全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因在
大肠杆菌中的表达
隋姗姗 马江锋 侯顾伟 奚永兰 姜岷
(南京工业大学生物与制药工程学院 材料与化学工程国家重点实验室,南京 210009 )
摘 要: 以肠膜明串珠菌基因组 DNA为模板, 通过 PCR扩增得到 1 581 bp的蔗糖磷酸化酶 ( SPase) DNA片段。将该基
因克隆到表达载体 pET22b(+ )上, 构建获得重组质粒 pETSPase。测序结果与 GenBank上已公布的基因序列比较, 有 1个碱
基发生变化, 但该碱基的改变未引起氨基酸序列的改变。将 pETSPase转化到 Escher ich ia co li Rosetta( DE3)感受态中, IPTG诱
导表达后进行 SDSPAGE分析,目的蛋白条带约为 55 kD, 与预期大小一致, 结果表明 SPase基因在大肠杆菌中进行了表达。
酶活分析, 产物的比活为 1 8 U /mg, 证明了表达产物具有预期的酶活性。进一步考察了 IPTG浓度、诱导温度和时间等因素对
重组菌表达的蔗糖磷酸化酶的影响。在优化条件下,该蔗糖磷酸化酶的比活可以达到 16 6 U /mg,比优化表达条件前的酶比
活提高了 92倍,比已报道的肠膜明串珠菌粗酶液比活 ( 7 1 U /m g)提高了 234倍。
关键词: 蔗糖磷酸化酶 肠膜明串珠菌 基因克隆 原核表达
Expression of Sucrose Phosphorylase Gene from Leuconostoc
mesenteroides inEscherichia coli
Sui Shanshan M a Jiangfeng H ou Guwei X iYonglan J iangM in
( StateK ey Laboratory of M ater ialsO riented Chem ical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Eng ineering,
Nanjing University of T echnology, N anjing 210009)
Abstrac:t The Spaseencoding gene was amp lified from Leuconos toc m esen teroid es genom e DNA using PCR techn ique, and the
PCR product w as approx im ate ly 1 581 bp DNA segm ent. P lasm id sequenc ing show ed that one base was d ifferent from the sequence an
nounced in G enBank but d id not change the am ino ac id sequence. The constructed recomb inant plasm id w as transfo rm ed toE scherichia
co li Rosetta( DE3) by heat shock m ethod and expressed unde r induction o f IPTG. The result showed that the c loned SPase w ith m olecu
larw e ight 55 kD and spec ific enzym e activ ity 1 8 U /m g was expressed in Rose tta. The influences of induction cond itions such as IPTG
concentration, induc tion temperature and tim e o f induction on the expression o f the recom binant prote in w ere investiga ted. Under optim a l
cond ition, the spec ific enzym e activ ity cou ld reach 166 U /mg, wh ich is 92 tim es h ighe r than that of prim ary expression condition, and
2 34 tim es h igher than that o f sucrose phospho ry lase( 71 U /m g) tha t has been repo rted a lready.
Key words: Sucrose phosphory lase Leuconostoc m esentero ides Gene clon ing P rokaryo tic expression
收稿日期: 20101108
