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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 5期
人 gdnf基因的克隆及牛

酪蛋白
基因座定位整合载体的构建
张学明
罗奋华
苏慧敏
吴应积
(内蒙古大学哺乳动物生殖与生物学技术教育部重点实验室,呼和浩特 010021)


摘
要:
用分子克隆技术构建人 gdnf基因打靶牛

casein基因座的正负筛选打靶载体, 用于制备生产人 GDNF的牛乳
腺生物反应器。打靶载体以牛

casein基因上游和下游 5
7 kb序列为 5
和 3
同源臂; neo抗性基因为正筛选因子; HSV
tk基因
和 DsRed2基因为双负筛选因子; 人 gdnf基因置于 5
同源臂下游, SV40 po lyA序列插入到人 gdnf基因下游作为人 gdnf基因转
录终止信号。经 PCR、限制性内切酶图谱及 DNA测序分析鉴定,结果表明已成功地构建了人 gdnf基因打靶牛

casein基因座
的正负筛选打靶载体, 为研究人 gdnf基因在牛

casein基因座的定点整合及通过体细胞核移植法制备人 GDNF牛乳腺生物反
应器的研究奠定了基础。
关键词:
基因打靶
人胶质细胞源性神经营养因子
牛

酪蛋白基因座
载体
Construction of Targeting Vector for the Human GDNF cDNA
Knock
in at the CattleBeta
casein Locus
Zhang Xuem ing
Luo Fenhua
Su Humi in
W uY ing ji
(K ey Laboratory of M inistry of Education of China forM ammalian Rep roductive B iology and
B io technology InnerM ongolia University, H ohhot 010021)


Abstrac:t
The goa l o f this study w as to construct ta rgeting vector for the hum an GDNF cDNA knock
in the cattle beta
casein gene
locus so that human GDNF pro te in m ight be produced in gene
targe ted cattle m amm ary g land
The pPGK
neoLoxP vectorw as used as
p lasm id backbone to construc t the targe ting vecto r pNRTCNbG
The 5
and 3
homo logous arms as the beta
casein gene fragm ents w ere
amp lified from purified genom ic DNA of the cattle by PCR
The hum an GDNF cDNA am plified by RT
PCR was loca ted a t the down

stream o f the 5
arm
M oreover, SV40 polyA signals sequencew as located a t the downstream o f the hum an GDNF gene as transcription

a l ending signals
The neo gene was located be tw een the 5
and 3
hom o logous arm s
TheHSV
tk gene andD sR ed2 genew ere located
outside the hom o logous recomb inant area as negative selection m arker g enes, respective ly
The recomb inant plasm ids w ere identified by
restr iction fragm ent ana lys is and partial DNA sequenc ing
The resu lts showed that the structure of the fina l constructed vector accords
w ith the designed plasm id m ap

Key words:
Gene targeting
H um an GDNF
Cattle

case in locus
Vector
收稿日期: 2008
11
10
基金项目:国家高科技
863
项目子课题 ( 2005AA206110 ) ,内蒙古大学特聘教授科研启动费资助项目 ( 203059 )
作者简介:张学明 ( 1970
) ,男,博士研究生,研究方向:哺乳动物生殖生物学及生物技术; E
m ai:l zhangxuem ingzlz@ 163. com
通讯作者:吴应积, E
m ai:l w uyj1211@ 163
com


基因打靶技术通常是用含已知序列的 DNA片段
与受体细胞基因组中序列相同或非常相近的基因发
生同源重组,定点整合至受体细胞基因组中并使该基
因表达缺失或表达一种外源基因 [ 1]。自 1987年, 首
次利用小鼠胚胎干细胞 ( ES)技术建立次黄嘌呤磷酸
核糖转移酶 ( hrp t)基因敲除的动物模型 [ 2, 3]以来, 基
因打靶技术在小鼠上得到广泛的应用,然而大动物由
于未能得到 ES细胞而无法实现同样的操作。随着多
莉羊 [ 4]的诞生,体细胞克隆技术结合体细胞基因打靶
技术使得大动物外源基因定点打靶成为现实。2000
年,英国 PPL公司利用体细胞基因打靶 -核移植技术
体系将绵羊

