全 文 ：生物杖术通报
· 技术与方法 · 刀了口
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 年增


基因组改组技术及其在微生物育种中的应用研究进展
芦志龙 , 吴冰 , 袁尔东“ 蔡俊鹏 , ,


’华南理工大学生物科学与工程学院 , 广州
 仪闷



华南理工大学轻工与食品学院 , 广州
 仅抖


华南理工大学测试中心 , 广州





摘 要










基因组改组
技术是借助递归式原生质体融合策略对微生物基 因组进行遗传改良
的一种新兴微生物育种方法 。 自


年首次被用来培育


 高产菌株 以来 , 目前已为育种工作者广泛采用。
对









 技术的原理及最近的应用研究进展进行了综述 ,探讨了其局限性 , 并展望 了其发展的趋势。
关键词
基因组改组 递归式原生质体融合 微生物育种

































































































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Key W ord s : G enom e shufi ing R eeurs ive pro toplast Fusion M iero bialbre eding
育种技术的发展经历了自然选育 、诱变育种 、杂
交育种 、基因工程育种等几个阶段 。 其中 , 自然选
育 、诱变育种和杂交育种属于传统的诱变育种方法 。
尽管传统的诱变育种方法曾经发挥着巨大的作用 ,
但具有周期长 、操作繁冗的缺点 , 且经连续多次诱变
后 , 易出现产量无法提升的“疲劳效应 ” 。 基因工程
育种虽有目标明确 、定向性好的优点 ,但需要对目的
菌株的遗传背景有着比较深刻的了解 , 故相当耗时 、
费力 。 基因组改组技术则可有效地解决上述方法的
缺点 , 为微生物育种提供了新的手段 。 本文拟从基
因组改组技术的原理和技术优势 、国内外研究应用
状况及发展趋势等几个方面出发 , 对该技术进行全
面的综述 。
1 e e n o m e s h u fn i
n g 的技术原理及优势
基因组改组 (G enom e Shufl ing)是通过一种或
多种传统诱变方法处理菌株 , 从中得到若干性状微
量提升的变异子(即出发菌株 ) , 再对这些变异子进
行多次的 “递归式原生质体融合” ( R e e u r s iv e p ro t o -
p la st fu si on )
, 即每次将具有性状提升的后代继续进
行随机原生质体融合 , 使其基因组充分重排 。 最后
利用高通量筛选技术得到同时具有多种出发菌种有
利性状 ,且生产水平大幅度提升的变异菌株 。 这项
作者简介:芦志龙(19 83 一 ) , 男 , 硕士研究生 ,研究方向微生物
生物秋术通报 B to te ch nol俐妙 2 0 0 8 年增 千‘】
技术实质上是利用了新的原生质体融合策略对出发
菌株进行了基因组水平的改造 , 从而达到定向进化
的目的。
图 1 基因组改组原理的示意图
从分子水平而言 , 基因组改组技术促使菌株基
因组发生“全局 ”性的改变 , 摆脱了点突变模式的局
限。 ce n o m e s h ufl i n g 受 D N A shum ing 技术的启发
而产生 , 它们的不同之处在于前者实施在细胞基因
组的水平上 , 而后者只是在 D N A 的水平上的重排
(见图 1) 。 基因组改组利用人为创造条件 , 使同一
染色体上或不同染色体上的正向突变基因得到最大
限度的随机重组 , 提高正向进化速率 , 从而得到了具
有多种正向突变表型的菌株 。 与此同时 , 不良性状
基因也在多轮的递归式原生质体融合过程中被删除
或沉默掉 。 P at na ik 认为 , 基因组改组技术实现菌种
生长能力的大幅改善的原因 , 可能是 (l) 改变了代
谢网络调控机制 , 导致代谢流重新平衡 , 提高了产
率;(2) 改变了底物和产物的运输机制;(3) 提高了
对底物 , 噬菌体 , 毒力因子的抗性 , 并提高底物的利