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 21076105) , 十一五 国家科技支撑计划重大项目 ( 2008BA I63B07)
作者简介:隋姗姗,女,硕士,研究方向:工业微生物; Ema i:l su ishanshan33@ 163. com
通讯作者:姜岷,男,教授, Em ai:l b ioeng ine@ n ju t. edu. cn
蔗糖磷酸化酶 ( EC 2417, sucrose phosphory l
ase, SPase)是一种催化转移葡萄糖苷键的特异性
酶,属于糖基水解酶 13家族 [ 1 ]。该酶主要催化蔗糖
中的葡萄糖基转移至受体, 受体包括无机磷酸、水、
含酚羟基、醇羟基及羧基的物质, 如以磷酸为受体,
可生成 1磷酸葡萄糖和 D果糖 [ 2 ]。
应用该催化特性,蔗糖磷酸化酶可以修饰改造
含有醇羟基、酚羟基及羧基的化合物。如催化氢醌
合成熊果苷 [ 3] , 消除了氢醌作为美白添加剂的毒副
作用, 成为 21世纪最有竞争力的美白添加剂 [ 4] ;
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
Shin等 [ 5]利用蔗糖磷酸化酶修饰咖啡酸, 合成咖啡
酸葡萄糖苷,增加了它的水溶性和化学稳定性,使其
应用大大增加; N omura等 [ 6 ]利用蔗糖磷酸化酶将乙
酸糖基化, 乙酸的酸味降低了约 100倍; Sug imoto
等 [ 7]将苯甲酸糖基化, 使其在原料药和添加剂中具
有较好的应用前景。蔗糖磷酸化酶还可以催化合成
某些不稳定物质的衍生物, 提高其稳定性 [ 8 ] ,例如,
抗坏血酸 (VC)具有 1位羟基与 2, 3位醇,性质活泼
易受光、热、氧、湿度及金属离子的影响而遭到破
坏 [ 9] ; Kw on等 [ 10]利用蔗糖磷酸化酶的转糖基作用
将葡糖基转移到 VC上, 所形成的衍生物不仅提高
了稳定性,同时更加大了水溶性。因此,蔗糖磷酸化
酶在食品、化妆品及医药行业有广泛的应用价值,国
内外市场需求较大。
目前该酶的生产水平较低, 国外主要是日韩等
国对此酶有较深入的研究, 国内对蔗糖磷酸化酶的
研究报告基本是空白, 因此亟待筛选高产该酶的菌
株或者利用分子生物学手段构建酶活力高、稳定性
好的蔗糖磷酸化酶工程菌株。L euconostoc mesen te
ro ides ATCC 12291是目前报道产 SPase最高的菌
株 [ 8] ,本研究选用在 E. coil中具有高表达水平的
pET表达系统,从肠膜明串珠菌 ( Leucono stoc m esen
teroides)克隆了 SPase基因, 构建 pETSPase原核表
达系统,并对发酵产酶条件在诱导剂添加量、诱导温
度及时间等进行初步优化, 优化后酶产量提高 92
倍,达到现有报道的先进水平, 为蔗糖磷酸化酶的工
业化生产奠定了试验基础。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株与质粒 质粒 pET22b(+ )购自 N ova
gen公司; 菌株 E. coli Rosetta ( DE3)由本实验室保
存;肠膜明串珠菌使用模式菌株 ATCC 12291。
112 主要试剂 异丙基硫代D半乳糖苷
( IPTG )购于 B ioDev公司; 限制性内切酶 Xba I、H in d
、E coT14 I d igest DNA M arker、T4 DNA连接酶均
购于 TaK aRa公司; 小量胶回收试剂盒、质粒提取试
剂盒购于 B iom iga公司; PCR引物由英潍捷基 (上
海 )贸易有限公司合成; 其余试剂和药品均为进口
或国产分析纯。
113 培养基 LB培养基 ( g /L) :蛋白胨 10, 酵母
粉 5, N aC l 5。SOC培养基: 20 g /L蛋白胨, 5 g /L酵
母粉, 05g /L N aC ,l 25 mmo l /L KC ,l 10 mmo l/L
M gC ,l 20 mmo l/L葡萄糖。
12 方法
121 引物设计及蔗糖磷酸化酶的克隆 根据 Gen
Bank上公布的 Leuconostoc mesenteroides ATCC12291蔗
糖磷酸化酶的基因序列 ( GenBank登录号 D903141),
设计扩增 SPase基因的两条引物: P1: 5GCTCTAGA tt
gggattag tactgctcattatcg3; P2: 5CCCAAGCTTccctcag
gaaacagttcttagaaat3。在 P1、P2的 5端分别引入Xba I、
H ind III限制性酶切位点 (下划线标出 ),并加入保护碱
基。预计可扩增出长度为 1 581 bp的基因片段。引物
由英潍捷基 (上海 )贸易有限公司合成。
从肠膜明串珠菌细胞菌悬液中提取基因组 DNA
作为模板,利用上述合成的引物进行 PCR扩增。PCR
反应程序: 94 预变性 5m in, 94 变性 45 s, 54 退火
45 s, 72 延伸 90 s, 35个循环。
122 重组表达质粒的构建和测序 PCR产物和质