乳球蛋白基因启动子和人
1
抗胰蛋
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 5期
白酶基因连接体 ( BLG
AAT)定点整合到绵羊胎儿成
纤维细胞的原胶原蛋白基因座上,获得了世界上首例
基因打靶家畜, 其乳中 AAT蛋白的含量达到了 650
mg /L,远远高于随机整合绵羊乳中 AAT蛋白的含量
18mg /L
[ 5]
,显示出转基因克隆技术在乳腺生物反应
器的制备中的应用潜力。 2006年 Shen等 [ 6]用人组
织型纤溶酶原激活剂突变体 ( h tPAm )基因打靶山羊
胎儿成纤维细胞的

casein基因座,核移植获得了怀
孕 90 d胎儿。这说明基于体细胞基因打靶制备乳腺
生物反应器的技术平台已经基本上建立起来了。
胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)属于 TGF


超家族成员 [ 7]。由于 GDNF对多巴胺能神经元具
有营养及保护作用, 在帕金森病及其它神经损伤疾
病的治疗方面显示出了巨大的应用前景 [ 8, 9]。然而
GDNF在人和动物体中含量很低, 从动物体中制备
GDNF用于临床研究是不可能的。用转基因细胞生
产糖蛋白 GDNF, 产率低,成本高; 而乳腺生物反应
器生产药物蛋白生物活性好, 成本低, 产量高 [ 10 ]。
用基因随机整合方法制作乳腺生物反应器, 外源基
因的表达调控受到整合部位邻近的 DNA序列影响,
表达水平差异大且大多停留在较低水平 [ 1] , 而用基
因打靶方法制作的转基因动物外源基因受内源基因
高表达调控元件的调控, 能够显著提高表达水
平 [ 11]。因为体细胞同源重组频率很低, 通常的基因
打靶采用正负筛选策略, 在打靶载体同源臂内插入
neo抗性基因作为正筛选因子,在同源臂外侧插入
HSV
tk基因作为负筛选因子。然而, 这种打靶载体
在体细胞基因打靶中只能使同源重组筛选效率提高
2~ 3倍 [ 12]。为了减少筛选工作量, 提高成功率,采
用红荧光蛋白基因 D sR ed2为负筛选因子,构建了以
neo抗性基因为正筛选因子、H SV
tk基因和 D sRed2
基因作为双负筛选因子的人 gdnf基因打靶牛体细
胞

casein基因座的一正双负筛选打靶载体, 为研
究人 gdnf基因在牛胎儿成纤维细胞

casein基因座
的定点整合, 及通过体细胞核移植法制备人 GDNF
牛乳腺生物反应器的研究奠定了基础。
1
材料与方法
1
1
材料
大肠杆菌 DH5
、pPGK
neoLoxP为本室保存,质
粒 pCMV
Red由本室用 pDsRed2质粒 ( C lontech)在
BamH I位点插入 CMV启动子衍生而来;质粒 pUM

VC1
tk购自美国密执根大学载体中心。
质粒提取试剂盒、小量 RNA提取试剂盒、DNA
琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA纯化试剂盒购自 Q IA

GEN、上海华舜生物工程有限公司及 T IANGEN。
Taq Plus、Pfu DNA聚合酶购自 T IANGEN; T4
DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、M
MLV反转录酶、oli

go( dt)、限制性内切酶均为 TAKARA产品。
1
2
方法
1
2
1
RT
PCR扩增 gdnf基因
取 4月龄人胎儿肾脏
组织 30mg,用上海华舜生物工程有限公司 RNA小量
提取试剂盒提取总 RNA, 并以 o ligo( dt)为引物合成
cDNA第一链,然后以此为模板、分别以人 gdnf基因 5

端和 3
端两条引物进行 PCR。反应条件: 94
变性 45
s, 58
复性 45 s, 72
延伸 1 m in,共 35个循环。gdnf
PCR引物: gP
:f 5

GACCTCGAGATGAAGTTATGGGAT

GTCGTGGCTGTC
3
, gP
r: 5

GAGCTCGAGTCAGATA

CATCCACACCTTTTAG
3
;上下游引物 5
端分别引入
Xho
酶切位点。
1
2
2
5
和 3
同源臂 PCR扩增
根据 Bonsing等 [ 11]发
表的牛

casein基因序列 (M 55188)设计 5
和 3
同源臂
PCR扩增引物,产物长度分别为 2 264 bp和 5 744 bp。
5
同源臂 PCR引物: 5P
:f 5

