全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
甲醇利用菌 SDM11中 glyA基因的
克隆及其在大肠杆菌中的表达
孔庆胜 1 张向阳 1 韩晓琳 1 林强2 董全林 2
( 1济宁医学院,日照 276826; 2华中科技大学,武汉 430071 )
摘 要: 对甲醇降解菌 M ethy lobacterium. sp SDM 11中的 g lyA基因进行克隆及特性研究, 以获得更多的丝氨酸羟甲基转
移酶 ( ser ine hydroxyme thy ltransferase, SHMT)资源。根据 GenBank中已报道的 M ethy lobacter ium ex torquens AM 1中的 g lyA基因
序列 (登录号: L33463)设计引物, 以 SDM 11的基因组 DNA为模板, PCR扩增 g lyA基因。利用 pETblue2载体将该基因在大肠
杆菌 BL21( DE3)中得到表达。 PCR扩增到一个 140 kb大小的 DNA片段, 经过 b last软件比对分析, 发现该片段与已报道的
M ethy lobacterium ex torquens AM1的 g lyA基因的序列相似性为 95% , 氨基酸序列的相似性为 98%。该基因编码 468个氨基
酸, 预测的分子量大小为 52 2 kD, 等电点为 702, 发现纯化后的目标蛋白具有 SHMT酶活性, 并初步测定了酶活力。
关键词: SDM 11 g lyA基因 克隆 表达 SHMT酶
Molecular Cloning and Expression of a glyA Gene from
Methylobacterium . sp SDM11
KongQ ingsheng
1
Zhang X iangyang
1
H an X iaolin
1
L in Q iang
2
DongQuanlin
2
(
1
J ining M ed ical University, Rizhao 276826;
2
Huazhong University of Science and T echnology, W uhan 430071)
Abstrac:t To clone g lyA gene from M ethy lobacter ium. sp SDM11 and study its properties to enr ich the gene resources for ser ine
hydroxym ethy ltransfe rase ( SHMT), pr im ers were designed based on the glyA sequence o f the reportedM ethy lobacterium ex torquens AM 1
( accession num be r is L33463) in G enBank, and an abou t 1 4 kb DNA fragm ent w as amp lified w ith the genom ic DNA o f SDM11 as a
tem plate. The sequence ana lyzied result show ed that this fragm ent had an ORF encoded 468 am ino ac ids, and had 95% and 98% iden
tities w ith the g lyA gene ofM. ex torquens AM1 respective ly. The pred icted m o lecular is 52 2 kD and its iso electr ic po int is 7 02. The
ORF w as am plified by PCR, and cloned into express ion vec to r pETB lue2, then transferred into E. coli Tunner( DE3). A fte r introduced
by IPTG, the ta rget prote in was expressed, wh ich show ed SHMT activity after pur ification.
