全 文 ：第７卷第６期
２００９年１１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０６．０１５
收稿日期：２００９－０３－１７
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００６ＡＡ０２０３０１０９）
作者简介：刘 苗（１９８４—），女，湖北襄樊人，硕士研究生，研究方向：生物化工；郑 璞（联系人），副教授，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｐｕ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
耐温性 Ｌ 谷氨酸发酵菌种的选育
刘 苗，郑 璞，杜巧燕，刘小德，倪 晔，毛忠贵，孙志浩
（江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘 要：应用基因组改组技术提高Ｌ谷氨酸生产菌在高温发酵条件下的谷氨酸产量。以天津短杆菌Ｔ６ １３变异
株ＳＷ０７ １为原始亲株，分别经紫外线（ＵＶ）硫酸二乙酯（ＤＥＳ）和Ｘ射线诱变，获得５株耐温性能略有提高的突
变菌株。经２轮基因组改组，获得耐高温（能在４４℃生长）的Ｌ谷氨酸菌株Ｆ２ ５０。Ｆ２ ５０在３８℃下，摇瓶发酵
４０ｈ，发酵液中Ｌ谷氨酸浓度比原始出发菌株提高了近４１％，在４１℃高温下，摇瓶发酵４０ｈ，Ｌ谷氨酸浓度比原
始出发菌株提高了近２倍。
关键词：基因组改组；Ｌ谷氨酸；耐温性
中图分类号：Ｑ９３３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０６－００７４－０５
ＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｉａｎｊｉｎｅｓｅｆｏｒ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＬｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ
ＬＩＵＭｉａｏ，ＺＨＥＮＧＰｕ，ＤＵＱｉａｏｙａｎ，ＬＩＵＸｉａｏｄｅ，ＮＩＹｅ，ＭＡＯＺｈｏｎｇｇｕｉ，ＳＵＮＺｈｉｈａｏ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，
ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔＬｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｂｙｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｌｉｎｇｗａｓｉｎｖｅｓ
ｔｉｇａｔｅｄ．ＡｖａｒｉａｎｔｏｆＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｉａｎｊｉｎｅｓｅＴ６１３，ＳＷ０７１ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｐａｒｅｎｔｓｔｒａｉｎ．Ｆｉｖｅｍｕｔａｎｔｓ
ｗｉｔｈｓｕｂｔｌｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｉｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｈｅａｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙＵＶＤＥＳ（ｄｉｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）ａｎｄＸｒａｙｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＡｓｔｒａｉｎＦ２５０ｃａｐａｂｌｅｏｆｇｒｏｗｉｎｇａｔ４４℃ ａｎｄｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒ
Ｌｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｅｃｏｎｄｒｏｕｎｄｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｌｅｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＴｈｅＬｇｌｕ
ｔａｍｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＦ２５０ｗａｓ０４１ａｎｄ２ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｓｔｒａｉｎａｔ３８℃ ａｎｄ４０
℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｌｉｎｇ；Ｌｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ；ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ
选育优良的生产菌种一直是味精发酵工业中
主要的研究课题之一［１］。温度是谷氨酸发酵控制
的主要参数之一，谷氨酸生产菌株的耐高温性能直
接与生产效益相关，提高谷氨酸菌株的耐高温性能
可减少生产过程中维持发酵温度所产生的成本［２］。
由于谷氨酸生产菌的耐高温生化机理十分复杂，耐
高温和高产性状并不是由１个或数个基因控制，它
涉及到大量的基因产物及其相关的代谢途径。在
这些作用机制未完全阐明以前，用基因工程等理性
育种手段，较难同时提高谷氨酸菌的耐高温和高产
性能。
基因组改组技术是一个突破性的新型体内分
子育种方法［３］。其突出优点是不必了解整个基因
组的序列数据和代谢网的信息［４－６］，提高了选育
效率［７－８］。
天津短杆菌Ｔ６ １３是天津工业微生物研究所
选育到的１株谷氨酸生产菌，是２０世纪八、九十年
代我国味精生产厂家普遍采用的生产菌株。本研
究以天津短杆菌Ｔ６ １３变异株ＳＷ０７ １为原始亲
株，分别经过紫外线（ＵＶ）硫酸二乙酯（ＤＥＳ）和 Ｘ
射线诱变，获得耐温性能改良的突变菌候选库，应
用灭活标记原生质体，融合后致死损伤得到互补获
得活性融合子的方法，进行基因组改组，以期在短
期内获得耐高温性能较好的谷氨酸产生菌株。
１ 材料与方法
１１ 材料
１１１ 菌种
天津短杆菌Ｔ ６１３变异株ＳＷ０７ １。
１１２ 培养基及溶液
保藏斜面培养基（质量分数，下同）：牛肉膏
１％，蛋白胨１％，ＮａＣｌ０５％，ｐＨ７０～７２。
活化斜面培养基：在保藏斜面培养基上加入
１％的葡萄糖。
再生（ＲＭ）培养基［９］：丁二酸钠９００５％，水解
酪蛋白０５％，酵母膏０５％，葡萄糖０５％，ＭｇＣｌ２·
６Ｈ２Ｏ０４０６６％，ＫＨ２ＰＯ４０１５％，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ
０３５％，琼脂２０％，ｐＨ７３。
种子及发酵培养基：参照文献［１０］进行配制。
显色平板：发酵培养基中加入００１ｇ／Ｌ的溴甲
酚紫及２％的琼脂。
高渗液、ＰＥＧ溶液、新生 Ｃａ３（ＰＯ４）２溶液的配
制方法参考文献［１１］。
１２ 方法
１２１ 原始亲株诱变
采用 ＵＶ ＤＥＳ、Ｘ射线分别对 Ｔ６ １３变异株
ＳＷ０７ １进行诱变，具体方法参考文献［１２］，筛选
温度耐受突变株的流程见图１。
１２２ 原生质体的制备
原生质体的制备方法参考文献［１１］。
１２３ 基因组改组
将按上述方法制成不同菌株的原生质体混合，等
体积分为２份，１份置于紫外线下照射３０ｍｉｎ，１份置
于６０℃水浴中处理１２０ｍｉｎ（各取１００μＬ原生质体
液涂布 ＲＭ平板作对照），混合离心，重悬于高渗液
图１ 起始耐温突变菌株库的选育流程
Ｆｉｇ．１ Ｂｒｅｅｄｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｍｕｔａｎｔ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｈｅａｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
中。各取２５ｍＬ灭活后的亲株原生质体高渗悬浮
液，混合、离心、弃上清液，加入４８ｍＬ３５％聚乙二醇
（ＰＥＧ）溶液重悬，并加入０２ｍＬ的新生Ｃａ３（ＰＯ４）２溶
液，混合均匀。于３２℃保温３０ｍｉｎ，离心，弃上清液，
配成高渗细胞悬浮液５ｍＬ，用高渗液梯度稀释涂布
于ＲＭ平板上，３０℃培养［１１］。
将 ＲＭ上长出的菌落，用灭菌牙签接种到显色