粒 pET22b(+ )分别进行Xba I/H ind III双酶切,胶回收
纯化双酶切产物。将纯化的 DNA片段和线性化的
pET22b(+ )载体用 T4DNA连接酶 16 连接过夜。参
考文献 [ 11]将重组质粒转化入 E. coli Rosetta( DE3)感
受态中。筛选阳性克隆,参考试剂盒说明书提取重组
质粒,菌落 PCR[ 12]及双酶切鉴定并测序 (英潍捷基 (上
海 )贸易有限公司 )。鉴定正确的重组质粒命名为
pETSPase。通过 Blast搜索对测序结果进行分析。
123 蔗糖磷酸化酶粗酶液制备 挑取重组菌 E. coli
Rosetta( DE3) /pETSPase单菌落接种 5mL含氨苄青
霉素 50mg /L的 LB液体培养基, 37 , 200 r/m in过夜
培养后,按 1%接种量接种至新鲜 50mL LB培养基中,
37 , 200 r/m in培养至 OD600到 06- 08时,加入诱导
剂 IPTG诱导一定时间。
菌液离心 ( 4 , 8 000 r /m in, 15m in),弃上清,沉淀
用缓冲液 ( 10mmo l/L磷酸钾缓冲 pH65)洗两次后,超
声破碎 ( 200- 400W,超声 3 s,间歇 5 s, 总共 2m in),
4 , 10 000 r/m in离心 15 m in。取上清液测定蔗糖磷
酸化酶的酶活。
124 SDSPAGE蛋白分析 取 SPase粗酶液进行
SDSPAGE分析。采用 4 g /dL的浓缩胶, 125 g /dL的
分离胶,电泳后凝胶用考马斯亮蓝 R250染色。以未诱
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2011年第 5期 隋姗姗等:肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因在大肠杆菌中的表达
导菌液及 E. coli Rosetta(DE3)菌液破碎离心后的上清
液作为空白对照。
125 蔗糖磷酸化酶活力测定 取上清 20 L, 加
入到 335 mL反应体系中 ( 15 mL 磷酸缓冲
pH65, 15 mL 蔗 糖, 30 L EDTA, 100 L
NADP
+
, 100 L葡萄糖 1, 6二磷酸, 50 L M gC l2,
20 L 葡萄糖磷酸变位酶, 10 L 6磷酸葡萄糖
脱氢酶 ) , 反应体系 25 水浴平衡 5 m in, 立即在
340 nm处测定 NADPH吸光值的变化 [ 13]。酶活定
义为每毫升反应液每分钟生成 1 mo lNADPH所
需要的酶量。
蛋白质含量测定采用 B radfo rd法 [ 14] ,以牛血清
白蛋白 BSA为标准品。蔗糖磷酸化酶比活定义为
每 mg粗酶液蛋白质的酶活。
2 结果与分析
21 SPase基因的克隆与序列分析
按照 121的方法扩增 SPase基因, PCR产物
经琼脂糖凝胶电泳检测在 1 600 bp左右有一明显条
带 (图 1), 与预计结果一致。经测序分析, 插入的
SPase基因片段与 GenBank ( No. D903141 )中已报
道的基因序列相似性为 9994%, ORF的第 756个
碱基不同,报道的碱基为 T, 测序结果为 C, 但并未
引起氨基酸序列的改变。
图 1 SPase基因 PCR扩增产物
22 重组表达质粒的构建和鉴定
根据方法 122构建表达载体, Xba I /H in d III
双酶切鉴定图 2所示, pETSPase在 1 600 bp左右
比空载体 pET22b(+ )和 E. coli Rosetta( DE3)多出
一条带, 与插入的外源基因 SPase大小一致, 表明
成功的构建出阳性 pETSPase原核重组表达质粒。
1. pET22b (+ ) ; 2. pETSPase /X ba I; 3. pETSPase/X ba I
+H ind III; M. M ark er
图 2 pETSPase重组质粒的双酶切验证
23 蔗糖磷酸化酶的诱导表达和 SDSPAGE分析
重组菌 pETSPase /Rose tta( DE3)经 05mmo l/L
IPTG于 30 诱导表达 5 h之后的蔗糖磷酸化酶比
活为 18 U /mg,而空宿主不存在蔗糖磷酸化酶酶
活,未经诱导的重组菌本底表达也非常低。 SDS
PAGE电泳结果见图 3, 重组菌经 IPTG诱导表达之
后在 55 kD左右处有明显的融合蛋白条带,与预期
结果一致, Rosetta( DE3 )菌和含 pET22b( + )空质
粒的 Rosetta( DE3)菌中未见此蛋白表达。根据测
定比活和 SDSPAGE的结果, 表明 SPase在重组
Rosetta( DE3) /pETSPase中得到了成功表达。
M.蛋白质分子量标准; 1. Rosetta( DE3)表达的总蛋白;
2.未经 ITPG诱导的融合蛋白 Rosetta( DE3 ) /pETSpas;
3.经 IPTG诱导的融合蛋白 Roset ta( DE3 ) /pETSPase
