全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
CHO工程细胞株低血清培养的初探
马爱瑛 1 周栋 2 李敏 2
(1北方民族大学生物科学与工程学院 ,银川 750021; 2宁夏大学生命科学学院 教育部重点实验室 ,银川 750021)
　　摘 　要 : 　以 DMEM∶F12 (1∶1)为基础培养基 ,对 CHO细胞的低血清培养进行了初步探索 ,降低培养基中血清含量 ,观察
了细胞在 10%、5%和 1%等不同浓度低血清培养条件下生长状态和外源蛋白表达活性的变化。试验结果表明 :在含 1%血清
的 F12∶DMEM (1∶1)培养基中 ,细胞仍能保持良好的生长状态 ,且培养上清中的目的蛋白活性与常规血清浓度 10% DMEM培
养条件下的活性接近。从而达到了既可以降低生产成本 ,又可以降低纯化难度的目的。
关键词 : 　 CHO2pCSA工程细胞株 t2PA rPA ( K) 低血清培养 基础培养基
Pr imarily Explor ing on Serum2low Culture of Engineer ing Cells of CHO
Ma A iying1 Zhou Dong 2 　L i M in2
(1 The L ife Science and Engineering School of N orth U niversity for N ationalities, Yinchuan 750021;
2 The Key Laboratory of Education M inistary of L ife Science School of N ingxia University, Yinchuan 750021)
　　Abs trac t: 　This experiment has exp lored the serum2low culture of engineering cells of CHO, without affecting the p rotein ex2
p ressed, we used DMEM∶F12 (1∶1) to culture the cells which serum concentrations from 10% down to 1% , the growth of cells was
well. It p roved that according to the features of different serum training, m ixed these serum training reasonably, the effectiveness of train2
ing cells can be imp roved in some degree. It not only can low the costs of p roduction, but also can simp lify the p rocess of sublimating.
Key wo rds: 　Engineering cells of CHO2pCSA t2PA　rPA ( K) Serum2low medium Base medium
收稿日期 : 2009207227
基金项目 :北方民族大学科研项目 (2008Y025) ,宁夏自然科学基金项目 (NZ0842)
作者简介 :马爱瑛 (19782) ,女 ,讲师 ,研究方向 :分子生物学 ; E2mail: puresa@163. com
通讯作者 :李敏 , E2mail: lim@nxu. edu. cn
基因工程技术的重要手段和目的之一就是在一
个合适的系统中高效表达外源基因 ,从而生产重组
蛋白。随着动物细胞培养技术的发展 ,哺乳动物细
胞成为生产重组蛋白质的重要表达系统 ,目前在基
因工程中广泛使用的哺乳动物细胞是 CHO细胞 ,该
细胞属于成纤维细胞 ( fibroblast)是一种非分泌型细