平板，分别于４１和４２℃下培养，挑选生长快、变色
早、变色圈大的菌落进行３８℃摇瓶发酵。产酸高的
改组菌株，再进行下一轮原生质体融合。
１２４ 摇瓶发酵条件
培养成熟种子，按体积分数５％接种量接种到
发酵培养基中培养，控制不同的发酵温度。摇床转
速２２０ｒ／ｍｉｎ，发酵周期４０ｈ，发酵过程中根据ｐＨ变
化情况，流加尿素。
１２５ 分析方法
ＯＤ值测定：将菌液稀释相应的倍数，以空白培
养基作为空白对照，采用７５２分光光度计在６６０ｎｍ
处测定ＯＤ值。
谷氨酸质量浓度测定：采用 ＳＢＡ ４０Ｃ多功能
谷氨酸葡萄糖分析仪测定。
２ 结果与讨论
２１ 基因组改组
２１１ 出发菌库
良好的起始菌株是改良菌种和提高菌种进化
５７ 第６期 刘 苗等：耐温性Ｌ谷氨酸发酵菌种的选育
进程所必需的［１３］。不同性状类群之间的基因组改
组可以加速定向进化。通过ＵＶ ＤＥＳ和 Ｘ射线对
原始菌株分别进行诱变，得到突变株：ＵＤ １、ＵＤ
２、Ｘ １、Ｘ ２和Ｘ ３。它们在４０℃平板上生长良
好，在高温３８℃下，摇瓶发酵产酸，产量分别比原始
出发菌株（ＳＷ０７ １）提高了 ３％、８％、３％、５％和
９％。该５株菌作为基因组改组的出发菌库。
２１２ 第１轮基因组改组
将出发菌株ＳＷ０７ １通过ＵＶ ＤＥＳ和Ｘ射线
诱变，得到融合出发株 ＵＤ １、ＵＤ ２、Ｘ １、Ｘ ２
和Ｘ ３，第１轮融合的再生菌落，经４１℃筛选和
３８℃摇瓶发酵，从２７４个黄色变色圈较大的菌落中
获得５株产酸量高的菌株：Ｆ１ １８、Ｆ１ ２２、Ｆ１ ８０、
Ｆ１ ３６和Ｆ１ ９３。如图２所示，在３８℃下发酵，产
酸率分别比原始亲株（ＳＷ０７ １）提高２８％、２４％、
１７％、２５％和１４％，该５株菌株的平均产酸率比其
融合出发菌株的平均产酸率高１６％。
图２ 第１轮改组菌株和出发菌株在３８℃下
谷氨酸的相对产量
Ｆｉｇ．２ Ｒｅｌａｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔ
ｓｈｕｆｌｅｄａｎｄｉｔｓｓｔａｒｔｉｎｇｓｔｒａｉｎｓａｔ３８℃
２１３ 第２轮基因组改组
将第１次基因改组得到的５株进行第２轮融
合，再生后的菌落在更高的温度４２℃下筛选，获得
Ｆ２ ４５、Ｆ２ ６８、Ｆ２ ５０、Ｆ２ ３９和Ｆ２ ８８共５株产
酸量高的菌株。如图３所示，在３８℃下发酵，产酸
分别比原始亲株（ＳＷ０７ １）提高３９％、３７％、４１％、
３３％和３５％，该５株第２轮改组菌株的平均产酸率
比第１轮改组菌株的平均产酸率高１５４％。
２２ 改组菌株与原始菌株生长情况的比较
将所有改组菌株和原始菌株分别于４２和４４℃
液体试管中培养 ２４ｈ，观察生长情况（表 １）。在
４２℃时改组菌株的菌体密度 （ＯＤ６６０为０７４以上）
明显高于原始菌株 （ＯＤ６６０为０２８）和基因组改组
图３ ２轮改组菌株在３８℃下谷氨酸的相对产量
Ｆｉｇ．３ Ｒｅｌａｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｏｆｔｗｏ
ｒｏｕｎｄｓｓｈｕｆｌｅｄｓｔｒａｉｎｓａｔ３８℃
出发亲株 （ＯＤ６６０最高者为０６２）。在４４℃液体培
养基中，原始菌株和基因组改组出发亲株仅有微弱
生长 （ＯＤ６６０均在０３６以下），而第１轮、第２轮改
组后菌株 ＯＤ６６０分别达到０６０、０８０左右。在高温
液体培养基中，改组菌株的耐温性能较原始菌株有
显著增加。
表１ ２轮改组菌株和原始菌株在不同温度下的生长情况
Ｔａｂｌｅ１ Ｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｅｓｈｕｆｌｅｄａｎｄｉｎｉｔｉａｌｓｔｒａｉｎｓａｔ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
菌株 菌号
ＯＤ６６０
４２℃ ４４℃
ＳＷ０７ １ ０２８３ ０１８２
原始菌株 ＵＤ １ ０４８５ ０２４４
ＵＤ ２ ０５６４ ０２６４
基因改组出发
亲库株
Ｘ １ ０６２５ ０３６５
Ｘ ２ ０３６３ ０３６３
Ｘ ３ ０４６４ ０３２５
第１轮基因组
改组菌
Ｆ１ １８ ０７４５ ０５４５
Ｆ１ ２２ ０８２５ ０６２４
Ｆ１ ８０ ０７６７ ０５８６
Ｆ１ ３６ ０８２８ ０６２３
Ｆ１ ９３ ０８４７ ０６４８
第２轮基因组
改组菌
Ｆ２ ４５ ０９４５ ０７８９
Ｆ２ ６８ ０９２４ ０８２４
