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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
人 β-酪蛋白 GAS基序荧光素酶报告
基因载体的构建与鉴定
员月明 李弘剑
(暨南大学生命科学与技术学院，广州 510632)
摘 要: 构建人 β-酪蛋白 GAS基序荧光素酶报告基因表达载体。合成 3 个连续重复的人 β-酪蛋白启动子中干扰素 γ
活化序列(gamma-activated sequence，GAS)并将其克隆至 pGL3-Promoter荧光素酶报告基因载体。测序鉴定构建的载体，然后
将其转染入人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts，HELF)中检测荧光素酶的表达活性。测序结果表明，3 × GAS
序列正确;双报告基因系统检测荧光素酶活性表明，构建的报告基因具有启动子活性。成功构建的人 β-酪蛋白 GAS基序荧光
素酶报告基因表达载体，为进一步研究干扰素 γ诱导的 JAK-STAT信号通路提供了必要的试验材料。
关键词: β-酪蛋白 GAS基序 荧光素酶 报告基因
Construction and Identification of Humanβ-casein GAS Motif
Luciferase Reporter Gene Vector
Yuan Yueming Li Hongjian
(Department of Bioengineering，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632)
Abstract: It was to construct the luciferase reporter gene vector of human β-casein GAS motif． Three duplicates of gamma-activa-
ted sequence (GAS)of human β-casein promoter was made，which was cloned into pGL3-Promoter luciferase reporter gene vector． The
constructed vector was confirmed by sequencing and then transfected into human embryonic lung fibroblasts (HELF)to detect lucifer-
ase activity． The sequencing result indicated that the 3 × GAS sequence was correct，and the luciferase activity by Dual-Luciferase Re-
porter Assay System demonstrated that the constructed vector displayed the promoter activity． The human β-casein GAS motif luciferase
reporter gene vector was successfully constructed，which would play an important role of the IFN-γ induced JAK-STAT signaling path-
way in further study．
Key words: β-casein GAS motifs Luciferase Reporter gene
收稿日期:2011-06-08
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30770106)
作者简介:员月明，女，硕士研究生，研究方向:分子微生物;E-mail:yunyueming0801@ 163． com
通讯作者:李弘剑，女，教授，博士生导师，研究方向:病毒分子生物学，基因工程药物改造等;E-mail:tlihj@ jnu． edu． cn
β-酪蛋白启动子是目前研究较多的一种乳蛋白
启动子，具有较强的启动外源基因表达的能力［1］。
在不同的激素和细胞因子作用下，β-酪蛋白启动子
能招募多种转录因子［2］，即有许多转录因子结合的
基序。例如，GAS (gamma-activated sequence)基序
是信号传导及转录激活因子(Signal transducers and
activators of transcription，STAT)的结合位点。GAS
是干扰素 γ通过 JAK-STAT信号传导通路激活目标
基因表达的重要启动子［3］。为了深入研究干扰素 γ
诱导的 JAK-STAT 信号传导通路，本研究拟构建人
的 β-酪蛋白 GAS基序荧光素酶报告基因表达载体，
并通过细胞内荧光素酶活性的检测，以期证明所构
建的报告基因载体的有效性。
1 材料与方法
1． 1 材料
Fast Pfu酶购自 TransGen公司;KpnⅠ、BglⅡ限
制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司;
DL5000、DS5000 DNA Marker 购自广州东盛生物科
2011 年第 10 期 员月明等:人 β-酪蛋白 GAS基序荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定
技有限公司;凝胶回收和质粒抽提试剂盒购自 Ome-
