全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
反向遗传学在现代生物学领域中的应用
杨宇 王丹 李浩戈
(沈阳农业大学辽宁省农业生物技术重点实验室,沈阳 110161)
摘 要: 反向遗传学是一种新兴的分子生物学技术。主要从反向遗传学的含义、研究方法及应用等角度进行综述, 并
介绍有关反向遗传学研究的最新进展。
关键词: 反向遗传学 植物抗病毒 RNA干扰
Application of Reverse Genetics inModern B iology
Yang Yu W ang Dan L iH aoge
(K ey Laboratory of Agriculture B ioT echnology Liaoning Province, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161)
Abstrac:t The reverse genetics is an em erg ing d iscip line It is one k ind o f em erg ing m o lecular b io logy techno logyTh is artic le
m a inly introduced them ean ing of the reverse genetics, research m e thods, app lication and the new est research progress o f reverse genet
ics
Key words: Reverse gene tics P lan t antiv irus RNA interfe rence
收稿日期: 20081105
作者简介:杨宇 ( 1984) ,女,在读硕士研究生,研究方向:细胞分子生物学
通讯作者:李浩戈,副教授, Em ai:l yangyu_rainy@ 163 com
反向遗传学是相对于正向 (经典 )遗传学而提出
的。经典遗传学的系统研究是从孟德尔的豌豆花实验
开始的,即通过生物的表型性状来推测其遗传物质组
成、分布与传递规律等,从而研究生命过程的发生与发
展规律。正向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行
为,如控制突变性状的基因数目及其在染色体上的位
置,以及突变性状在后代中的传递规律等。反向遗传
学则是直接从生物的遗传物质入手,利用现代生物理
论与技术,通过核苷酸序列的突变、缺失、插入等手段
创造突变体并研究突变所造成的表型效应,进而来阐
述生物生命发生的本质现象,与之相关的各种技术统
称为反向遗传学技术 ( reverse geneticmanipulat ion),主
要包括 RNA干扰 (RNA interference, RNA i)技术、基因
沉默技术、基因体外转录技术等,是 DNA重组技术应
用范围的扩展与延伸 [ 1]。
1 反向遗传学技术
11 RNA干扰技术
RNA干扰 ( RNA interference, RNA i)是真核生物
体内由双链 RNA( doub lestranded RNA, ds RNA)介导
的降解同源 RNA的现象。在细胞中,长的 dsRNA被
类似 RNA seIII的 D icer切割成尺度为 2l~ 26 nt的干
扰性小 RNA ( small interfering RNA或 short interfering
RNA, siRNA)。随后 siRNA与蛋白复合物结合后形
成 RNA诱导沉默复合物 ( RNAinduced silencing com
plex, R ISC ),并解链。有活性的 RISC在 siRNA反应
链指导下与其互补的转录物结合,导致 RNA的降解。
这是一种转录后水平的基因沉默 ( posttranscriptional
gene silence, PTGS),也称 RNA沉默 (RNA silence)。
RNA干扰是生物进化的结果,是生物体对病毒
基因等外源核酸侵入的一种保护性反应,既能对抗
如病毒基因或人工转入基因所表达的 mRNA等外
源基因的侵害,又能降解自身正常基因产生的 mR
NA。这种 RNA水平上的基因抑制, 可能是生物普
遍存在调控基因表达的调节方式, 同时也提供了一
种特异性失活功能基因的方法。由于 RNA干扰被
与抑制基因同源的 dsRNA所启动,是生物基因组抵
抗转座子或病毒等外来遗传元件入侵的一种保护性
机制,具有以下 4个重要特征 [ 2] : ( 1)特异性: 某些
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
特定目的基因的双链 RNA转入细胞内,能特异地干
扰与其同源的目的基因的表达。在 siRNA中有 1~
