全 文 ：
综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 2期
低温纤维素酶的研究进展
董硕 1, 2
迟乃玉1, 2
王鑫 1, 2
张庆芳 1, 2
( 1大连大学生物工程学院,大连 116622; 2辽宁省海洋微生物工程研究中心,大连 116622)


摘
要:
低温纤维素酶在低温下仍具有较高酶活力及较高催化效率, 在应用中能够缩短处理工艺时间, 节省加热或冷
却费用, 且易失活,有着中高温纤维素酶无法比拟的优势。现针对微生物低温纤维素酶的研究现状,包括菌种来源、分离鉴
定、酶学性质、适冷结构及机理研究和基因工程等方面进行综述。
关键词:
低温纤维素酶
结构机理
基因工程
Research Progress of Cold
adapted Cellulase
Dong Shuo
1, 2
ChiNaiyu1, 2
W angX in1, 2
Zhang Q ingfang1, 2
(
1
Co llege of Bioengineering, Dalian University, Dalian 116622;
2
L iaoning MarineM icrobiological Engineering R esearch C enter, Dalian 116622)


Abstrac:t
Cold
adapted ce llu lase can rese rve high ac tiv ity and h igher ca talytic effic iency even a t low tem pera ture. It can reduce
the treatm ent process tim e and costs for heating o r coo ling in the app lication pro cess w ith the advan tage o f h igh temperature cellu lase
can not com pare. In th is paper, the resea rch prog ress on m icrobial co ld
adapted ce llulasew as summarized, inc luding the sources o fm i

croorgan ism, iso lation and identification, enzym atic prope rties, structure and m echanism o f co ld
adapted, and genetic eng ineer ing.
Key words:
Cold
adap ted ce llu lase
S tructura lm echan ism
Genetic eng ineering
收稿日期: 2010
08
17
基金项目:国家
863
计划项目 ( 2007AA091505, 2007AA021306)
作者简介:董硕,男,硕士研究生,研究方向:微生物与发酵工程; E
m ai:l skyhor@ 163. com
通讯作者:张庆芳,女,副教授,博士,研究方向:微生物与发酵工程; E
m ai:l zqf7561@ 126. com
纤维素是自然界中公认的含量最丰富的天然再
生生物资源。利用廉价的可再生纤维素材料生产生
物基产品和生物能对人类的可持续发展至关重要。
研究纤维素酶,从而降低纤维素酶生产成本,改进纤
维素酶活性,对于减少应用成本具有重要意义。纤
维素酶 ( cellulase )是一种复合酶, 能水解纤维素以
获取葡萄糖, 包括内切葡聚糖酶 ( endo
1, 4


D

glueanase, EC3. 2. 1. 4) , CMC 酶; 外切葡聚糖酶
( exo
1, 4


D
g lucanase, EC3. 2. 1. 91) ,即纤维二糖
水解酶, CBH;

葡萄糖苷酶 (

1, 4
D
g lueosidase,
EC3. 2. 1. 21) , BG, 此 3种酶之间存在协同降解纤维
素的作用 [ 1- 3]。
低温纤维素酶与中温酶相比在应用上更具优势
和潜力。其在自然条件下具有较高酶活力及较高催
化效率,可大大缩短处理过程的时间并节省昂贵的
加热或冷却费用,经过温和的热处理即可使其活力
丧失, 不会影响产品品质。因此,鉴于低温纤维素酶
在减少工艺流程、降低生产成本以及节能方面的巨
大优势,对其研究正逐步深入。
1
低温纤维素酶产生菌的分离鉴定
低温环境是地球表面最丰富的环境, 存在着众
多生物体,特别是细菌、酵母菌、单细胞藻类和真菌。
因为这些生物体不需要温度调节, 其内部温度与周
围环境接近。尽管生化反应在低温下的负效应强
烈, 但是这些生物与常温环境中物种一样繁殖、生长
和迁移 [ 4]。目前发现的大多数低温纤维素酶都是
由低温微生物产生的,这些微生物主要分布于两极
区域 (土壤、海水、海泥和探险队遗迹 )、冰川、海底
盆地、纬度较高的冻土区或特殊的低温环境等。
已报道的低温纤维素酶产生菌既有嗜冷菌又有
耐冷菌,一般最适生长温度在 10- 25
, 多数不能
在超过 37
的条件下生长。但据报道 [ 5] , 一些常温
菌株也可以产生低温纤维素酶。经过形态观察、生
理生化试验、及 16S rDNA或 18S rDNA序列分析的
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
结果表明,菌株来源包括近年来研究比较多的交替
假单胞菌 (P seudoalteromonas ), 1995年根据 16S rD