GACGTCGACAAAACTTC

CGTGTGTCCCAGC
3
, 5P
r: 5

GGCCTCGAGCTCCTGG

GAATGGGAAGATGA
3
,上下游引物两端分别引入 Sal

和Xho
酶切位点; 3
同源臂 PCR引物: 3P
:f 5

AAAG

GATCCAGCAACAGACTAACAAGAAGG
3
, 3P
r: 5

CT

CAGGATCCAAACATCGGCTTACTTG
3
,上下游引物两
端分别引入 BamH
酶切位点。用牛胎儿成纤维细胞为
材料,参照文献 [ 12]提取基因组 DNA,以此为模板, PCR
扩增 5
和 3
同源臂。5
同源臂 PCR反应条件: 94
变
性 45 s, 61
5
复性 45 s, 72
延伸 2
5 m in,共 35个循
环。3
同源臂 PCR反应条件: 94
变性 45 s, 58
复性
45 s, 72
延伸 6m in,共 35个循环。
1
2
3
基因打靶载体的构建
( 1 )目的基因 gdnf
转录终止信号序列的插入: 用 N ot I、S sp I酶切质粒
pCMV
Red,回收 264 bp的 SV40 po lyA转录终止信
号序列;用 N ot I、E coRV酶切质粒 pPGK
neoLexP, 将
SV40 po lyA克隆到 pPGK
neoLoxP载体上, 命名为
pP40。 ( 2 )负筛选标记基因 D sR ed2 的插入: 用
114
2009年第 5期


张学明等 :人 gdnf基因的克隆及牛

酪蛋白基因座定位整合载体的构建
BamH I、Ssp I酶切质粒 pCMV
R ed, 回收 1
5 kb的
D sR ed2红荧光蛋白基因;用 Kpn I酶切 pP40载体, T4
DNA聚合酶补平粘端, 再用 BamH I酶切后, 将
D sR ed2基因克隆到 pP40载体上, 命名为 pP40R。
( 3)负筛选标记基因H SV
tk的插入: 用 Pfu DNA聚
合酶以质粒 pUMVC1
tk为模板扩增长度为 2 837 bp
的 HSV
tk基因, 上下游引物两端分别引入 Xho I和
PmaC I(用于打靶载体线性化 )酶切位点。用 Apa I
酶切质粒 pP40R, T4 DNA聚合酶补平粘端, 再用
Xho I酶切后, 将 HSV
tk基因用 Xho I酶切后克隆到
pP40R载体上,命名为 pP40RT。 ( 4) 5
同源臂的插
入:用 Sal I、Xho I酶切 5
同源臂 PCR产物,将 5
同源
臂克隆到 pP40RT的 Xho I位点, 命名为 pP40RTC。
( 5)目的基因 gdnf的插入:将 gdnf PCR产物用 Xho I
酶切后克隆到 pP40RTC载体的 Xho I位点, 命名为
pP40RTCG。用 PCR法检测 gdnf的插入方向; PCR
上游引物设计在载体的 5
同源臂上, 命名为 5fP
f
( 5

ACTATTTC CTCATCTTCCCATTCCCAG
3
) , 下
游引物为 gP
r;反应条件: 94
变性 45 s, 62
复性
45 s, 72
延伸 1 m in,共 35个循环; 如果是正向插
入将获得 598 bp的特异产物, 反向插入, 则无特异
PCR产物。 ( 6) 3
同源臂的插入: 将 3
同源臂 PCR
产物用 BamH I酶切后克隆到 pP40RTCG载体的
BamH I位点。用 PCR法检测 3
同源臂的插入方向;
PCR上游引物: 3fP
:f 5
TGCCTCTGAATGAACAC

TATCTTACC
3
(位于 3
同源臂上 ), 下游引物:
3 fP
r: 5

GTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGG
3

(位于 3
同源臂外侧 ); 反应条件: 94
变性 45 s,
58
复性 45 s, 72
延伸 1 m in, 共 35个循环; 如果
是正向插入将获得 829 bp的特异产物,反向插入,
则无特异 PCR产物。
1
2
4
基因打靶载体的部分 DNA序列测定
分别
用 3 fP
r、gP
f、gP
r和 ctkP
r (位于 HSV
tk基因 3