用率[’] 。 总之 , 改组后代呈现的优 良性状决不是单
一点突变的结果 , 而是诸多点突变在基因组水平的
大幅度重排产生较大的性状改良。
基因组改组技术一般流程总结如图 2 。
基于成熟的诱变和细胞融合技术 , 基因组改组
技术体现了如下一些优势
1.1 节省时间 , 设备简单
传统育种技术具有较大的盲目性 , 并且费时 、费
力 。 比如 , 通过传统育种技术得到具有单一基因正
向突变的菌株 , 至少需要 1护 的变异文库进行筛选 。
而基因组改组技术只需在取得具有微量正向突变的
出发菌株后 , 通过连续多次的 “递归式原生质体融
合” ,快速高效地得到具有亲本全部正向突变特点
的后代。 由于出发菌株的诱变 , 原生质体杂交等技
术相当普遍和成熟 , 所以设备易得 , 费用低廉 , 便于
推广 ,应用前景广阔〔‘l 。
1
.
2 多亲本的基因水平转移
传统的诱变育种实质上是单亲的变异和遗传 ,
在这种情况下 ,单一菌株上发生多点有利突变的机
率很低 ,需要多次诱变和筛选的繁杂过程 , 花费漫长
的周期才能实现 。 基因组改组技术是一种水平遗传
方式 , 它通过原生质体的递归式融合使其基因组发
生高效的重组 , 提高了遗传的多样性 ,使多重优良哇
状阳性子出现的机率更大 。 同时 , 由于继承了原生
质体融合技术的优点 , 基因组改组技术可以实现远
年增刊 芦志龙等:基因组改组技术及其在微生物育种中的应用研究进展 137
源亲本的基因水平转移 , 为微生物育种提供了更加
广阔的操作空间 。
1
.
3 无须对菌种遗传背景十分清楚 , 有效地对由
“ 多基因”调控的性状进行改良
理想的高产性状通常是众多有利突变基因共同
表达的结果 。 微生物次级代谢产物 , 如抗生素[6〕的
合成由多酶体系催化完成 , 各个酶的编码序列和调
控序列可能位于一条或多条染色体上 。 鉴于人们对
绝大多数次级代谢产物的基因知之甚少 , 目前大多
数次级代谢产物生产菌的选育仍不能采用定向育种
的方法完成 【’〕。 最近 巧 年来发展起来新兴育种技
术如 D NA 重组技术 、定向进化工程 、代谢工程和系
统生物学手段等 ,使人们有可能直接得到理想中的
优良性状 , 在一定程度上达到了定向进化的目的 。
但这些技术手段都是建立在对 目标菌株遗传背景深
入了解的基础上 ,需要花费巨大的时间和经济代价
去探索其遗传规律 。 基因组改组技术根本无须了解
微生物生命活动的深层调控机制 , 它从基因组的水
平上打散了遗传物质 , 又随机地把这些经过初始变
异基因整合起来 。 通过筛选最佳的“ 组合 ” , 加快了
定向进化的速率 , 对于 “多基因”调控的性状改良效
果明显 , 达到快速育种的目的 。
图 2 G enom e shufl ing 一般流程
2 G e no m 。 s h u fn in g 技术的研究应用现状2002 年 , Y i 一 x i 。 z h a n g 等[’〕首次尝试利用 NTG
诱变的 、具有小幅产量提升的 介los in 出发菌株
st reP to m yces 加diae 进行了两轮基因组改组 , 改组后
代 G SZ 的 tvl os in 产量居然高出出发菌株 6 倍之多!
他们仅通过 l年的选育工作 , 便完成了传统育种方
法 20 年才能完成的工作量 ,使得这种新的育种技术
一鸣惊人 (见 图 3 ) 。 同时 , 为了验证基因组改组技
术确实能够提高后代的重组率 , 他们通过以精氨酸 ,
脯氨酸 , 半胧氨酸和尿崛陡四种不同缺陷性标记的
菌株 5. 。oe lic o le ; 进行了四次递归式原生质体融合 。
结果表明 , 高达 20 % 的后代发生了重组 , 这一 比例
比传统方法育种要高出 40 一 50 倍;从第 1 次到第 4
次 ,具有全部四种缺陷型标记的菌株的比例分别为 :
6.57 x 10 一 7 , 1 . 9 4 x 1 0 一 4 , 2 . 9 5 x 1 0 一 3 , 1 . 4 3 x l o 一 2 ,
远远高于传统诱变育种的突变率 , 表明基因组改组
生物杖术通推 B 勿te ch n oto gy 200 8 年增刊
确实可以有效提高正向进化的效率。