NA序列的特点将它从交替单胞菌属 ( Alteromonas)
中独立出来 [ 5]。其他还包括:芽孢杆菌 ( Paenibacil

lus)、担子菌 ( Basidiomycetes)、瘤胃细菌 ( F ibrobacter
succinogenes)、噬纤维菌 (Cy tophaga fucico la )、纤维
弧菌 ( C ellvibrio )、

、

变形菌纲 (

、

proteobacte

ria)、放线菌门 ( Actinobacteria )、噬胞菌属 ( Cy toph

ag e)、纤维单胞菌属 (C ellulomonas)、小核属 ( Sclero

tium )、木霉 (Trichodermal )、青霉 ( P enicillium )、小孢
霉属 ( Syzygites ehrenberg )以及根霉属 (Rhizopus eh

renberg )。

2
低温纤维素酶酶学性质
2. 1
低温纤维素酶最适作用温度及其稳定性
嗜冷菌和适冷菌能在低温环境中生长繁殖的关
键在于其为适应低温带来的有害影响,在细胞膜、结
构蛋白质和酶等方面发生细微的结构变化, 从而产
生适应低温环境的酶蛋白。Margensin等 [ 6 ]定义适
冷酶为最适反应温度在 30
左右,并且在 0
左右
具有一定的催化效率的酶。 Fe ller等 [ 7]认为, 低温
酶在低温下具有比较高的转化系数、生理系数和较
低的热稳定性。现在研究的低温纤维素酶的最适反
应温度普遍较低,大部分在 5- 40
,并在 0- 5
存
在较高的酶活力,对温度比较敏感,并具有热不稳定
性。曾胤新等 [ 8]在北极楚科奇海分离到交替假单
胞菌 (P seudoalteromonas sp. ) BSw20308, 其低温纤维
素酶最适作用温度为 35
, 在 5
酶活力达到最大
酶活的 50%左右, 酶对热敏感, 在 35
半衰期为 3
h, 25
下酶活稳定。来自海洋芽孢细菌 BME
14的
低温纤维素酶最适 35
,在 5
时酶活为最大酶活
的 65% [ 9]。来自瘤胃细菌 (F ibrobacter succinogenes)
S85的低温纤维素酶最适温度为 25
, 在 0
保持
最大酶活的 70% [ 10]。而低温酶并非只来自低温微
生物, 刘秀华 [ 5]自腐殖质土样中分离得到中温纤维
弧菌 2
3
a,其产酶的最适反应温度为 40
,在 0

时的残留酶活力为最大酶活的 60%, 属于典型的低
温酶, 为低温酶类的来源扩展了思路。
2. 2
离子对于酶活性的影响
来源不同的低温纤维素酶,离子对其影响各异。
金属离子 Ca2 +、Mg2+和 Mn2 +对来自海洋芽孢杆菌
BME
14的低温纤维素酶活性具有激活作用, 而汞、
铜和 EDTA对其具有抑制作用。Mn2+、Fe3+对噬纤
维菌 (Cy tophaga fucico la )菌株 QM 11的低温酶有促
进作用, 而 Cu2+、Pb2+ 对酶反应具有抑制作用。
Na
+离子对瘤胃细菌 ( F ibrobacter succinogenes )菌株
S85的酶活性有着显著的激活作用 [ 9 - 11]。
2. 3
低温纤维素酶最适作用 pH及其稳定性
常温纤维素酶的酶活对环境 pH值很敏感, 已
报道的低温纤维素酶最适 pH范围较广 ( 4- 9), 且
pH稳定性范围比较宽。来源于真菌的低温纤维素
酶 pH普遍较低,如青霉 (P enicillium )菌株 FS010441
的最适 pH值为 4. 2; 产黄青霉 (P enicillium chry sog e