Key words: SDM 11 g lyA gene C loning Express ion SHMT enzym e
收稿日期: 20100113
基金项目:山东省教育厅资助项目 ( J07YD16)
作者简介:孔庆胜,男,教授,博士,研究方向:分子酶学; Em a i:l kongqs@ m ail jnm c edu cn
丝氨酸羟甲基转移酶基因 ( glyA )是甲基利用菌
中丝氨酸循环中的一个关键基因, 丝氨酸羟甲基转
移酶是含有单碳循环的大多数微生物体内的一个传
统酶, 是甲基营养微生物代谢所不可缺少的,能在四
氢叶酸 THF、甲醛及磷酸吡哆醛存在下,催化甘氨
酸生成 L丝氨酸 [ 1, 2]。但它的存在与否并不影响兼
性甲基利用菌
在其它多碳化合物上的生长。由于甲基化合物
相对来说结构相对简单且价格便宜, 所以运用甲基
利用菌中的 g lyA基因及其编码的酶 SHMT来进行
L丝氨酸的生产具有重要的意义。近年来, 国内外
均在寻找催化活性更高的酶以提高酶法制备 L丝
氨酸的生产效率。也早就有一些成功利用酶法或微
生物发酵法工业化生产 L丝氨酸的报道 [ 3, 4] , 但来
源于甲醇利用中的 SHMT酶来生产的例子还未见报
道, 武波等 [ 5, 6]对 M ethy lobacterium sp. M B200生产
L丝氨酸有所研究, 但离产业化阶段还有较远的距
离。为了进一步充分利用甲醇利用菌及其产 L丝
氨酸的能力, 对 SDM 11中的 g lyA基因进行了克隆
及特性研究,以获得更多的 SHMT酶资源。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
1 材料与方法
11 材料
111 菌株与质粒 菌株 SDM 11为本室分离保
存,质粒 pETblue2、大肠杆菌 BL21 ( DE3)和 DH5
均购自 N ovagen公司。
112 培养基及生长条件 大肠杆菌生长用 LA、
LB培养基,于 37 培养。菌株 SDM 11参照文献 [ 7]
中的培养基,于 32 培养。抗生素根据需要加入, 使
用浓度分别为 Amp 200 g /mL; Cm 10 g /mL。
113 酶及试剂 PCR反应所用 DNA聚合酶及
其缓冲液购自 TaKaRa和 MB I公司, 限制性内切酶、
蛋白酶 K、T4 DNA连接酶及其缓冲液和杂交试剂
盒、DNA纯化 /回收试剂盒购于美国 Prom ega公司大
连分公司,其它普通试剂均为分析纯。
12 方法
121 DNA操作及序列分析 质粒 DNA提取、限
制性内切酶、质粒去磷酸化、DNA片段回收、DNA连
接及转化、总 DNA提取、三亲接合试验、等均按标准
程序进行; PCR引物由上海生物工程公司合成;
DNA序列测定由上海生物工程公司完成; DNA序列
分析由 NCB I中提供软件在线完成。
122 g lyA基因的克隆 根据 NCB I中已报道的
M ethy lobacterium ex torquens AM1的 g lyA基因序列设
计 PCR引物,并在上游引物 5!末端加入 BamH I限
制性酶切位点和 3个保护性碱基 CTC, 为调整 GC
含量与 Tm值,下游引物 5!末端加入 Sal I限制性酶
切位点和 3个保护性碱基 TTC。经 DNAStar软件分
析,具有较好的特异性。引物由上海生工生物工程
技术有限公司合成,引物序列:上游 引 物 P1为 5!
ctcggatccatgagcgccggaactgcga3!, 下游引物 P2为 5!
ttcgactcaggcgtagatcgggaacc3!,下划线处分别为酶切
位点。以 SDM 11的染色体 DNA为模板, PCR的反
应程序为 96 , 5 m in; 95 , 40 s; 57 , 30 s; 72 ,
1 m in; 30个循环; 72 延伸 3 m in。反应结束后,取
出反应混合液 10 L进行电泳,检测是否扩增到目
的片段。电泳检测正确后, 将该 DNA片段连接到
pGEM T E asy载体上, 并送至上海生工生物工程技
术有限公司进行测序验证。
123 表达菌株的构建 目的片段经 BamH I及
Sal I限制性内切酶从 pGEM T Easy载体上切下后,
连接到同样经 BamH I及 Sal I双酶切的 pETblue2