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达 。 另外 ,分析认为基因组改组提高了菌株对 TSB
中营养物质的利用效率 , 生长速率变大 , 是提高分解
能力的一个重要因素。 这是首次将基因组改组技术
和分子水平分析相结合的报告 , 研究结果更加具有
指导性和可操作性 , 为更深层次的定向进化奠定理
论基础 。
此后 , 国内基因组改组技术的研究迅速开展 , 分
别选育出具有耐受 pH 3.6 , 乳酸产量比出发菌株提
高了 27% 的 玩ero占aeilz。 从am no sus 〔’〕;睛水合酶活
力提高 36 .4 % , 发酵周期缩短 20 hr 的 No ca rd ia sP .
H D9 61 1[ ’。〕等 。 将基因组改组应用于抗生素高产株
选育也取得了良好的效果 , 如 2006 年 , 朱慧[‘’〕等对
UV 初始诱变的出发菌株 St reP to ln少ces 蔚Ivo sljore us
sG2 1进行2 轮递归式原生质体融合 , 得到的改组后
代纳塔霉素产量比出发菌株提高了 2.17 倍! 徐波
等对 N TG + uV 诱变的放线菌 Ac tinop la nes te ich om y~
ce tic 哪 , ar . j ian en si s 进行了三轮原生质体递归式融
合 ,得到产量提高 40 % 以上的替考拉宁高产株【’] 。
在 10 株后代中 ,有 3 株表现出了能够稳定遗传的重
组性状 , 其中一株具有耐受 0.3% 乙酸钠 、耐受 0 .
8% 的甘氨酸 、耐受0.5 的二甲胺三个亲本产量性状
的替考拉宁高产重组阳性株 。 同时 , 三轮改组只用
了 1年时间即得到产量较高 , 遗传稳定的菌株 , 而依
靠传统的诱变育种方法要达到此目标通常需耗时3
一 4 年进行 25 000 一 3 0 0 0 0 次筛选才能实现 。
H i ro y u k i H i d a 等在乳酸高产菌株 Stre ptom yees
sP . U 121 的基因组改组中 , 首次利用 E A A (tra ns 一eP -
o x y a e o n i t i C a e i d ) 提高融合后代的检出效率 , 通过 3
轮基因组改组 , 将出发菌株的乳酸产量提高了 5
倍〔‘, 〕, 表明精心设计的高效的筛选策略对于基因组
改组技术是必不可少的 。
林峻等仅用 2 轮改组即得到脂酶产量提高了
317% 的溜曲霉菌株 A胡e咭illus ram a瓦 F S 一1 3 2 , 通过
PRA D 进行多样性分析 , 发现经基因组改组的两个
子代菌株间的遗传距离 (0.1659 ) 高于两亲本间的
遗传距离(0 .巧4 ) ,证明了基因组改组确实可 以有
效提高子代菌株的遗传多样性〔”〕。
20 08 年以来 , 赵凯[’‘〕等通过 4 轮改组得到了紫
杉醇产量提高64 .41 % 的高产菌 No du l帅ori um srlv i-
fo 。。 于雷[‘, 〕等仅通过 2 轮改组 , 便得到了耐受葡
今
图3 基因组改组技术与传统育种方法的对比
《Y i一x i n z h an g 等)
Pa tn al k R 肠ni es 等在对 目标菌株的遗传背景
知之甚少的情况下 , 利用 UV + N TG 诱变得到出发
菌株经过 5 轮基因组改组 , 得到了能够耐受 pH 4.0 ,
且乳酸产量比野生型 提高 3 倍的 La etobaeilluS[’] 。
该研究认为 , 产乳酸菌种的耐酸性至少是由18 个基
因所控制的 , 如果以传统诱变方法提高菌种的耐酸
性 , 只能在很少的基因位点发生突变 , 耐酸能力提高
有限 , 因此必须多次诱变和筛选才能出现大范围的
基因突变 。 而基因组改组技术只需一次诱变 , 连续
多次“递归式原生质体融合”便可达到同样的效果 ,
体现了基因组改组技术在选育多基因调控性状改良
菌种中的明显优势【’〕。
2 0 0 3 年 , M i n g h u a D a i 等利用 3 轮基因组改组 ,
得到了 pCp (pentaehloroPhenol , 五氯酚 , 难降解农