胞 ,它的一个重要优点是其自身很少分泌内源蛋白。
在 CHO细胞培养中 ,血清是培养基中必不可少的部
分。但血清中的蛋白含量超过 4 000 mg/L,给基因
工程产品大规模生产、分离纯化、质量控制及应用带
来许多问题。因此 ,如果用含血清的培养基来培养
CHO细胞会给目的蛋白的分离纯化造成很大的困
难 ,使 CHO细胞的优点得不到发挥。为此 ,研究者
努力开发无血清培养基。
近年来 ,虽然无血清培养基的研究取得了很大
进展 ,但由于不同细胞系对各种添加物及浓度要求
不同 ,所以开发的无血清培养基常常只能针对一种
或一类细胞 ,缺乏通用性。而且无血清培养基成分
复杂 ,一般在基础培养基中需要添加不同浓度的氨
基酸、核苷酸、维生素、微量元素、脂类物质、载体蛋
白 ,生长因子、保护剂等 ,因此 ,确定一个良好的无血
清培养基配方的工作量很大 ,一般实验室很难单独
开发 ,而市场上商品化的无血清培养基价格也比较
昂贵。
基于以上原因 ,本试验对 CHO细胞的低血清培
养进行了初步探索 ,期望达到既可以降低生产成本 ,
又可以降低纯化难度。
1 材料与方法
1. 1　菌株及质粒
CHO2pCSA工程细胞株 [内导入 rPA的点突变
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2009年第 11期 马爱瑛等 : CHO工程细胞株低血清培养的初探
体 rPA ( KHRR296～299AAAA ) ,简称 rPA ( K) ]由本
室保存。
1. 2　主要试剂
F212、DMEM培养基、G418购自 GIBCOBRL 公
司 ;标准品 t2PA比活 ( 100 IU /μg)为 Sigma公司产
品 ;纤维蛋白原、凝血酶和纤维蛋白酶原购自中国药
品生物制品检定所 (北京 )。
1. 3　CHO2pCSA工程细胞株的低血清培养
用细胞计数板直接计数 CHO细胞的密度 ,以
1 ×105 /m l的密度转入 24孔培养板上 ,待细胞完
全贴壁换低血清培养基。以 CHO 细胞的生长为
指标 ,分别用 F12、DM EM、F12∶DM EM ( 1∶1 )作为
基础培养基 ,在各组培养基中分别再设 3个分组 ,
分别添加 1%、5%和 10%的血清 , 48 h培养。同时
以纤维蛋白平板 ( FAPA )法 [ 1 ]检测其外源蛋白表达
活性。
1. 4　不同浓度低血清培养基蛋白含量的比较
按照文献 [ 2 ] ,对 48 h培养上清进行 SDS聚丙
烯酰胺凝胶电泳 ,分离胶浓度为 12%。
1. 5　血清浓度对 CHO2pCSA工程细胞株传代的影响
CHO2pCSA 经含有 1% 血清的 F12 ∶DMEM
(1∶1)培养基培养 72 h后 ,分别用含 5%、10%和
15%血清的培养基传代。12 h观察细胞的生长
形态。
1. 6　核型分析
按照文献 [ 3 ] ,进行培养细胞的核型分析 ,以
Giem sa染色 ,用普通光学显微镜观察 ,分析畸变类
型 ,计算畸变率。
2　结果
2. 1　CHO2pCSA工程细胞株的低血清培养
各组细胞经 48 h培养形态如图 1,结果表明 :以
F12作为基础培养基 ,只有血清浓度为 10%时细胞
才可正常生长 ,血清浓度达到 5%仍有部分悬浮 ,血
清含量为 1%时 ,细胞大量悬浮、死亡 ; 以 F12 ∶
DMEM (1∶1)作为基础培养基 ,血清含量为 10%经
48 h培养细胞出现密度过大现象 ,血清浓度 5%、
1%情况下细胞仍可生长正常 ; DMEM 作为基础培
养基 ,血清含量为 10%、5%时 ,细胞生长状态正常 ,
但当血清含量降到 1%细胞较多悬浮 ,细胞无法正
常贴壁、生长。
A1～A3. 含 1%、5%、10%血清的 F12培养基培养细胞 48 h后细胞
形态 ; B1～B3. 含 1%、5%和 10%血清的 F12∶DMEM (1∶1)培养基培
养细胞 48 h后细胞形态 ; C1～C3. 含 1%、5%和 10%血清的 DMEM