端的外侧 )作为测序引物, 委托上海生工生物工程
技术服务有限公司进行测序,进一步分析基因打靶
载体构建是否正确。
2
结果
2
1
RT
PCR扩增获得了 gdnf基因
RT
PCR扩增产物, 用 1%琼脂糖凝胶电泳检
测,特异条带与预期大小相符,为 576 bp(图 1)。表
明, 通过 RT
PCR扩增获得了 gdnf cDNA。DNA序
列已经过测序鉴定。
1
100 bp DNA Ladd erM arker; 2
gdnf RT
PCR产物
图 1
gdnf PCR产物凝胶电泳图
2
2
PCR扩增获得了 5
和 3
同源臂
提取的牛基因组 DNA, 用 0
7%的琼脂糖凝胶
电泳检测,其完整性大于 21 kb,符合 PCR要求。以
此为模板,通过 PCR扩增获得了 2 246 bp的 5
同源
臂 (图 2)和 5 744 bp的 3
同源臂 (图 3)。
1
500 bp DNA Ladder Marker; 2
5
同源臂 PCR产物
图 2
5
同源臂 PCR产物电泳图
1

DNA /E coR I; 2~ 4
3
同源臂 PCR产物
图 3
3
同源臂 PCR产物电泳图
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 5期
2
3
基因打靶载体的鉴定
2
3
1
重组质粒 pP40的酶切鉴定
用 N o tI、E coRI
双酶切重组质粒 pP40,获得的小片段与预期大小相
符 (图 4), 表明 SV 40 po lyA插入到骨架载体的预期
位置。
2
3
2
重组质粒 pP40R的酶切鉴定
用 H ind
、
BamH I双酶切重组质粒 pP40R获得的大片段与
pP40单酶切片段大小相等、小片段约为 1 555 bp
(图 5) ,表明 pP40R构建正确。
1

DNA /H ind
+ EcoR I; 2
pPGK
neoLoxP; 3
pPGK
neoLoxP /N otI;
4
pPGK
n eoLoxP /EcoRV; 5
pP40 /Not I; 6
pP40 /E coRV; 7
pP40;
8
pP40 /N otI+ E coRV; 9
D2000 DNA M ark er
图 4
重组质粒 pP40酶切检测电泳图
1

DNA /H ind
+ E coRI; 2
pP40R; 3
pP40R /BamH I; 4
pP40R /H ind

+ BamH I; 5
pP40 /BamH I; 6
pP40
图 5
重组质粒 pP40R酶切检测电泳图
2
3
3
重组质粒 pP40RT的酶切鉴定
用 PmaC I、
Xho I双酶切重组质粒 pP40RT 获得的大片段与
pP40R单酶切片段大小相等、小片段约为 2 827 bp
(图 6), 表明 pP40RT构建正确。
2
3
4
重组质粒 pP40RTC的酶切鉴定
Sal I和
Xho I为同尾酶, 5
同源臂插入到载体 Xho I位点, 5

端将形成 Taq I酶切位点, 3
端将形成 Xho I酶切位
点。用 PmaC I、Xho I双酶切重组质粒, 根据酶切片
段大小可判断 5
同源臂的插入方向。图 7所示, 23#
pP40RTC为 5
同源臂正向插入, 6# pP40RTC为反向
插入。
1

DNA /H ind
+ E coR I; 2
pP40RT; 3
pP40RT /XhoI; 4
pP40RT /
PmaC I+ XhoI; 5
pP40R /XhoI; 6
pP40R
图 6
重组质粒 pP40RT酶切检测
1

DNA /E coRI; 2
pP40RT; 3
6# pP40RTC; 4
6# pP40RTC /X ho I; 5
6
# pP40RTC / PmaC I + X ho I; 6
23# pP40RTC /PmaC I + X ho I; 7
23#
pP40RTC / X hoI
图 7
就重组质粒 pP40RTC酶切检测
2
3
5
重组质粒 pP40RTCG的鉴定
用 Xho I酶切
5个重组质粒, 均获得了 564 bp的小片段 (图 8 )。
PCR检测 gdnf插入方向, 3个正向插入, 2个反向插
入 (图 9)。
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张学明等 :人 gdnf基因的克隆及牛