num )菌株 FS010最适 pH为 5. 5[ 12]。纤维弧菌 2
3

a的酶最适 pH 为 5. 0, 且在 pH4 - 10时稳定性良
好, 能保持 90%以上的最高酶活力, 具有很好的耐
碱性 [ 5]。研究最多的交替假单胞菌 ( P seudoaltero

monas) ,其低温纤维素酶最适 pH集中在 6- 8的范
围内,如菌株 RBce l1最适 pH为 6. 7, 菌株 MB1最
适 pH为 7. 2,菌株 Z6、BSw20308、LHG
C
9最适 pH
均为 8[ 8, 13- 16]。而噬纤维菌 ( Cy tophaga fucico la )菌
株 QM11最适 pH为 9. 0, 且在碱性条件下具有较高
的酶活性和较好的稳定性 [ 11]。
3
低温纤维素酶结构及适冷机理的研究
3. 1
结构研究
一般来说,酶的结构决定了酶的性质,对于不同
来源、不同结构的酶, 其具有的酶学性质也是不同
的。近年来,通过基因技术和计算机比对技术的发
展, 对糖苷水解酶的氨基酸序列分析相关性,可将其
分为 82个家族, 其中包括纤维素酶的 13个家族。
到目前为止, 国内外已克隆得到包括 5、6、7、8、9、
12、26、44、45和 48家族在内的 10个家族。已经通
过蛋白质工程技术研究了其中的 5、6、7、8、9和 45
家族 [ 17, 18 ] ,而低温纤维素酶的研究主要集中在 5、7
和 9三个家族。
第 5家族的纤维素酶都属于内切葡萄糖苷酶,
它们的三维构象是一个 (
/
) 8的折叠桶, 在异头碳
原子位通过构型保留来完成催化反应 [ 19]。交替假
单胞菌的 ce lX基因编码一种胞外低温纤维素酶。
其编码一个 1 479 bp, 492个氨基酸组成的蛋白质,
分子量为 52. 7 kD。该 CelX蛋白包括一个属于糖
38
2011年第 2期 董硕等:低温纤维素酶的研究进展
苷水解酶家族 5的 N
末端催化结构域和一个属于
糖基结合模块家族 5的 C
末端纤维素结合结构域。
连接两个区域的连接序列由 105个残基组成。酶谱
活性分析表明, Ce lX由单一酶组分组成。Ce lX主要
的水解产物是纤维二糖 [ 20]。
第 7家族纤维素酶分子的三维构象是由两个

折叠片面对面形成一个

sandw ich。Hou等 [ 12]自
产黄青霉 FS010中克隆到外切纤维素酶 1( cbh1)基
因。 cbh1有 1 590 bp的开放阅读框,编码 529个氨
基酸, 约为 56 kD的蛋白质。氨基酸序列中含有 3
个潜在的 N
乙酰糖基化位点,且连接区域富含苏氨
酸。对氨基酸序列同源性分析表明, 该蛋白属于糖
苷水解酶第 7家族, 与构巢曲霉 ( Aspergillus nidu