ga公司;质粒载体 pGL3-Promoter、pRL-TK、双荧光
素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase Reporter
Assay System)购自美国 Promega 公司;大肠杆菌
JM109、细胞 HELF为本试验保存。
1． 2 方法
1． 2． 1 3 × GAS 单链序列的化学合成 根据 GAS
位点的序列特征(TTCNNNGAA 和 TCCNNNGAA) ，
在 GenBank中人类 β-酪蛋白基因(基因 ID:1447)
上游启动子区找出相应的 GAS 序列:AATTCTGT-
GAAGAAAG。设计合成带有黏性末端酶切位点的 3
个连续重复的 GAS序列(3 × GAS 下划线部分) ，正
向链:CAATTCTGTGAAGAAAGAATTCTGTGAAGAA-
AGAATTCTGTGAAGAAAGA(斜体为 KpnⅠ酶切位点
的 接 头) ，反 向 链:GATCTCTTTCTTCACAGAAT-
TCTTTCTTCACAGAAT-TCTTTCTTCACAGAATTGG-
TAC(斜体为 BglⅡ酶切位点的接头) ，由上海生工生
物工程公司合成。
1． 2． 2 双链目的片段的形成 将化学合成的 3 ×
GAS两条单链退火成双链。各加 20 μL 工作浓度
(10 μmol /L)的 3 × GAS 正向链和反向链，混匀，
94℃加热 5 min，然后缓慢冷却至室温。取 20 μL产
物琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1． 2． 3 目的片段与 pGL3-Promoter质粒载体的连接
与鉴定 将荧光素酶报告基因载体 pGL3-Promoter
(含启动子，不含增强子)用 KpnⅠ /BglⅡ双酶切，双
酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后回收。取 1. 2. 2
中 3 × GAS双链目的片段 6 μL、双酶切的 pGL3-Pro-
moter质粒载体 2 μL、T4 DNA 连接酶 1 μL、10 ×连
接 buffer 1 μL(总连接体系为 10 μL) ，混匀，16℃连
接过夜，将连接液转化至感受态 JM109 菌株中，涂
布平板 37℃培养过夜。同时做阴性对照，取双蒸水
6 μL、双酶切的 pGL3-Promoter 质粒载体 2 μL、T4
DNA连接酶 1 μL、10 ×连接 buffer 1 μL(总连接体
系为 10 μL) ，混匀，16℃连接过夜，将连接液转化至
感受态 JM109 菌株中，涂布平板 37℃培养过夜。随
机挑选可能的阳性克隆和阴性对照菌落，培养约
12 h后，提取质粒 DNA作为模板，PCR 鉴定;由于目
的片段较小，为 48 bp，很难双酶切鉴定，故 PCR 鉴
定后直接送北京六合华大基因科技股份有限公司测
序，以验证所构建的荧光素酶报告基因载体是否与
预期相符。PCR鉴定和测序用引物序列:RV primer
3:CTAGCAAAATAGGCTGTCCC，GL primer 2:CTT-
TATGTTTTTGGCGTCTTCCA。
1． 2． 4 人 β-酪蛋白报告基因转染细胞后荧光素酶
表达活性的测定 分别将 pGL3-Promoter 质粒 0． 8
μg和构建的 pGL3-Promoter-3 × GAS质粒 0． 8 μg 转
入培养的 HELF 细胞中，同时转染入 0． 01 μg 的
pRL-TK荧光素酶表达质粒作为内参，12 h 后，用干
扰素 γ做处理和不处理，转染 24 h 后收集细胞，用
配制好的 Passive Lysis Buffer裂解细胞，使用双荧光
素酶报告基因检测系统测定荧光值。
2 结果
2． 1 双链目的片段电泳结果
3 × GAS两条单链退火形成的双链，经 2%琼脂
糖电泳，结果见图 1。得到的双链产物采用紫外分
光光度计测定浓度为 0． 43 μg /μL。
1． DL5000 DNA Marker;2．双链 3 × GAS
图 1 双链 3 × GAS琼脂糖凝胶电泳鉴定
2． 2 双酶切结果
荧光素酶报告基因载体 pGL3-Promoter 用 KpnⅠ/
BglⅡ双酶切，双酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，结
果见图 2。凝胶回收双酶切后的产物，测得其浓度
为 62． 4 ng /μL。
1． DL5000 DNA Marker;2． 载体 pGL3-Promoter KpnⅠ /
BglⅡ双酶切;3．载体 pGL3-Promoter
图 2 载体 pGL3-Promoter双酶切
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2． 3 PCR鉴定结果
随机挑选 3 个可能的阳性克隆，1 个对照菌落，
培养约 12 h 后，提取质粒 DNA 作为模板，PCR 鉴
定，鉴定结果见图 3，3 个克隆均为阳性。将 1 号阳
性克隆送至北京六合华大基因科技股份有限公司测
序，测序结果见图 4，表明所构建的荧光素酶报告基
因载体与预期相符。
1． DS 5000 DNA Marker;2． 阴性对照，以空载体 pGL3-
Promoter为模板 PCR;3 －5．阳性克隆，以重组质粒 pGL3-
Promoter-3 × GAS为模板 PCR
图 3 重组质粒 PCR鉴定
2． 4 人 β-酪蛋白报告基因转染细胞后荧光素酶的
表达
将 pGL3-Promoter 质粒和构建的 pGL3-Promot-
er-3 × GAS 质粒分别转染 HELF 细胞后，同时用干