图 3 pETSPase的 SDSPAGE电泳图谱
24 诱导条件的优化
通过对诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间的
进一步研究,优化了基因工程菌的表达条件。
241 诱导温度的优化 按方法 123接种重组
菌, 加入 IPTG后分别在 20、25、30和 35 下诱导 10
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
h。结果 (图 4)显示, 25 诱导 SPase的比活最高。
可能原因是低温条件下有利于蛋白质的正确折叠,
减少包涵体的产生。
图 4 诱导温度对表达的影响
242 诱导剂浓度的优化 按方法 123接种重
组菌, 分别加入 IPTG至终浓度 01、03、05、07、
09以及 11 mmo l/L, 25 诱导 10 h。结果 (图 5)
显示,加入 01 mmo l/L IPTG时菌体密度较高, 表达
蔗糖磷酸化酶的比活最大, 为 1606 U /mg, 随着
IPTG浓度的增加, SPase的比活略有降低,因此低浓
度的 IPTG即可有较好的诱导效果;且 IPTG价格昂
贵,控制好 IPTG的浓度是非常必要的。
图 5 IPTG浓度对菌体生长和表达量的影响
243 IPTG诱导时间的优化 按方法 123接种
重组菌,加入 IPTG至终浓度 01 mmo l/L, 25 , 分
别诱导 4、6、8、10、12、14及 16 h。如图 6所示, 加入
IPTG诱导 10- 14 h, SPase比活达到最高,延长诱导
时间并没有提高比活。这有可能是在诱导过程中,
发酵液里存在着一些使表达的重组蛋白降解的因
素,如蛋白酶的降解、pH变化的影响等, 从而产生酶
活在诱导时间超过 14 h后酶活反而下降的现象, 还
有可能是随着外源蛋白的大量积累, 不能折叠成有
活性的目的蛋白 [ 15]。
图 6 IPTG诱导时间对表达的影响
经表达条件的优化, 在 250mL摇瓶中, 25 用
01 mmo l/L的 IPTG诱导 10 h, 重组菌的蔗糖磷酸
化酶酶活可达 166U /mg。
3 讨论
蔗糖磷酸化酶在化妆品、食品及医疗保健等方
面具有广泛的应用,目前关于蔗糖磷酸化酶蛋白基
因的克隆及在大肠杆菌中表达的研究国内少有报
道。国外特别是日韩国家关于基因工程菌表达产
SPase的研究较早, 但我国大部分仍停留在野生菌
菌株筛选及产酶条件优化等方面, 产酶工艺成本偏
高, 缺乏对酶在分子水平上的了解和研究,使得目前
该酶主要依赖进口。
本研究以肠膜明串珠菌基因组 DNA为模板
PCR扩增 SPase基因, 通过序列测定及 DNAstar分
析发现,所克隆的目的基因序列与 Leuconostoc mes
enteroides ATCC12291的 SPase基因序列的同源性为
9994%,氨基酸序列的同源性为 100%。选用 pET
22b(+ )为表达载体, 构建了高效原核表达重组质
粒。对重组菌进行诱导表达, 结果发现, 诱导剂
IPTG的用量、诱导温度和诱导时间等对蔗糖磷酸化
酶的表达都有较大影响。在优化表达条件下, 蔗糖
磷酸化酶的比活可达 166 U /mg。
在本试验过程中发现, IPTG、诱导温度和时间
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对酶表达量都有较大的影响。 IPTG浓度与 SPase
表达量并不成正比关系, IPTG对细胞有毒性,高浓
度的 IPTG反而抑制菌体的生长。诱导表达时期温
度的升高使蛋白分泌过快, 从而不能正确折叠形成
包涵体,但是温度低于 25 时, 菌体生长缓慢, 表达
量亦不理想。当诱导培养 14 h后, 菌体进入衰亡
期, pH降低, 发生自溶现象, 释放蛋白酶, 也使酶活
受到影响。
本研究选用的载体 pET22b (+ )具有组氨酸纯
化标签,表达的目的蛋白 C端带有 6H is序列, 方便
用 N iNTA亲和层析柱进行蛋白的亲和纯化, 特异
性高, 为后续酶性质和分离的研究提供了方便快捷
的基础。
pET系列载体具有乳糖操纵子, 非代谢性乳糖
类似物 IPTG是一种广泛使用的高效乳糖操纵子的
诱导剂,但其价格昂贵对人体存在潜在的毒性。乳
糖无毒且廉价,是乳糖操纵的天然底物,同时乳糖本
身作为一种碳源, 可以不断被细菌代谢利用。乳清
粉是生产干酪或干酪素时用酶或酸把牛奶中的酪蛋
白凝固分离后剩下的副产品,主要成分是乳糖,其作
为重组大肠杆菌的诱导剂方面并未引起太多的关
注,因此用乳清粉作为诱导剂, 对日后生物制剂的规
模化工艺生产具有重要意义。
蔗糖磷酸化酶重组工程菌的成功构建, 为下一
步研究利用工业废弃物乳清粉诱导表达 SPase提供
了基础,亦为蔗糖磷酸化酶的工业化生产提供了试
验基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠 )
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