lans) cbh1相似性最高 ( 79% )。
第 9家族的酶分子三维构象是一个 (
/
) 6的
折叠桶。Fu等 [ 9 ]通过构建基因文库,将来自海洋的
芽孢杆菌 BME
14中的内切葡聚糖酶基因 Ce l9P克
隆出来。研究表明, 该酶具有一个 1 629 bp的开放
阅读框,编码一个 60 kD的分子量的 542个氨基酸
的多肽。通过比对发现, 这种酶与其他已知的内切
酶的氨基酸相似性最高只有 52%, 具有一个属于糖
基水解酶家族 9的 C
末端催化域。
3. 2
适冷机理研究
纤维素的酶分子由催化区 ( catalyt ic dom ain,
CD)、纤维素结合区 ( ce llulose binding doma in, CBD)
和一个连接序列 ( linker sequence, LS )组成。目前,
对于低温酶适冷机制的研究认为, 低温纤维素酶的
CD区域和 CBD区域与常温纤维素酶相似,都是依
靠 CBD与纤维素分子链结合,然后依靠连接区的柔
性,使 CD区域可以有机会接触到纤维素链产生作
用。而低温纤维素酶主要是通过氢键和盐键的修
饰,增加连接区的柔性,极大地扩大可以结合酶分子
的纤维素的表面积, 从而使其在低温环境下亦具有
较强的酶活 [ 21]。
Garsoux等 [ 22 ]的研究表明, 来自交替假单胞菌
(P seudoalteromonas halop lanktis )的嗜冷纤维素酶
( C el5G) ,连接 CD和 CBD的是一个具有 3个二硫
键形成的 3个环的、超长的、延伸的以及柔韧的连接
区 ( LS)。其 CD和 CBD均属于糖苷水解酶第 5家
族,但其 LS具有 107个氨基,是已经发现的纤维素
酶中最长的。其中以二硫键为基础形成的环状结构
可以增加大部分扩展结构的稳定性。
Sonan等 [ 23]进一步通过蛋白质工程将 LS连续
缩短,先后删去这个模型中的第 1和第 2个环,再通
过用两个丙氨酸取代两个半胱氨酸将剩余的二硫键
桥抑制。后将突变体与全长酶、独立的适冷 CD区
域和中温菊欧文菌的同源酶 Ce l5A进行了动力和热
力学性质比较发现, LS的连续缩短导致对大分子底
物比活力的下降及相对的柔性下降, 并同时提高了
缩短后酶的热稳定性。这表明, 完整长度的低温酶
的长 LS区域对低温和中温的催化活力有利,在适冷
纤维素酶的适冷机制中发挥了至关重要的作用。
同时,与常温酶一样,低温纤维素酶也并非必须
具有 CBD区域。 Berlemont等 [ 13]自施氏假单胞菌
(P seudomonas stu tzeri) Pst_2494中分离到属于糖基
水解酶第 5家族的适冷蛋白 RBce l1, 其不具备 CBD
区域。RBcel1表现出内切葡聚糖酶的活性,能以羧
甲基纤维素作为底物产生纤维二糖和纤维三糖。并
且, RB cel1能够以纤维二糖为底物分解非网状的纤
维素,估计可能与其没有 CBD区域有关。
另一方面普遍认为,低温酶是因为其在低温下
酶促反应的热力学特性, 即较高的 K cat值和较低的
活化能。X iao等 [ 24]采用定向进化方法随机变异常
温纤维素酶, 里氏木霉的内切葡聚糖酶 III( EG III),
并获得了低温突变株W
3。进一步研究酶反应动力
学及热稳定性表明,突变的W
3具有较高的 K cat值,
并较其亲代具有更强的热不稳定性。按照阿仓尼乌
斯方程计算突变体和原始蛋白的活化能分别是
13. 3 kJ/mo l和 26. 2 kJ/mo l。 Iyo等 [ 10]自瘤胃细菌
( F ibrobacter succinogenes) S85中得到两个内切酶, 即
CelG和 EGD。当在 4
时测定, C elG比 EGD的 K cat
值高 33倍, K cat /Km 值高 73倍, 且 Ce lG 热稳定
性差。
但是 Garsoux等 [ 22 ]研究认为动态参数具有温度
适应性,其研究来自交替假单胞菌 (P seudoalteromonas
halop lanktis)的低温纤维素酶 Ce l5G, 其在 4
时的
K cat和 K cat /Km值与 35
时是相似的。因此,对于是
否低温酶具有更高的 K cat值和更低的活化能还有待
进一步研究。
39
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
4
基因克隆和表达
对于常温纤维素酶的基因克隆和表达的研究已
经很多。目前大部分纤维素酶基因的表达水平较
低,纤维素酶基因工程的主要难题是如何实现不同
组分的有效表达和提高表达量。而对真菌中低温纤
维素酶的基因研究发现多个增强子结合位点, 为今
后的提高蛋白表达量提供了依据。
侯运华等 [ 25 ] 2006年首次采用热不对称嵌套
PCR方法克隆了适冷产黄青霉 FS010的 cbh1基因,
以单拷贝在基因组中存在。研究碳源对于 cbh1基
因表达的影响,在用 RT
PCR分析的 9种碳源中纤
维二糖和龙胆二糖为强诱导物,而乳糖和木糖也能
在不同程度上诱导 cbh1基因表达。将其进一步将
cbh1 cDNA在酿酒酵母中表达, 重组 CBH I分子量
为 62 kD,酶活性达到 102. 4 U /mg,最适作用温度为
45
,最适 pH为 5. 5。其采用 TA IL
PCR克隆了产
黄青霉 cbh1基因的 1 316 bp的 5
调控区得到一个
新的启动子。经分析发现, 存在 CRE I、ACE I、ACE II
和 CCAAT增强子结合基序, 对启动子 5
定向缺失。
以 uidA为报告基因,构建了全长及 3个不同长度缺
失启动子的表达载体 pcbh1、pcbhld1、pcbhld2和
pcbh ld3。将 4种报告质粒分别与携带乙酰胺酶基
因的载体 p3S2共转化出发菌株 FS010, 4种表达质
粒转化子均有 GUS活性。证明启动子的 - 200 bp
- 1 316 bp区域内存在多个转录激活因子靶位点。
随着启动子缺失长度的增加, GU S活性逐步降低。
GUS活性最高。全长启动子、缺失 715 bp、915 bp
和 1 115 bp的启动子 GU S活性分别为最高活性
( 316. 8 U /mg)的 100%、66. 7%、49. 3%和 9. 0%。
对于细菌中低温纤维素酶的基因融合表达研究
表明, 融合得到的酶最适温度不变, 而 pH的耐受性
得到优化。游银伟等 [ 26]采用 PCR技术克隆了编码
交替假单胞菌 MB
1的适冷内切

