全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-04-15
基金项目:国家863重点项目(2007AA02Z207);国家973重点项目(2007CB707804);教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-07-0380)
作者简介:林琳(1983-),女,辽宁沈阳人,硕士研究生,研究方向:代谢与代谢工程;Tel:(0510)85918206,E-mail:eileenjn@126.com
通讯作者:许正宏,Tel:(0510)85918206,E-mail:zhenghxu@163.com
L-丝氨酸(L-Serine)是一种重要的氨基酸,广泛应用于医药、食品及化妆品行业。L-丝氨酸的生产方法
主要有蛋白水解法、化学合成法、酶法和发酵法[1~3]。由于 L-丝氨酸处于生物体中氨基酸代谢的中间位置
(图 1),参与许多生物物质的合成,代谢运转速度极快,因此采用直接发酵法生产 L-丝氨酸成为氨基酸生
直接利用糖质原料产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌glyA
基因序列分析
林琳 2 窦文芳 2 张晓梅 1 许泓瑜 1 许正宏 1 王正祥 2
(1江南大学医药学院制药工程实验室,无锡 214122;2江南大学生物工程学院,无锡 214122)
摘 要: 以能够利用糖质原料产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)SYPS-062glyA基因为研
究对象,比较C.glutamicumSYPS-062与C.glutamicum模式菌株ATCC13032的glyA基因的异同。分别以 SYPS-062及
ATCC13032基因组为模板,利用PCR技术获得丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA。核苷酸序列分析结果表明,来源于
SYPS-062和ATCC13032的glyA基因片段全长均为1305bp,编码 434个氨基酸,分子量为 46.5kD,基因的同源性为
99.54%,存在6个核苷酸的差异,引起一个氨基酸残基的突变。将获得的基因分别在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21
(DE3)中诱导表达。酶活测定结果显示,2种不同菌株来源的重组SHMT的比活力稍有差异,说明 SYPS-062glyA基因的
差异对其表达产物SHMT蛋白构型及功能影响不大。提示对于C.glutamicumSYPS-062能够利用糖质原料产L-丝氨酸
的机制解析应进一步从glyA基因的转录水平、翻译水平及胞内SHMT辅酶的供给情况等方面进行深入研究探讨。
关键词: L-丝氨酸 谷氨酸棒杆菌 glyA基因 直接发酵
AnalysisofglyAGenefrom CorynebacteriumglutamicumSYPS-
062WhichCanProduceL-serinefrom SugarSubstances
LinLin2 DouWenfang2 ZhangXiaomei1 XuHongyu1 XuZhenghong1 WangZhengxiang1
(1LaboratoryofPharmaceuticalEngineering,SchoolofMedicineandPharmaceutics,JiangnanUniversity,Wuxi214122;
2SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122)
Abstract: WildcorynebacteriumglutamicumSYPS-062candirectivelyproductL-serinefrom sugarsubstances.This
articlewasforcusedontheglyAofSYPS-062tocomparewithcorynebacteriumglutamicumATCC13032.ThetwoglyA
geneswereampilifiedbyPCR method,whichusedSYPS-062andATCC13032genomesastemplatesrespectively.The
resultofnucleotidesequenceanalysisshowedthatglyAwasa1305bpfragment,encoding434aminoacids,withmolecular
weightofSHMT46kDandgenehomologyto99.54%.Diferencesexistonsixnucleotidewhichmeansoneaminoacid
hasbeenchanged.ThetwosourcesglyA geneswereclonedintothevectorpET-28a,andthentransformedinto
EscherichiacoliBL21(DE3)toinduceexpresion.ItwasappearedthatthetwoglyAgenescannotleadtodiferencesof
activityofserinehydroxymethyltransferase.Analysisofthemechanism ofC.glutamicumSYPS-062ofproducingL-serine
shouldbefurtherresearchedfrom theglyA genetranscription,translation,aswelasthelevelofintracelularSHMT
coenzymesupply.