表达载体上 (该重组质粒命名为 pET /glyA ), 导入到
大肠杆菌 DH5感受态细胞中, 并在含有 100 g /mL
氨苄青霉素和 IPTG的 LB琼脂平板上进行初筛,筛
选得到的白色菌株进一步用碱抽提法提取质粒酶切
及 PCR鉴定。确认连接正确的重组质粒再进一步电
脉冲导入到大肠杆菌宿主菌 BL21( DE3), 并在含有
200 g /mL氨苄青霉素和 10 g /mL羧苄青霉素的
LB琼脂平板上进行筛选。挑取单菌落,提取质粒,并
作 PCR鉴定, 上海生工生物工程技术有限公司测序
鉴定,将鉴定正确的阳性克隆作为表达菌株。
124 重组 SHMT蛋白的表达与纯化 对重组菌
进行诱导使蛋白表达,并优化重组菌浓度梯度、诱导
时间度和诱导剂 IPTG浓度梯度等表达条件。重组
菌浓度设定范围为 OD 600值 0 6- 0 8;诱导时间定
范围为 2- 8 h;诱导剂终浓度设定范围为 01- 10
mmo l/L。经 SDSPAGE 5%胶、10%分离胶电泳后,
挑选出最佳的诱导表达条件进行表达。
将培养的菌液离心后,收集菌体,加入等量无菌
水混匀后,利用超声波破碎细胞, 并 14 000 r/m in离
心 10 m in, 吸取上清于 4 保存备用。装填 N iNTA
亲和层析柱,按常规上 N i+层析柱: 先平衡层析柱,
平衡缓冲液 ( 20mmo l /L T irsHC ,l 05 mo l /L N aC ,l 5
mmo l/L咪唑 pH79) ;低速上样后,再用同样的平衡
缓冲液洗柱去杂蛋白;最后洗脱目的蛋白,洗脱缓冲
液 ( 20 mmo l/L T irsHC,l 05 mol /L NaC,l 10 - 200
mmo l/L咪唑 ), 收集洗脱峰, 通过 SDSPAGE电泳
检测纯化效果。
125 重组蛋白的酶活检测 在黑暗环境中加好
反应体系 ( 2 mL) : 200 L DL苯基丝氨酸; 40 L磷
酸吡哆醛; 200 L CTAB; 1 360 L ddH2O; 100 L
酶液; 100 L 05 mM磷酸钾 Buffer, 置于 37 振荡
反应 4 h。测量上清的 A 279值。根据 A279 - 苯甲醛
浓度回归方程确定反应液中苯甲醛浓度。酶活定
义: 在 37 下, 2 mL反应体系中,每小时产生 1 mo l
苯甲醛的量为 1个酶活单位 (U )。
2 结果与分析
21 g lyA基因的克隆及序列分析
以M ethylobacterium ex torquens AM1的 g lyA基
因的序列设计引物,以 SDM 11的染色体 DNA (图 1)
142
2010年第 5期 孔庆胜等:甲醇利用菌 SDM 11中 g lyA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
为模板, PCR得到一条 14 kb的 DNA片段 (图 2)。
将该片段回收连接到 pGEM T E asy载体上, 送上海
生物工程公司测序。经序列分析发现该片段中包含
了一个完整的开放阅读框。将测序获得的 14 kb
核苷酸序列输入计算机, 通过 BLAST软件分析, 发
现与已报道测序的 M ethy lobacterium ex torquens AM1
的 g lyA基因在核苷酸水平上同源性有 95% ,在氨基
酸水平上同源性有 98% (图 3)。
M. /H ind∀ Maker; 1.提取的 SDM 11染色体 DNA
图 1 SDM 11染色体 DNA
M. 1kbM arker; 1. glyA基因
图 2 PCR扩增的 glyA基因
图 3 glyA基因的氨基酸序列
22 表达菌株的构建
将连有 g lyA 基因的 pGEM T Easy 载体经
BamH I和 Sal I酶切后, 回收 g lyA基因片段, 连接
到经相同酶切的载体 pETb lue2中, 导入到大肠杆
菌 DH5感受态细胞中, 筛选得到的白色菌株进一
步提取质粒酶切 (图 4 )及 PCR鉴定,确认连接正确
的重组质粒再进一步电脉冲导入到菌株 BL21
( DE3)中,从而得到重组表达菌株。
23 重组菌株的诱导表达
重组菌株经 IPTG诱导后,取 300 L菌液离心
收集菌体,加 300 L TrisHC l pH 80缓冲液, 超声