Ｆ２ ５０ ０８８８ ０８０２
Ｆ２ ３９ ０９４６ ０８４６
Ｆ２ ８８ ０８６５ ０７６２
２３ 优良改组菌与原始菌株不同温度下的摇瓶发
酵比较
将第２轮改组菌株中的优良菌株Ｆ２ ５０及原始
６７ 生 物 加 工 过 程 第７卷
菌株ＳＷ０７ １分别于３２、３５、３８和４１℃下发酵，比较
其发酵产酸情况。监测发酵过程中菌体密度与谷氨
图４ 改组菌株Ｆ２ ５０与原始菌株ＳＷ０７ １
在不同温度下的摇瓶发酵
Ｆｉｇ．４ ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＦ２５０ａｎｄＳＷ０７１ｉｎ
ｓｈａｋｅｆｌａｓｋａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
酸产量变化情况（图４）。由图４可见，在３２℃下，原
始菌株ＳＷ０７ １的谷氨酸产量（７２３ｇ／Ｌ）及菌体质
量浓度（ＯＤ６６０为３５８）都略高于改组菌Ｆ２ ５０（６７８
ｇ／Ｌ，３２５），但从３５℃开始，改组菌Ｆ２ ５０无论是其
谷氨酸产量还是菌体浓度都比原始菌株ＳＷ０７ １高。
在３８℃下，Ｆ２ ５０的谷氨酸产量达到５２９ｇ／Ｌ，而原
始菌株ＳＷ０７ １的产量却只有３７５ｇ／Ｌ；在４１℃下，
Ｆ２５０的谷氨酸产量达到３１ｇ／Ｌ，而ＳＷ０７ １由于其
生长受到抑制，产量只有１１ｇ／Ｌ。由此可见，经过基因
组改组，改组菌株的耐温性得到较大的提高。Ｆ２ ５０
菌的发酵条件优化及其与原始出发菌株在分子生物学
上的差异有待继续研究。
２４ 改组传代稳定性的确定
将所得改组菌种经过７次传代，再经摇瓶发酵
检测后，获得的融合菌株的遗传性状基本保持稳
定，结果见表２。
表２ 改组株传代稳定性实验结果
Ｔａｂｌｅ２ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｓｈｕｆｌｅｄｓｔｒａｉｎ ｇ·Ｌ－１
传代次数 ０ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７
ρ（Ｌ谷氨酸）５１９５２３５３４５２９５３５５２６５３０５２１
３ 结 论
以原始菌株对微生物进行基因组改组，首先获
得具有遗传差异的出发菌株是十分必要的。采用
紫外线复合 ＤＥＳ、Ｘ射线传统诱变方法对天津短杆
菌Ｔ６ １３变异株 ＳＷ０７ １进行诱变，获得５株耐
温性略有提高的突变株，作为用于基因组改组的出
发菌株。通过２轮基因组改组就获得能够在高温
４４℃生长的菌株。
本研究从味精工业生产菌株出发，经过２轮递
近式原生质体融合，选育到１株在３８℃下发酵产酸
良好（较原始菌产酸提高４１％）、４１℃高温下发酵
较原始菌产酸提高２倍的基因组改组重组菌 Ｆ２
５０。表明基因组改组技术是加速工业微生物复杂表
型改进的一种重要手段，有广泛的应用前景。
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櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
５１０５１５
国内简讯
中国首款含生物活性酶的“干刷牙膏”面世
“世界爱牙日”前夕，由中国人自己研发生产的首款不蘸水干刷牙膏在上海问世。这种干刷功效型牙膏
由复旦大学研发并与雪豹公司合作生产，该款牙膏的“主角”为生物活性酶“ＦＥ”，它具有溶菌、抗感染、修复
组织等独特功能，对 ４００多种细菌具有抑杀和溶菌作用，特别对胃幽门螺旋杆菌具有明显抑杀功能，如应用
于口腔护理，在一定意义上改变了牙膏的概念。该牙膏外包装上分别标有３７～９８的“酶指数”，指数越
高，ＦＥ活性因子越高，不蘸水干刷３～５ｍｉｎ，活性因子可充分发挥作用。
生物丁醇重大科技成果转化项目花落联海
经联海生物化学有限公司与江南大学联合攻关，利用中国科学院上海生命科学研究院专利菌种技术共
同完成的“面粉深加工废水发酵生产丁醇的绿色工艺技术”实现了５大突破：面粉深加工废水为原料，解决
了面粉深加工行业资源再利用和废水环保问题；采用专利菌种和优化的发酵工艺，达到国际先进水平；采用
多效集成节能蒸馏及废水处理集成技术，与传统工艺相比，每吨溶剂蒸汽消耗量由１２ｔ降为８ｔ，耗水量由
１００ｔ降为１０ｔ；废水培养酵母蛋白饲料后作为工艺水回用，达标排放，产生沼气和活性污泥送入锅炉产汽，
实现循环经济与清洁生产；生产规模国内最大。
（文伟河）
８７ 生 物 加 工 过 程 第７卷