Keywords: L-Serine Corynebacteriumglutamicum glyA Directfermentation
2008年第5期
产领域的瓶颈之一,同时也成为氨基酸研究领域的热点
问题。
丝氨酸羟甲基转移酶(SerineHydroxymethyltransferas
eEC2.1.2.1,SHMT)由 glyA基因编码,催化 L-丝氨酸与
L-甘氨酸的相互转化反应,同时向四氢叶酸(THF)传递
一碳单元。前人研究表明 SHMT活力的下降可以直接导
致谷氨酸棒杆菌积累 L-丝氨酸[4]。在微生物的 L-丝氨酸
代谢途径中约有 16%的 L-丝氨酸用于组装成蛋白质,为
细胞生长提供原料;而大多数 L-丝氨酸则经过丝氨酸羟
甲基转移酶(SHMT)分解为甘氨酸和一碳单元而进入下
一步的代谢[5]。本试验的前期研究表明:菌株 SYPS-062的
L-丝氨酸降解能力与模式菌株 C.glutamicumATCC13032
相比较弱;菌株 SYPS-062生长较为缓慢,分析原因极有
可能是由于一碳单元供给不足。SHMT粗酶液的比活力测定结果表明,来源于 C.glutamicumSYPS-062的
SHMT的酶活力明显低于不积累 L-丝氨酸 C.glutamicumATCC13032的 SHMT。目前,国内对 glyA基因的报
道比较多,但都是从前体发酵法的角度加强 glyA基因的表达从而提高甘氨酸转化为 L-丝氨酸转化率[6,7],
而尚未见文献报道不同来源的 glyA基因的差异。
以本实验室筛选获得的一株能够产 10g/LL-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)
SYPS-062为实验材料,克隆来源于 SYPS-062中的丝氨酸羟甲基转移酶的编码基因 glyA,然后对其核苷酸
序列、表达产物的氨基酸序列以及其正向活力进行比较分析,为解析菌株 SYPS-062能够直接利用糖质原
料产 L-丝氨酸的机制提供了新的思路。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1 菌株和质粒 谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、SYPS-062,大肠杆菌(Escherichia
coli)BL21(DE3),质粒载体 pET-28a由本实验室保藏。pMD19-TVector购自 TaKaRa生物公司。重组大肠杆
菌 BL21(pET-28a-glyA(S))、BL21(pET-28a-glyA(W)),为本研究中构建。
1.1.2 工具酶和试剂 实验用限制性内切酶 BamHI、NotI、T4DNA连接酶购自 Fermentas公司;pfuDNA
聚合酶购自南京天根公司;细菌基因组提取试剂盒,Bradford蛋白含量试剂盒,琼脂糖凝胶回收试剂盒及小
量质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、小分子量蛋白质标准、咪
唑为上海生工生物工程技术服务有限公司产品;DL-苯基丝氨酸购自 Sigma公司。除特别注明外,试验用各
种试剂均为国产分析纯。
1.2 培养基和培养条件
1.2.1 培养基 LB培养基:10g/L蛋白胨,5g/L酵母粉,10g/LNaCl,去离子水配制,自然 pH。固体培养基添
加 2%的琼脂。固体和液体培养基在需要时加入硫酸卡那霉素至 50μg/ml。
1.2.2 培养条件 (1)谷氨酸棒杆菌在 30℃振荡培养过夜,往复式摇床转速为 110r/min。(2)大肠杆菌在
37℃振荡培养过夜,往复式摇床转速为 110r/min。
1.3 分子克隆技术
SYPS-062及 ATCC13032的基因组制备使用细菌基因组提取试剂盒。质粒 pET-28a的提取和纯化使用
小量质粒提取试剂盒。DNA酶切,连接和转化均参考文献[8]。
根据同源性,参照 Corynebacterium.glutamicumATCC13032glyA基因序列(登陆号为 3343293)设计一对
图 1 L-丝氨酸代谢简图
PGDH:磷酸甘油酸脱氢酶;PSAT:磷酸丝氨酸转氨酶;PSP:
磷酸丝氨酸磷酸化酶;SHMT:丝氨酸羟甲基转 移 酶 ;
SerDH:丝氨酸脱氨酶/脱氢酶
林琳等:直接利用糖质原料产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌glyA基因序列分析 177
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
寡核苷酸引物:上游引物 P1:5-TAGGATCCATGACCGATGCCCACCAA-3,下游引物 P2:5-CTGCGGCCGCTT