培养基培养细胞 48 h后细胞形态
图 1　低血清培养细胞 48 h后细胞形态图
各组细胞目的蛋白纤溶活性测定如图 2所示 ,
各组细胞上清中目的蛋白纤溶达活性随着培养基
血清含量的降低而降低 ,同血清浓度条件下 ,上清
中目的蛋白纤溶活性比较顺序为 F12 < DMEM <
F12∶DMEM (1∶1)。综合比较 ,含 1%血清的 F12∶
DMEM (1∶1)培养基培养的细胞上清中的目的蛋白
纤溶活性与常规含有血清 10%的 DMEM培养上清
的接近。
A1～A3. 含 1%、5%、10%血清的 F12培养基培养 48 h后细胞上清 ;
A4～A6. 含 1%、5%、10%血清的 F12∶DMEM (1∶1)培养基培养 48 h
后细胞上清 B1～B3. 含 1%、5%、10%血清的 DMEM培养基培养培
养 48 h后细胞上清 B4. st2PA; B5. CHO细胞上清 ; B6. 空白对照
图 2　低血清培养细胞 48 h后表达上清 FAPA测定
2. 2　不同浓度低血清培养基蛋白含量的比较
SDS2PAGE电泳结果 (图 3)表明 ,培养上清中的
蛋白主要来源于培养基中添加的血清 ,当血清浓度降
低至 1%时 ,培养上清中的杂蛋白含量较血清浓度为
10%时明显降低。进一步利用 B io2Rad凝胶成像仪
Quantity One软件进行分析 ,绘制了蛋白含量的柱状
图 (图 4) ,结果表明当血清浓度降到 1%时 ,培养液中
的总蛋白含量仅为常规培养条件下的 40%。
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2. 3 核型分析
经低血清培养后细胞形态与原来的工程细胞的
没有明显变化。用秋水仙素截获中期分裂相细胞进
行染色体分析 (图 5 ) ,观察分析结果可见表 1。
CHO2dhfr- 细胞、CHO2pCSA工程细胞及 1%胎牛血
清的 F12∶DMEM (1∶1)培养 72 h后的 CHO2pCSA工
程细胞 ,染色体数目不变 ,但均存在各种类型的畸变
细胞 ,包括断裂、四倍体、异着丝粒等 ,其中 CHO2dh2
fr- 细胞畸变率为 8% , CHO2pCSA工程细胞株为
14% , 1%血清的 F12∶DMEM ( 1∶1)培养 72 h后的
CHO2pCSA工程细胞株的畸变率为 18%。　
1. 1%胎牛血清的 F12∶DMEM ( 1∶1)培养 72 h后的 CHO2pCSA工程
细胞 ; 2. CHO2pCSA工程细胞株 ; 3. CHO2dhfr2细胞
图 5　CHO 2pCSA工程细胞核型分析
表 1 细胞染色体检查结果
细胞系 染色体数(条 )
计数细胞
(个 )
畸变细胞
(个 )
畸变细胞类型
断裂 异着丝粒 四倍体
百分率 ( % )
低血清培养后的
CHO2pCSA 20 100 18 7 7 4 18
CHO2pCSA 20 100 14 7 5 2 14
CHO2dhfr2 20 100 8 5 2 1 8
3 讨论
在哺乳动物细胞培养中 ,血清是培养基中必不可
少的部分。血清成分复杂 ,蛋白含量超过 4 000 mg/L。
经研究表明 ,血清中除了含有促进生长的活性成分
外 ,尚有抑制生长的成分 ,如果用含血清的培养基来
培养细胞不仅会给下游的分离纯化造成很大的困
难 ,而且还可能对细胞的生长造成不良影响。同时 ,
血清来源于动物 ,因此经常会被病毒污染 ,这些已知
或未知的病毒往往给培养基中的细胞带来影响 ,导
致细胞生长速度逐渐变慢 ,蛋白产量逐渐下降 ,造成
产量、质量不稳定。目前购自大公司的血清虽经消