1, 4
葡聚糖酶基
因 celA。将 ce lA基因连入质粒 pGEX
4T
1,构建了
表达质粒 pGEX
ce lA, 在大肠杆菌 BL21中进行表
达。经 37
培养和 18
诱导, 使 ce lA基因在大肠
杆菌 BL21中表达。在菌体破碎后的发酵液上清
中,表达的融合蛋白 GST
Ce lA大约占总蛋白含量的
4% ,浓度大约为 0. 572 mg /mL, 进一步分析融合酶
GST
CelA的性质并与野生型酶进行比较,发现其最
适反应温度仍为 35
,最适反应 pH值由 6. 0升高
到 7. 2, 变成了中性酶, 而且融合酶 GST
CelA更耐
酸碱性的变化。
5
展望
面对目前低温纤维素酶产量较低, 酶活性不高
的现状,如何提高酶的产量将是未来研究的重点之
一。主要在以下几个方面需进一步研究:
( 1)产纤维素酶菌自然选育。菌种的选育是纤
维素酶生产的基础性工作, 为了生产高质量的低温
纤维素酶产品,仍需要进行大量研究。
( 2)诱变育种。其能够大幅度改变菌种的遗传
特性,是得到高产菌株的一种简单、快速、收效显著
的方法。如陈亮等 [ 27, 28 ]通过 UV、DES等诱变绿色
木霉 ( Trichoderma viride ) CNY086, 使酶活力提高了
40%。

( 3)工程菌的构建。随着各种预处理方法的采
用和下游产物的提取技术的应用, 低温纤维素酶基
因克隆和工程菌的构建将成为低温纤维素酶研究的
热点。
( 4)多菌株混合发酵。由于纤维素酶的多样性
和纤维素分子的复杂性, 微生物混合培养或混合发
酵将会越来越受重视。张丹 [ 29]经液体拮抗试验和
两两复配试验, 筛选到高效降解纤维素菌株组合
F3F17和 F21F5, CMC酶的活性分别达到 1. 91 IU /
mL和 2. 04 IU /mL, 纤维素降解率 3w 内均达到
33. 3%。
总之, 低温纤维素酶由于其低温下的高催化特
性, 使之能够在洗涤工业、食品工业、医药纺织和畜
牧业中广泛应用, 简化了工艺、节约了成本和能源,
相信随着对其研究的逐步深入, 必将在工业上有着
广阔的前景。
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(责任编辑
狄艳红 )
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