2个碱基错配就会大大降低对靶 mRNA的降解效
果 [ 3, 4]。 ( 2)高效性: 低浓度的 dsRNA可以产生强
烈的阻抑效应。据研究证实 1~ 100mmo l /L的 dsR
NA浓度对基因沉默的效果是一样的 [ 5] , 同时 RNA i
技术是反义 RNA表达技术对于基因抑制效率的 10
倍左右。 ( 3)广泛性: 在部分生物中, s iRNA分子能
通过细胞膜、细胞间和组织屏障被转运, 从而使
RNA干扰作用更为广泛。在线虫的研究中, 通过注
射、饲喂等方式把 dsRNA转入线虫体内,在体细胞、
生殖细胞等中都产生 RNA i[ 6]。 ( 4)遗传性: RNA i
的效应可以在不同细胞间长距离传递和维持, 而且
在某些生物中 (比如线虫 )具有遗传性。
12 基因沉默技术
基因沉默 ( gene silencing)是转基因植物中特定
基因由于种种原因不表达或表达量很低的遗传现
象。一方面,基因沉默为利用遗传操作创造遗传修
饰物种 ( genetica lly mod ified o rgan isms, GMOs)造成
障碍; 另一方面, 它又为研究基因功能及植物基因表
达调控提供了新途径, 即通过有选择地抑制特定基
因的表达来创造功能缺失体。利用反向遗传学方法
可进一步研究基因的功能, 或直接利用创造的特殊
性状变异体进行植物改良,同时,在植物发育的不同
阶段抑制特定基因的表达, 对发育生物学研究也具
有重要意义 [ 7]。
基因沉默的表现形式是多样的,主要可以分为两
类: 转录后基因沉默 ( posttranscript ional gene silen
cing, PTGS)和转录水平的基因沉默 ( transcript ional
gene silenc ing, TGS)。PTGS和 TGS都与基因同源性
有关,又被统称为同源依赖型基因沉默 ( homo logyde
pendent gene silencing , HDGS)。以前所发现的植物中
共抑制现象 ( cosuppression) [ 8, 9] ,转基因介导的病毒抗
性 ( transgenemediated virus resistance) [ 10, 11]和病毒诱
导的基因沉默 ( v irusinduced gene silenc ing, V IGS) [ 12] ,
真菌中的 quelling现象 [ 13],以及线虫 (Caenorhabd itis el
egans)和果蝇 (Drosophila melanogaster )中的 RNA干涉
(RNA interference, RNA i)
[ 14, 15]
, 其机理都是相似的。
外源基因能够正常或高速转录,但是由于小 RNA干涉
作用,外源基因转录的 mRNA在细胞质内积累水平很
低或者根本检测不到,因此这一类基因沉默都是发生
在转录后水平,都可以被看作属于 PTGS一类。而 TGS
是指由于 DNA修饰、异染色质化等原因使基因不能正
常转录。相对于 PTGS,有关 TGS的研究和知道的信息
相对较少, 在 TGS中有依赖 RNA 的 DNA甲基化
( RNAdependent DNA methylation, RdDM )。最近在植
物中的研究表明, RNA i和 RdDM都和小干涉 RNA有
关,都需要由 siRNA介导 [ 16, 17]。
2 反向遗传学的应用
21 基因功能的研究
反向遗传技术在病毒、动物、植物等基因研究方
面具有重大应用价值,并取得了较大进展,例如用于
研究高等动植物相关基因功能。一些高等动、植物,
如人类、水稻和 Arabidop sis测序完成后,最具有挑战
性的工作就是确定所有基因序列的生物学功能, 通
过基因突变、删除等,利用反向遗传学方法来研究未
知基因的功能已受到研究者的广泛关注 [ 18]。也可
用该方法研究致使植物杂交不育及杂交失活相关基
因的功能, 是物种形成的遗传学研究的良好工
具 [ 19]。用反向遗传学途径克隆新基因是依据被克
隆基因在染色体上的位置来实现, 以图位克隆与转
座子标签技术为常见。随着现代生物信息学的发
展, 出现了更为便捷的电子克隆 ( silicon clon ing )方
法。还可以用于研究动、植物细胞内 DNA的同源重
组, 基因序列分析;可在 DNA的分子水平上构建嵌
合病毒以研究病毒基因组的基因功能。此外, 反向
遗传技术也被用于研究蛋白质与核酸之间的相互作
用关系等方面。
随着 RNA i作用机制研究的不断深人, 水稻功
能基因学研究的重要性日益增加, 用基因沉默技术
成功探讨水稻基因功能的例子也越来越多。X iong
等 [ 20]发现蛋白激酶 MAPK基因 OsMAPKS对于促进
细胞分裂起到很重要的作用, 用 RNA i抑制此基因
表达,导致了病程相关基因,如 PR l和 PR10的组成
性表达,增强了水稻对病原菌的抗性,但转基因植株