药 , 致癌物质)高耐受性和高分解力的 助hi ngo bi umehlo roP heno lieum A TCC 39723 , 可 完 全 降解 3m M
PC P 。 他们通过 RT 一 P C R 比较野生型和改组后代基
因表达差异时 , 发现改组后代pcP B , p cP A 和 pcP D 3
个 PCP 分解基因由诱导型突变为组成型表达 , 赋予
其高耐受和分解 PcP 的能力〔8〕。 这种转变不是由
三个基因的共有启动子 pcP R 突变导致 , 推测改组导
致pcP B , p cP A 被新的转录因子识别 , 成为组成型表
年增刊 芦志龙等:基因组改组技术及其在微生物育种中的应用研究进展 139
萄糖浓度20 岁L , 乳酸产量最高提高了 71 .4% 的菌
株 L. rk am nos us 。 基因组改组技术也被用于提高酵
母的乙醇产量 , w ei P 等〔’6了通过 4 轮递归式原生质
体融合 , 得到的改组后代 Candida kru seiG巧60 产乙
醇能力提高 , 对乙酸 , 乙醇 , 加热 , 冻融的抵抗力都显
著提高 。 此外 , 在利用基因组改组技术选育核黄
素I” ] , 柔红霉素[’8 ] , 普纳霉素[”〕, 多杀菌素[,。] , 豆
豉溶酶【川等高产菌株的过程中 , 都取得了比较理想
的效果 。 作为最重要的有机酸之一 , 国内对基因组
改组选育乳酸高产菌株的选育非常活跃[” 一 ’。] , 其中
王玉华等得到了 2.4 倍的产量提高[’8 ] 。
统计发现 , 基因组改组技术应用于微生物育种
的研究呈逐年递增的趋势(图4 ) 。 近年来基因组改
组的应用还呈现出以下一些特点:(l) 通常和其他
基因工程手段结合 。 分子生物学的分析具有微观的
准确 ,定向的特点 , 而基因组改组技术可以从宏观的
角度产生性状的多样性 , 二者结合将加快育种进度 。
( 2) 采用不同的诱变机制的诱变剂 , 大部分研究采
用 uv + NTG 的组合诱变剂得到出发菌株 , 采用不
同的诱变剂可以提高变异的多样性 , 同时提高融合
后代的成活率。 ( 3 ) 4 轮以内的改组足以产生性状
大幅改善的生产菌株 。 ( 4) 改组对象遍布细菌 , 放
线菌 , 酵母和丝状真菌 , 体现了该技术的广泛适应性
(图 5) 。 ( 5 ) 改组后代绝大部分具有 良好的遗传稳
定性 , 因此具有生产上 的实用性 。 ( 6) 改组后代生
产水平提高显著(图 6)
图6 20 2 年以来2 个基因组改组报道的
改良对象的分布图
图7 2的2 年来 19个 Ge nom e shufi ing提高发酵产量分布图
皿绷彩米
20 2 20() 3 2004 2叩5时间
20() 6 2007 20() 8
图 4 20 2 年来每年利用 G enom e shufi ing技术
育种的变化趋势(截止 20 08 年 4 月 )
3 G en o m e sh ufi in g 研究和应用展望
3.1 基因组改组技术将与其他新兴育种手段相 结
合 , 突破反向代谢工程瓶颈
作为一种基因水平转移形式 , G en o m e sh 皿ing
技术在重组多亲本多重性状方面有得天独厚的优
势 , 是解除反向代谢工程瓶颈的一种有力的可选手
段 。 反向代谢工程 (Invers e m etabolie engineeri ng ,
I M E
) 为定向育种提供了一种规范的操作策略:利用
各种手段诱变并筛选到人们感兴趣的表型 , 分析并
确定赋予此表型的遗传(有时是环境 )因子 , 最终依
据分析结果采用直接的基因工程手段对微生物进行
改造 。 鉴于传统育种技术的低效性 , 要获得丰富的
遗传多样性 已成为制约反向代谢工程实施 的瓶
颈[’] 。 而基因组改组技术具有提高后代重组率和
遗传多样性的优势 , 在反向代谢工程的应用中有着
巨大的潜力。 将基因组改组技术与其他生物工程技
术相结合 ,如高通量基因组测序 、转录组分析 、代谢
健物杖术通报 B to te chn ofo舒 2008 年增刊
流分析以及分子信息学分析手段等 , 将使人们进一
步了解微生物生命活动的的分子机制和代谢网络 ,
为定向育种提供更多理论依据 。 而其他新兴育种技
术如随机基因敲除库或随机基因过表达库的构建 、