酪蛋白基因座定位整合载体的构建
1

DNA /H ind
+ E coR I; 2
pP40RTCG; 3
pP40RTCG /PmaC I; 4
8

pP40RTCG /X hoI
图 8
重组质粒 pP40RTCG酶切检测
1
D2000 DNA M ark er; 2
阴性对照 ( pP40RTC) ; 3
阴性对照 (H2O) ;
4~ 8
质粒 pP40RTCG
图 9
重组质粒 pP40RTCG PCR检测连接方向
2
3
6
重组质粒 pNRTCNbG的鉴定
用 BamHI酶切
2个重组质粒,均获得了 13 kb大片段和 5
7 kb的小片
段 (图 10)。PCR检测 3
同源臂插入方向,其中一个为
正向插入,另一个为反向插入 (图 11)。正向插入的,即
为正确构建的基因打靶载体 pNRTCNbG(图 12)。
2
4
基因打靶载体的部分 DNA测序分析
测序表明,目的基因 GDNF序列正确, 骨架载体
上插入的各片段连接正确,如图 12所示 (测序图略 )。
1
DL15000 DNA M arker; 2
4# pNRTCNbG; 3
4# pNRTCNbG /PmaCI;
4
4# pNRTCNbG /B amH I; 5
50# pNRTCNbG /B amH I; 6
50# pNRTCN

bG /Pm aC I; 7
50#pNRTCNbG; 8

DNA /E coR I
图 10
重组质粒 pNRTCNbG酶切检测
1

DNA /H ind
+ E coRI; 2
阴性对照 ( pP40RTCG ) ; 3
阴性对照
(H2O) ; 4
4#pNRTCNbG; 5
50# RTCNbG
图 11
重组质粒 pNRTCNbG PCR检测连接方向
图 12
pNRTCNbG打靶载体图谱
3
讨论
体细胞基因打靶,同源重组频率比 ES细胞低两
个数量级,且体细胞打靶非同源重组频率非常高 [ 13 ]。
因此,体细胞基因打靶过程中必须建立行之有效的富
集方法以有效地筛选同源重组克隆。近年来,体细胞
基因打靶研究多采用高效富集的无启动子打靶策
略 [ 5, 16 ~ 18]。但应用体细胞基因打靶技术打靶乳蛋白
基因座制备乳腺反应器时,由于乳蛋白基因在成纤维
细胞中不表达而无法使用无启动子打靶策略。采用
正负筛选策略富集效率较无启动子打靶策略低,当载
体两端各插入一个 HSV
tk基因时,富集效率大幅度
提高 [ 15]。本研究构建基因打靶载体旨在将人 gdnf基
因打靶到牛

casein基因座,而制备牛乳腺反应器。
采用了双负筛选策略,即在 neo、HSV
tk正负筛选载体
的基础上,采用红荧光蛋白基因 D sR ed2作为第二负
筛选因子,以求提高富集打靶克隆的效率。用D sRed2
作为第二富集因子,其优点为 ( 1)用 GANC富集同源
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 5期
重组克隆后,可以借助荧光显微镜起到再次富集作
用; ( 2)可以通过红荧光蛋白指示 DNA转染情况, 从
而减少转染盲目性,节省时间, 提高工作效率; ( 3)可
以在同一条件下更精确地研究双负筛选因子在体细
胞基因打靶过程中对同源重组的富集效率。
同源臂长度影响中靶效率,一般来说,同源臂的
长度越长,中靶效率越高 [ 20]。理想的同源臂长度为
5~ 10 kb
[ 21]。本研究所构建的打靶载体同源臂长
度为 8 kb, 且有长、短臂之分,短臂约 2
2 kb,以便于
PCR筛选中靶克隆。
人 gdnf基因有 3种转录本形式: 第一转录本编
码序列长度为 636 bp,第二转录本为 558 bp,第三转
录本为 402 bp; 第一、二转录本编码的 GDNF能够分
泌到细胞外, 且生物活性相同, 第三转录本形成的
GDNF不能分泌到细胞外 [ 22]。通过 RT
PCR获得了
人 gdnf第二转录本 cDNA,测序证实序列完全正确。
将其插入到载体 5
同源臂下游, 并用 SV40 po lyA序
列作为它的转录终止信号。根据构建成功的打靶载
体的结构,可以预期在基因打靶成功的转基因牛中,
借助

casein基因的调控元件在乳腺细胞中高效表
达人 GDNF。
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