AGACGATGGTCCAGTCTTC-3。 上 下 游 引 物 分 别 引 入 BamHI,NotI酶 切 位 点 。 分 别 以 SYPS-062及
ATCC13032染色体 DNA为模板进行 PCR扩增。循环参数为:95℃预变性 4min,94℃变性 45s,52℃退火
45s,72℃延伸 90s,反应为 33个循环,最后 72℃延伸 10min。
引物合成由上海生工生物工程服务技术有限公司完成。DNA序列测定由上海捷瑞生物工程有限公司
完成。引物设计及 DNA序列分析采用 DNAman5.2.2软件。
1.4 重组丝氨酸羟甲基转移酶的表达与纯化
1.4.1 重组丝氨酸羟甲基转移酶的表达 将获得的阳性克隆子,即重组大肠杆菌 BL21(pET-28a-glyA(S))
和 BL21(pET-28a-glyA(W))分别接种于含硫酸卡那霉素 50μg/ml的 LB培养基中,37℃振荡培养(往复式
摇床转速为 110r/min)至对数生长中后期,加入 IPTG至终浓度 0.5mmol/L,30℃诱导培养 2.5h。
1.4.2 重组丝氨酸羟甲基转移酶的纯化 8000r/min,10min离心,收集菌体,用 PBS(pH7.4)缓冲液重悬。
将洗涤重悬的菌体进行超声波裂解后,离心所得上清用 1ml镍鳌合琼脂糖凝胶 FF亲和柱纯化,采用不同
浓度的咪唑缓冲液进行阶段洗脱,得到纯化的重组目标蛋白。
重组蛋白的大小和纯度检测使用 SDS-PAGE电泳 (5%浓缩胶及 12%分离胶的不连续垂直平板电泳,
考马斯亮蓝 R-250染色)。
重组蛋白的含量测定使用 Bradford试剂盒。
1.5 丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的酶活力测定[9]
1.5.1 SHMT酶活力测定原理 SHMT酶可催化 DL-苯基丝氨酸分解产生苯甲醛,后者在 279nm处有特征
性的强烈吸收。
1.5.2 SHMT酶活力测定方法 1ml纯化后重组酶蛋白溶液和 1ml底物溶液 (50mmol/LDL-苯基丝氨酸,
50μmol/L磷酸吡哆醛)制备反应液,在 30℃振荡反应 1h,以 5000r/min离心反应液 10min,取上清,测定 A279
值,根据 A279-苯甲醛浓度回归方程确定反应液中苯甲醛浓度。
1.5.3 SHMT的酶活定义 30℃在1ml底物溶液中,蛋白反应1h产生1μmol苯甲醛定义为一个酶活单位(U)。
2 结果与分析
2.1 glyA基因的扩增与测序
2.1.1 glyA基因的扩增 分别以 SYPS-062和 ATCC13032的基因组总 DNA作为模板,扩增得到 1.3kb左
右的 DNA片段(图 2)。克隆到 pMD19-T载体中,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
2.1.2 glyA基因的测序结果及编码序列分析 测序结果表明扩增获得的两条基因全长均为 1305bp,编码
434个氨基酸,理论分子量为 46.5kD。将该测序结果
进行 blast比对分析,SYPS-062的 glyA基因是一个
包含起始密码子 ATG,终止密码子 TAA的完整开放
阅读框(ORF),与谷氨酸棒杆菌 ATCC13032的 glyA
基因高度同源,同源性为 99.54%仅存在 6个核苷酸
碱基的差异(表 1)。
采用 DNAMAN5.2.2软件对以上 6个核苷酸碱基的差异做进一步分析。来源于 SYPS-062的 glyA基因
翻译产物与 ATCC13032的 glyA基因翻译产物仅第 393位氨基酸残基的存在差异,即由 Asp突变为 Asn,其
他核苷酸碱基的差异均导致氨基酸残基的同义突变。
2.2 重组大肠杆菌 BL21(pET-28a-glyA(S))和 BL21(pET-28a-glyA(W))的构建
将上述 2种分别连接有 SYPS-062和 ATCC13032的 glyA基因的 pMD19-TVector经 BamHI,NotI双酶
切,回收 1305bp的片段,连接到载体 pET-28a,得到重组质粒 pET-28a-glyA(S)和 pET-28a-glyA(W),酶切
表 1 CorynebacteriumglutamicumATCC13032和
SYPS-062的 glyA基因的核苷酸差异
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鉴定结果如图 3所示。结果显示目的基因已经分别成功克隆入表达载体 pET-28a中。将鉴定过的重组质粒
pET-28a-glyA(S)和 pET-28a-glyA(S)分别转化到大肠杆菌 BL21(DE)中获得重组大肠杆菌 BL21(pET-28a-
