
×106 CFU /m l。经转染、涂布后理论上可挑取到 2 ×
106个克隆 ,说明具有较高的库容量。
根据 Maniatis公式 N = l n ( 1 - P) / l n [ 1 -
( I /G) ], N 为转化子数 , P为基因组覆盖率 , I为克
隆片段的平均大小 , G为基因组大小。以 I = 35 kb,
G = 8 ×103 kb, N = 1 ×105计算 ,本研究构建的基因
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文库覆盖率 ( P)大于 99. 9999%以上。
2. 2　粘粒文库的质量鉴定
随机挑取 12个粘粒克隆 ,分别小量提取粘粒
DNA , B am H I酶切 ,凝胶电泳分析 (图 2)。根据电泳
图谱加合片段的长度 ,可以估算出 12个粘粒中均含
有 30～40 kb的插入片段 ,与预期相符 ,文库达到了
进一步研究的质量要求。
M1. DNA Marker IV; M2.λDNA2H ind IIID igest DNA Marker
图 2　B am H I酶切 12个粘粒 D NA的电泳图
2. 3　文库中目标基因丰度的确定
PCR筛选文库是一个逐级缩小筛选范围的过
程 ,在直接筛选之前 ,需确定含有目的基因的菌体量
下限 ,即目标基因在文库中的丰度。本研究所用扩
增粘粒文库滴度为 4 ×107 CFU /m l,以不同体积原始
扩增文库液及各种稀释度的文库液为模板进行
PCR,结果发现以 4μl原始扩增文库菌液为模板进
行 PCR时 ,可以扩增出目的条带 ,因此确定筛选中
生菌素生物合成基因所需要的最少菌体数为 1. 6 ×
105 CFU /mL,并以此作为 96孔板筛选的起始浓度。
2. 4　利用 PCR方法从粘粒文库中筛选中生菌素生
物合成基因簇
通过改进的 96深孔板 PCR方法筛选本研究所
构建的粘粒文库 ,第 1轮筛选行、列 PCR结果显示 ,
7、8二列为阳性列 , B、G两行为阳性行。对这两行
和两列的 32孔做 PCR鉴定 ,表明 B6、G7为阳性孔。
第 2轮时 ,取阳性孔 B6的 1 /100稀释液 1μl进行
下一轮筛选 ,并确定第 2轮的阳性孔。重复上述步
骤 ,第 5轮 H阳性行的 PCR鉴定说明阳性亚库中的
目的基因得到较大富集 ,其中 H1和 H2阳性孔的菌
体 PCR亮度与对照相近。每一轮筛选的 PCR鉴定
结果如图 3所示。
Ⅰ2Ⅴ. 第 1轮至第 5轮筛选行、列 PCR检测结果 ;每张电泳图中第 1至第 8, A～H分别为 8个行、列组的泳道 ,
9泳道为阳性对照 , 10泳道为阴性对照 ,M为 DL2000 Marker; Ⅴ2H. 第 5轮 H阳性行 PCR检测结果 , 1为阳性
对照 , 2至 9为 H行 8个组的泳道
图 3　基于 PCR技术的文库筛选过程
　　经过 5轮筛选 ,对随机挑取的 20单菌落个进行
菌体 PCR,得到 4个阳性克隆。分别提取 4个阳性
菌株的质粒 DNA,以之为模板进行 PCR。测序结果
表明 , 4个质粒上都含有 zpsA 基因的 DNA片段 ,说
明 4株阳性菌株中所携带的插入片段可能与中生菌
素生物合成相关。利用 B am H I、EcoR I酶切分析 4
个阳性菌株质粒 DNA ,结果表明这 4个菌株可能携
带的是同一个粘粒。
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3　讨论
3. 1　链丝菌素族抗生素生物合成基因克隆与文库
构建
在链丝菌素族抗生素的生物合成基因研究中 ,
已克隆到了一些与链丝菌素、诺尔丝菌素和中生菌
素生物合成相关的基因 [ 8, 9 ]。其中关键合成酶基因
npsA与 sttA 的核苷酸序列具有 77. 64%的相似性 ,
所编码产物的氨基酸序列具有 95 %的相似性 [ 3, 10 ]。
然而 ,链霉菌基因组 DNA 的 G/C 含量高达
70%以上 ,尤其是密码子第 3位的 G/C含量更高达
90%以上 [ 11, 12 ] ,高 G/C含量导致基因组 DNA通常
难以用常规的 PCR反应来扩增。在中生菌素生物
合成基因 zpsA的克隆中就反应出这一点 [ 3 ]。因此 ,
虽然已克隆到的链丝菌素族抗生素的生物合成基因
之间具有较高的相似性 ,但却难以使用 PCR的方法
来克隆中生菌素生物合成基因全序列。由于抗生素
的生物合成基因、抗性基因和调节基因通常连锁在
一起成簇排列 ,因此可以从基因组文库中筛选分离
单个基因 ,甚至是整个生物合成基因簇。以粘粒
pOJ446为载体 ,构建了淡紫灰链霉菌海南变种 (S.
lavendu lae var. hainanensis) B - 7 菌株在大肠杆菌
XL 12B lue MRF’的基因组文库 ,插入外源片段的大
小为 30～40 kb,包装粘粒的效价是 4. 21 ×106 CFU /
m l。基因文库的构建为克隆中生菌素生物合成基因
簇奠定了基础 ,通过基因功能的研究 ,进一步在分子
水平上定向改变菌株的次级代谢途径 ,得到高产或
高活性产物的菌株 ,提高中生菌素的效价 ,降低其生
产成本 ,使之得到更广泛的推广使用。
3. 2　基于 PCR的文库筛选方法
基于 PCR的文库筛选方法是传统的杂交筛选
文库方法的一种很好的替代方式 ,此方法适用于
cDNA文库、基因组文库以及 YAC文库等筛选工
作 [ 13～15 ]。这种方法的优点在于它的速度、灵敏度
和简易性 ,且不需要使用同位素 [ 16 ]。
本研究对 Israel等 [ 6 ]和徐军望等 [ 7 ]筛选噬菌体
文库的方法进行了改进 ,文库扩增后 ,滴度升高 ,虽
然扩增不会引起克隆丢失 ,但因每个克隆扩增速度
快慢不一 ,却造成了文库克隆多少的严重不均一 ,这
样 ,随着 PCR筛选进行 ,目的基因可能在筛选中丢
失。直接用 PCR技术筛选文库中的中生菌素生物
合成基因时 ,就多次出现目的克隆丢失现象。这个
问题可以通过延长含粘粒细菌在多孔板上的培养时
间 (约为 16 h)和选用 96深孔板等办法来解决 ,这
样可以确保 PCR过程中细菌的数目足够多 ,从而在
PCR反应中可以代表文库中的所有克隆。
与以往的研究不同 ,由于本试验所选用的 PCR
引物具有很高的特异性 ,因此直接选用细菌培养液
作为模板进行菌体 PCR。从总的试验效果来看 ,菌
体 PCR能够有效准确地筛选出阳性克隆 ,省去了中
间提取 DNA的步骤 ,大大提高了文库筛选的速率。
所有筛选的操作只需要 15 d左右的时间、5块 96孔
深孔板和 100多个 PCR反应 ,成功率高。因此 ,改
进后的这种针对粘粒文库的筛选方法可以提高工作
效率 ,节约试验成本 ,非常适用于后期中生菌素生物
合成基因簇克隆的工作。
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