扰素 γ做处理和不处理，荧光素酶的表达结果(图
5)显示，当用干扰素 γ 处理 12 h 后，构建的 pGL3-
Promoter-3 × GAS质粒转染组比 pGL3-Promoter 空质
粒转染组的荧光素酶活性高 4． 7 倍，说明 3 × GAS
已经准确插入到荧光素酶基因的上游，并在细胞内
启动了荧光素酶基因的表达。
3 讨论
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的
基因，是一个表达产物较容易被鉴定的基因。报告
基因常用于测定启动子对基因表达的影响及其与反
式作用因子的相互作用，即将所研究的目的基因调
控序列克隆到含有报告基因的表达质粒中，然后将
重组质粒导入适当的细胞，通过测定报告基因表达
的水平，间接地评价在调控序列指导下对基因表达
的诱导作用［4 － 7］。荧光素酶是能够催化不同底物
图 4 重组载体 pGL3-Promoter-3 × GAS测序结果
图 5 重组质粒 pGL3-Promoter-3 × GAS的转录激活作用
氧化发光的一类酶，具有灵敏度高，在哺乳细胞中没
有本底和方便检测等优点，已被广泛应用于基因表
达调控的研究中。
本研究采用化学合成法得到人的 β-酪蛋白3 ×
GAS两条单链序列，并退火形成双链，将其克隆到
空载体 pGL3-Promoter 的多克隆位点(multiple clo-
ning site，MCS)中，其下游为荧光素酶的表达序列，
成功地构建了人的 β-酪蛋白荧光素酶报告基因表
达载体。该载体的特点是在其 MCS 下游有萤火虫
荧光素酶基因，它的表达受顺式作用元件和反式作
用因子的影响。通过加入荧光素酶的底物可以检测
其活性，反映其表达量，从而间接地反映顺式作用元
件和反式作用因子的调节功能。
本研究利用双荧光素酶报告基因检测系统
(Dual-Luciferase Reporter Assay System)来检测人
的 β-酪蛋白荧光素酶报告基因的表达活性。该系
统可以在单管中进行双荧光素酶报告基因的检
测［8］，较为快速、灵敏、简便。萤火虫荧光素酶是一
个 61 kD单亚基蛋白质，海肾荧光素酶是一个 36 kD
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单亚基蛋白质，虽然荧火虫和海肾荧光素酶都具有
生物发光报告基因的卓越检测特点，但它们具有完
全不同的进化起源，因而它们的酶结构和底物要求
完全不同。利用这些差别发展的 DLR 检测法，选择
性地区别这两种发光报告基因的活性。在用萤火虫
荧光素酶定量基因表达时，通常采用海肾报告基因
(内参)来减少试验误差。通过这种方法，把可能削
弱试验准确性的内在因素的变化降到最小，这些内
在因素包括培养细胞的数目和健康状况的差别，细
胞转染和裂解效率的差别等。在 DLR 检测系统中，
萤火虫和海肾荧光素酶的活性是从同一裂解液中分
步测量的。在完成萤火虫荧光素酶活性的测量后，
萤火虫荧光被快速淬灭，并在这同时激活海肾荧光
素酶的荧光反应，测得其活性。然后计算二者的比
值，排除转染效率等差异，真实可靠地反映人的 β-
酪蛋白荧光素酶报告基因的表达活性。
本研究成功构建了人的 β-酪蛋白荧光素酶报
告基因表达载体，并在 HELF 细胞内鉴定了其具有
启动荧光素酶基因表达的活性，为深入研究干扰素
γ诱导的 JAK-STAT信号传导通路提供了必要的试
验材料。
参 考 文 献
［1］吴湃，元冬娟，江黎明． β-酪蛋白启动子的活性调控机制．生命的
化学，2008，28(1) :59-62．
［2］Kabotyanski EB，Huetter M，Xian W，et al． Integration of prolactin
and glucocorticoid signaling at the beta-casein promoter and enhan-
cer by ordered recruitment of specific transcription factors and chro-
matin modifiers． Molecular Endocrinology，2006，20 (10 ) :
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［3］郑文彪．大黄鱼免疫相关基因的筛选和鉴定［D］． 厦门:厦门大
学，2006．
［4］高兴，蔡云，辛海明．人 Bax启动子荧光素酶报告基因的构建和
鉴定．肿瘤学杂志，2009，15(1) :46-49．
［5］Alam J，Cook JL． Reporter genes:application to the study of mamma-
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［6］Wood KV． Firefly luciferase:A new tool for molecular geologists． Pro-
mega Notes，1990，28:1-3．
［7］ Naylor LH． Reporter gene technology:the future looks bright． Bio-
chem Pharmacol，1999，58 (5) ，749-757．
［8］双荧光素酶报告基因检测:一种结合萤火虫和海肾荧光素酶检
测的先进辅助报告基因技术． Promega 公司荧光素酶技术系列
产品指南． Promega notes 57，2．
(责任编辑 李楠)
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