对非生物因素,如干旱、盐分以及冷冻等的抗性却降
低了。Kusaba等 [ 21]用 RNA i技术证明 Lgcl在抑制
水稻种子谷蛋白表达中的重要作用。 Lee等 [ 22]通
过过量表达 OsMADS50,发现能够导致来自愈伤状
态的水稻提前开花,用 RNA i沉默该基因, 不仅开花
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2009年第 5期 杨宇等: 反向遗传学在现代生物学领域中的应用
延迟, 而且茎秆结间增长, 推测这种基因在控制开花
相关调控时可能起重要的 开花催化剂 作用。
M oritoh等 [ 23]在研究水稻早期花粉细胞成熟过程
中,用 RNA i沉默了 RAD2 /XPG核酸酶的一个新成
员基因 OsGEN L,导致了大多数转基因水稻产量降
低和雄性不育。
22 疾病治疗
RNA干扰可以特异地沉默与疾病有关的内源
或外源基因,或者沉默致病过程中与一些中间代谢
产物的合成、分解有关的蛋白基因,而不会对个体的
生长发育产生影响,这些特性为 RNA干扰在疾病治
疗上的应用开创了广阔的前景。
23 植物抗病毒
在自然状态下, 病毒在植物体内不正常复制中
断时会产生 dsRNA,这就为植物体内的 RNA i提供
了一个诱导起始物, 从而引发了植物体内的 RNA i
机制, 降解病毒的基因组, 导致植物体对病毒的天然
抵抗力,因此 RNA i系统是植物天然的病毒防御系
统。利用 RNA i的原理, 1999年 Pinto等将水稻黄斑
病毒 ( RYMV )复制所需要的某种酶的基因导入水
稻,通过诱导 RNA沉默使起具有 RYMV病毒的抗
性,且这种抗性能够稳定遗传 3代。 1997年 Ratcliff
等 [ 24]用番茄黑环斑病毒接种烟草, 植株表现恢复
型。他用相同的病毒再次接种恢复叶片也没有看到
症状。Wang等 [ 23]利用大麦黄矮病毒 ( B arley ye llow
dwarf v irus, BYDV ) pav株系的复制酶基因片断的反
向重复序列载体 ( hpBYDVpo l)转化大麦, 获得 pav
免疫植株, EL ISA检测和田间接种均未监测到病毒。
24 疫苗开发
对病毒学家来说, 反向遗传学意味着从克隆的
DNA生产病毒。1999年从一个反义 RNA病毒的片
段得到了流感的特性。传统的新流感变株的疫苗的
制造方法是用地方株和疫苗株共同感染鸡胚, 然后
遗传学方法筛选含期望的基因组片段混合物的重配
病毒, 此过程需数周。因为其病原性,传统重配不适
于 H5N1。所以分离了 H 5N1的血凝素和神经氨酸
酶基因组片段来开发疫苗。将血凝素工程化使病原
性减弱,又将携带这两种片段的质粒与 6种携带其
余 H1N1流感标准疫苗株基因组片段的质粒混合。
只用 4周时间就从地方流感株变成了实验疫苗。这
是第一个进入临床试验的用反向遗传学制造的流感
疫苗
25 作物品质改良
RNA i技术能否应用于植物改良关键在于产生
的变异能否稳定地遗传。 S toutjesd ijk等 [ 26]在拟南
芥 FAD 2基因的 hpRNA介导的基因沉默研究中, 证
明基因抑制效果可在子代稳定传递, 首次明确了
RNA i技术在作物改良尤其是种子品质性状改良方
面的应用潜力。
脂氧合酶 ( LOX )是生物体中是一种含非血红
素铁的蛋白质。其代谢产物中含有活性氧和氧自由
基, 对细胞膜具有破坏作用, 参与细胞的衰老。何正
权等 [ 27]利用 RNA i技术对水稻基因进行改良, 通过
RNA i技术在水稻胚乳中特异沉默内源 LOX 基因,
从而提高稻谷自身的耐贮藏遗传特性。进一步显示
了 RNA i技术在作物品质改良中的有效性。
3 展望
作为新兴的学科,反向遗传学的研究正处于快
速的起步阶段,随着正向遗传学和反向遗传学的结
合, 它们将会为遗传学及其相关的生物化学、分子细
胞和发育生物学等领域的未来发展指明方向, 更好
的为人类了解生命的本质贡献力量。因此, 反向遗
传学技术具有广泛的研究与前景。
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(下转第 54页 )
45
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
须针对不同物种的妊娠期特性,选择合适的胚胎移
植时间及移植胚胎的数目。总之, 核移植后的步骤
对克隆胚的全程发育也是至关重要的。
6 结语
体细胞核移植技术具有广阔的应用前景, 尤其
与基因工程、干细胞技术结合后无疑会对自然界及
人类社会产生极其深远的影响。但极低的成功率使
其面世 10多年后大多仍处于研究而不是应用阶段。
相信在广大研究者的不懈努力下,在不远的将来,它
必将成为一项简单、高效、实用的生物学技术。
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