毒 ( sterilization) ,几乎可以去除所有支原体 (myco2 p lasma)的污染 ,但并不能保证去除所有的病毒污染。而且不同批次的血清在成分上会存在很大差异 ,当用于工业化生产时 ,常常难以建立标准操作程序 ( SOP) [ 4 ]。因此 ,科学家早在 20世纪 50年代即致力于无血清培养基的研究。无血清培养基的优点已普遍地为人们所认识 :(1)可以避免血清批次间的质量变动 ,提高细胞培养和试验结果的重复性 ; ( 2)避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染 ; ( 3)避免血清组分对试验研究的影响 ; (4)有利于外源培养细胞的分化 ; ( 5)可提高外源蛋白的表达水平并使细胞产品易于纯化。无血清培养基也并非是完美无缺的 ,其不足主
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要表现为细胞的适用普及窄 ,不同类型的细胞甚至
是不同的细胞系或细胞株都可能有各自独特的无血
清培养基组成 [ 5 ] ,细胞在无血清培养基中更易受到
某些机械因素和化学因素的影响 ,培养基的保存和
应用不如传统的合成培养基方便。
根据不同培养基的特点 ,将其合理地混合使用 ,
可在有血清的培养条件下在一定程度上提高细胞的
培养效果。由于不同的细胞对营养成分的需求有所
不同 ,培养基中某些成分的不足 ,可能成为细胞生长
的限制性因素。因此在设计无血清培养基时 ,有必要
在适合的商品化培养基的基础上 ,通过分析细胞的营
养需求对基础培养基进行优化。细胞因子、激素和某
些动物源性蛋白类产品是无血清培养基中支持细胞
生长的蛋白或多肽类添加成分。在设计无血清培养
基时 ,除了考虑不同添加成份的细胞生长刺激作用
外 ,还应考虑其是否成分明确及其使用剂量的大小。
对于非蛋白类添加成分 ,则在分析其对细胞生长影响
的同时 ,还需结合细胞培养的目的 ,分析添加成分对
细胞的某些特定的分化功能的影响。尽可能使所设
计的无血清培养基能满足成分明确 ,蛋白含量低 ,使
用效果好的要求。不同细胞株的添加成分可能存在
差异 ,一般需要自己摸索最优条件。因此 ,无血清培
养基的研制开发是一件繁琐浩大的工程。
本试验对 CHO细胞低血清培养进行了初步探
索 ,期望达到既降低生产成本 ,又降低纯化难度的目
的。以 F12∶DMEM (1∶1)为基础培养基 ,降低培养
基中血清含量 ,观察细胞生长状态和外源蛋白表达
活性的变化 ,试验结果表明 : 1%血清的 F12∶DMEM
(1∶1)培养基培养的细胞生长状态良好 ,上清中的
目的蛋白活性与 10% DMEM培养细胞的接近 ,经过
核型分析证明低血清培养细胞染色体总数没有发生
变化 ,畸变率为 18% ,较原工程细胞 14%的畸变率
有所提高 ,但是仍在正常接受范围内 ;高的血清浓度
在细胞传代过程中是必须的 ,可能是由于血清提供
了贴壁细胞传代生长后贴壁所需要的一些黏附因
子 ,所以低血清培养结束后应用含有 15%血清的培
养基传代。因此 ,根据不同培养基的特点 ,将其合理
地混合使用 ,可在有血清的培养条件下一定程度的
提高细胞培养效果 ,同时大大降低生产成本 ,也更加
有利于目的蛋白的分离和纯化。
参 考 文 献
1　 Kho CW , Park SG, Cho S. Protein Exp ression and Purification, 2005,
39: 1～7.
2　萨姆布鲁克 J,拉塞尔 DW ,分子克隆实验指南 (精编版 ) [M ]. 北
京 :化学工业出版社 , 2008.
3　樊廷俊 ,细胞生物学实验技术 [M ]. 青岛 :中国海洋大学出版
社 , 2006.
4　 Even MS, Sandusky CB, Barnard ND. Trends in B iotechnology,
2006, 24 (3) : 105～108.
5　 Murakari H. Cytotechnology, 1990, 3 (1) : 3.
酶学 (第二版 ) (研究生创新教育系列丛书 ) ·书 　讯 ·
郑穗平　郭勇　潘力　编著
97827203202548720　　  49. 00　　　　　2009年 9月出版
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