破碎后, 12 000 r/m in离心 10m in,取上清液做 SDS
PAGE,结果见图 5。重组菌在分子量约为 52 kD处
有特异性蛋白条带,与理论推测的分子质量相符,表
明 g lyA基因在 BL21( DE3) pLysS中得到了表达, 目
的蛋白基本是以可溶的活性蛋白形式存在。将裂解
后的上清液过处理好的 N iNTA柱, 并采用不同浓
度的洗脱缓冲液洗脱,并采用多管收集的办法收集,
其中一管收集的蛋白液基本不含有杂蛋白达到了电
泳纯 (图 6)。
143
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
M. 1 kbM arker; 1. pET /glyA质粒; 2. pET /glyA
质粒 B amH I与 Sal I酶切产物
图 4 pET / glyA质粒酶切验证
M.蛋白质M arker; 1.加 IPTG作为诱导剂培养的含 pETb lue2
质粒的 BL21 ( DE3 ) ; 2. 加 IPTG作为诱导剂培养的
含 pET /g lyA质粒的 BL21 ( DE3 ) ; 3. 不加诱导剂培养
的含 pET /glyA质粒的 BL21( DE 3 )
图 5 glyA基因在 BL21(DE3) pLysS菌株中的表达
M.蛋白质 M aker; 1.纯化的 SHMT重组蛋白
图 6 目的蛋白的纯化
24 重组蛋白酶学性质的初步分析
将纯化好的酶一部分放在 4 冰箱保存, 一部分
用于酶学性质的初步测定,按照反应体系加入各种反
应物后,在 32 下进行反应, pH72,反应 1 h后,测得
1mL菌体所纯化得到的 SHMT酶活力为 113 U。
3 讨论
SHMT在生物体内负责甘氨酸与丝氨酸之间的
相互转换,由 g lyA基因编码, g lyA基因是生物体中
的一种重要基因, 自然界中的许多生物体都有 g lyA
基因,并能自身产生 SHMT,如细菌中的 Eco li,植物
中的含羞草,动物中的兔肝脏、人肝脏 [ 8, 9]等, 自然
界中的一般的菌体内都含有 g lyA基因。在含有单
碳循环的大多数微生物体内, 该基因是丝氨酸循环
中的一个关键基因,所编码的丝氨酸羟甲基转移酶
是甲基营养微生物代谢所不可缺少的,但它的存在
与否并不影响微生物在其他多碳化合物上的
生长 [ 10]。
在已经报道的利用微生物发酵生产 L丝氨酸
的系统中, 甲基营养型细菌产 L丝氨酸的产量是较
高的, 而且所用的甲醇和甘氨酸均为廉价原
料 [ 11, 13, 14] ,因此可以获得更高的利润。本研究从菌
株 SDM 11中克隆到了一个 g lyA基因, 与 AM1的
g lyA基因的序列相似性为 95%, 氨基酸序列的相似
性为 98%, , 该基因编码 468个氨基酸, 预测的分子
量大小为 522 kD, 等电点为 702。为进一步利用
生物技术手段和 g lyA基因构建高效的基因工程菌
株提高丝氨酸羟甲基转移酶的表达量等方法奠定了
基础,从而为提高甲基营养型细菌产 L丝氨酸提供
了前提条件。
参 考 文 献
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(下转第 157页 )
144
2010年第 5期 于天飞等:猪传染性胃肠炎病毒 S基因 B和 C抗原位点片段在毕赤酵母中的表达
报道的一种 TGEV自然变异株, PRCV与 TGEV相
比主要是在 S基因的 5!端约 200 bp处开始存在一
约 621- 672碱基的缺失 [ 5, 6] , 进而丧失了 B、C抗
原位点。PRCV主要在欧洲、美洲流行,亚洲近几年
也有发生的报道。PRCV主要在呼吸道和肺组织中
增殖, 不引起腹泻、不产生或仅产生轻微的呼吸道疾
病症状。PRCV和 TGEV 具有极相似的抗原结构,
用常规血清学方法难以区分 PRCV 和 TGEV [ 7 - 9 ]。
本试验所获得蛋白为 PRCV缺失部分, 避免了潜在
的 PRCV感染对检测 TGE的干扰。本研究探讨了
TGEV S基因 B和 C抗原位点片段在毕赤酵母表达
系统中进行分泌表达的可行性,为进一步优化表达
条件以提高表达量以及探索其作为 TGE血清学诊
断试剂的可行性打下了良好的基础。
参 考 文 献
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