人工转录因子法(A rtifieial transeription fa etors)诱发
新表型 、基于错误倾向PC R (Ero r一P r on e P C R ) 的全
局转录机制工程(G lobal transeriptionalm aehine叮 en -
gi ne eri ng , 好M E) 及核糖体工程(通过选育具有抗生
素抗性的核糖体而实现新表型的表达)等〔’) , 同样
在提高后代的遗传多样性方面有很强的竞争力 。 相
比而言 ,基因组改组技术所需设备更简单 , 操作更简
捷 , 周期更短 , 具有更好的应用前景 。
3
.
2 通过宏基因组改组以取得更好的育种效果
人类已经分离和认识到的微生物只占所有微生
物的极小的一部分(约 1% )[ ’] , 因此自然环境中存
在着难以利用的巨大的基因多样性 。 而宏基因组
(m eg ag en om e)的研究为人们认识这些不易分离的
微生物提供了有效的手段 。 它是通过直接提取环境
中的混合微生物总基因组 DN A , 并构建宏基因组文
库 , 直接得到环境中微生物的遗传信息 ,从而避免了
微生物分离纯化的繁琐过程〔”〕。 因此一个宏基因
组文库就包含了某一特定环境中全部的基因多样
性 。 目前已有报道将宏基因组作为微生物多样性的
进化来源 , 通过宏基因组的 DN A 改组 , 得到了具有
林丹 (hnd an e , 一种杀虫剂)降解活性的异生素基
因〔”〕。 如果以宏基因组作为微生物育种的定向进
化来源进行基因组改组 , 将得到取之不尽的遗传多
样性 , 为微生物育种提供更加广阔的选择空间 , 预示
着像宏基因组改组在微生物育种以及应用上有着广
阔的前景 。
3
.
3 基于安全性的考虑 , 改组后代要进行严格的安
全性论证
Ge no m e sh ufli ng 技术作为新兴的育种手段 , 在
创造了巨大的遗传多样性的同时 , 也带来了安全性
的考虑 , 尤其是在食品发酵工业的生产菌种 。 不同
菌株 、菌种甚至不同属的微生物的基因通过基 因组
改组技术得以重组 , 有可能出现难以预见的负面效
应 , 例如 ,新菌株可能会得到意料之外的抗药性 , 导
致现有抗生素效力降低;产生 了新的病原机制 ,甚至
引发疾病爆发[24 , 25 〕;尚未经过安全评估的改组后代
意外流出实验室 , 在野外环境中定居 , 并对生态产生
不良影响;或者改组菌种发酵产品经食用损害健康
等。 与其他菌种遗传物质改造的技术一样 , 基因组
改组技术在诱发重组时的随机性同时意味着安全问
题的难以预料性 , 所以改组后代菌株一定要进行谨
慎严格的安全论证 。
3
.
4 建立普适的高通量筛选策略拓展应用领域
制约基因组改组技术应用的一个障碍就是高通
量筛选方法的选择 , 没有合适的高通量筛选方法将
使基因组改组变得复杂 。 一套普适的高通量筛选方
法的建立 ,将使基因组改组技术得到更加广泛的应
用 。 此外 ,其应用领域还有待拓展 。 例如 , 基于其适
用于远源杂交重组 , 无须非常清楚遗传背景的特点 ,
对作为生物反应器的植物细胞和动物细胞进行基因
组改组育种 , 以提高动植物细胞生产能力 , 成为一个
合理的设想 。 同时 , 目前为止还没有跨种属的基因
组改组报道 。 这些将是基因组改组技术研究和应用
的发展方向。
4 总结
正如 Y ing一x i n z h a n g 所言:G enom e sh硼ing技
术的建立与成熟 , 将引发传统微生物育种和发酵生
产的一场革命[’〕。 它从根本上改变了诱变育种效
率低下的缺点 , 突破了菌种改 良过程中的诸多局限
性 ,打破了传统育种方法遭遇的瓶颈 。 尽管如此 , 这
项技术还远未完美 ,有待继续完善。 可以预见 , 基因
组改组技术将日益发展成熟 , 并在生产菌种的改良
中得到广泛的应用 。
参 考 文 献
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( 下转第 148 页)
生物技术通报 B to te ch n诚,舒 B “le 血 2008 年增刊
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