glyA(S))和 BL21(pET-28a-glyA(W))。
图 2 谷氨酸棒杆菌 SYPS-062及 ATCC13032
glyA基因的 PCR扩增
图 3 重组质粒 pET-28a-glyA(S)及 pET-28a-
glyA(W)酶切鉴定结果
1:DL2000分子量标准;2~3:SYPS-062glyA基因 PCR产物;
4~5:ATCC13032glyA基因 PCR产物
1:DL2000标准;2,3:重组质粒 pET-28a-glyA(S)BamHI和
NotI双酶切片段;4,5:重组质粒 pET-28a-glyA(W)BamHI
和 NotI双酶切片段;6:λDNA/HindⅢ 标准
2.3 glyA基因在大肠杆菌中的表达与产物的纯化
以大肠杆菌 BL21(DE3)作对照,经 IPTG诱导后的重组大肠杆菌 BL21(pET-28a-glyA(S))和 BL21
(pET-28a-glyA(W))全细胞 SDS-PAGE电泳(图 4),在 46.5kD位置出现明显特征条带,与 NCBI数据库中
信息相符,说明已经存在表达产物。
将纯化后的蛋白进行 SDS-PAGE电泳分析。结果表明 glyA基因的表达产物经纯化后为 46.5kD的单一
条带,说明已经获得了单一的 glyA基因的表达产物,即重组丝氨酸羟甲基转移酶 SHMT(图 5)。Bradford蛋
白含量检测试剂盒对纯化后的蛋白进行定量,得到来源于 SYPS-062和 ATCC13032的重组丝氨酸羟甲基转
移酶的浓度分别为 2.2mg/ml和 1.8mg/ml。
图 4 重组大肠杆菌 BL21(pET-28a-glyA(S))和 BL21
(pET-28a-glyA(W))的全细胞蛋白电泳分析 图 5 2种重组蛋白纯化结果
1:大肠杆菌 BL21;2:IPTG诱导重组大肠杆菌 BL21(pET-
28a-glyA(S)2.5h;3:IPTG诱导重组大肠杆菌 BL21(pET-
28a-glyA(W))2.5h;4:蛋白分子量标准
1:纯化后的重组蛋白 SHMT(W);2:纯化后的重组
蛋白 SHMT(S);3:蛋白分子量标准
林琳等:直接利用糖质原料产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌glyA基因序列分析
2.4 重组 SHMT的酶活力的测定与比较分析
为了探讨 SYPS-062利用糖质原料生产 L-丝氨酸的机理,分别对来源于 SYPS-062和 ATCC13032的重
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
组 SHMT进行活力测定,并计算 2种不同来源的重组 SHMT
的比活力(图 6)。经过比较分析得出如下结果,2种不同菌株
来源的重组 SHMT的比活力稍有差异,说明 2种不同来源的
glyA基因的差异对 SHMT的活力影响不大。由此,可进一步进
行推测第 393位氨基酸残基的错译突变点对 glyA基因的表
达产物即重组 SHMT的蛋白质高级构型的影响作用很微弱。
3 讨论
以能够利用糖质原料产 L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌 SYPS-
062的 glyA基因为研究对象,对其核苷酸序列、表达产物的氨
基 酸 序 列 以 及 其 正 向 活 力 与 谷 氨 酸 棒 杆 菌 模 式 菌 株
ATCC13032进行比较分析。试验结果排除了对 SYPS-062glyA基因序列突变的推测。基因的表达除了由基
因自身的开放阅读框决定外,还受到各种调控元件的调节。这种调节作用会表现在该基因转录水平,从而
造成基因表达量的变化,所以还应该对 SYPS-062glyA基因的调控元件作以研究。同时,辅酶对生物酶活性
的影响也是值得注意的关键问题,如果辅酶存在供给不充分,同样可以在宏观上表现出 SHMT活力低的结
果。综上所述,对于 C.glutamicumSYPS-062能够利用糖质原料产 L-丝氨酸的机制解析应逐步展开对 glyA
基因的转录水平、翻译水平以及胞内 SHMT辅酶的供给情况等的方面的深入研究探讨。
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图 6 2种不同来源的 SHMT的比活力比较
1:重组质粒 pET-28a-glyA(S)表达纯化后得到的
SHMT的比活力 2:重组质粒 pET-28a-glyA(W)
表达纯化后得到的 SHMT的比活力
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