全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
产低温纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及
酶学性质初步研究
李师翁 孔凯 冯佳丽 李梅 台喜生
(兰州交通大学化学与生物工程学院，兰州 730070)
摘 要: 从青藏高原采集的牦牛粪中，经过 CMC 平板分离得到一株产低温纤维素酶能力较强的放菌 Tibet-YD5227-2，
经 16S rDNA序列比对分析将其初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp．) ，目前尚无链霉菌产低温纤维素酶的研究报道。Tibet-
YD5227-2 液体摇瓶培养产生低温 CMC酶活力高达 145 U /mL，最适产酶温度 25℃，最适产酶 pH 值为 8. 0。酶学性质初步研
究显示，Tibet-YD5227-2 产生的 CMC酶反应温度以 35℃左右为适，反应的 pH值以 8. 0 左右为适，该菌株所产的纤维素酶在中
碱性条件具有较强的稳定性;K + 、Fe2 +、Mg2 +对酶反应有促进作用，Hg2 +、Cu2 +对酶反应有抑制作用。
关键词: 青藏高原 低温纤维素酶 链霉菌 筛选
Screening and Identificatiaon of A Cold-adapted Cellulase-producing
Actinomycete and Characterization of Cellulase
Li Shiweng Kong Kai Feng Jiali Li Mei Tai Xisheng
(School of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070)
Abstract: One cold-adapted cellulase-producing actinomycete Tibet-YD5227-2，was isolated from the yak dung in the Qinghai-
Tibet plateau． The 16S rDNA sequence analysis indicated that Tibet-YD5227-2 was closely similar with Streptomyces sp． ． No work on
Streptomyces sp． producing cold-adapted cellulase had been reported so far． The cold-adapted cellulase activity of shaking flask culture
of Tibet-YD5227-2 was 145 U /mL． Further investigates showed that the optimal temperature and pH for Tibet-YD5227-2 cellulase-
producing were 25℃ and pH 9. 0． The results also showed that the optimal conditions for the enzymatic reaction were about 35℃and
pH8. 0． The enzyme showed high activity and satisfactory stability at pH7. 0 － 10. 0． K +，Fe2 +，Mg2 + were the activators and Hg2 +，
Cu2 + were the inhaibitiors of the enzyme．
Key words: Qinghai-Tibet plateau Cold-adapted cellulase Streptomyces sp． Screening
收稿日期:2010-02-01
基金项目:国家自然科学基金项目(30960063)
作者简介:李师翁，男，教授，研究方向:重要工业微生物的定向改造与产品制造;E-mail:lishweng@ yahoo． com． cn
纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的碳源
物质，对人类而言，它又是自然界中数量最大的、永
不枯竭的可再生资源。纤维素可被纤维素酶降解生
成葡萄糖，因此纤维素酶的研究开发和应用是植物
质资源再利用的主要途径。普通纤维素酶的最适作
用温度一般为 45 － 65℃。低温纤维素酶最适作用
温度可低至 20℃［1］，低温纤维素酶能在较低的环境
条件下加速生物降解的过程，节约能量与费用。
微生物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，
迄今为止，国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约
53 个属的几千个菌株［2］，其中主要包括细菌、放线
菌和真菌。研究发现，放线菌产生的纤维素酶活力
较高，是抗菌素的主要生产菌，同时，放线菌结构简
单，为单细胞，便于遗传分析，因此许多研究者正致
力于放线菌产纤维素酶的研究［3］。目前国内外对
产中温和高温纤维素酶的链霉菌的报道较多［4，5］，
而对 Streptomyces sp．产低温纤维素酶的研究尚未见
报道。我们首次从青藏高原牦牛粪中筛选到一株产
2010 年第 7 期 李师翁等:产低温纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究
低温纤维素酶酶活力高的的放线菌 Tibet-YD5227 -
2，经 16S rDNA 序列比对分析表明，初步鉴定为链
霉菌属(Streptomyces sp．)。本试验在培养条件优化
的基础上，初步研究了该菌所产生的低温纤维素酶
的酶学性质。
1 材料和方法
1. 1 材料来源
从青藏高原(32°53. 171N 91°55. 127E)海拔 5 227
m处取牦牛粪样品。
1. 2 培养基
分离平板培养基［6］，复筛培养基［6］，种子培养
基［7］，发酵培养基［7］。
1. 3 初筛
取样品 1 g 置于装有 100 mL 无菌水的三角瓶
中，摇匀，从三角瓶中取 1 mL 转移到另一盛有 100
mL无菌水的三角瓶，在 25℃振荡培养 2 h，取 0. 1
mL振荡培养液涂布到以 CMC为惟一碳源的培养基
平板，倒置恒温 4℃培养 7 d，注意观察菌的生长情
况，挑取单菌落用斜面保存。
1. 4 刚果红染色鉴定法
用接种针将斜面单菌落转移到复筛产酶培养基，
25℃恒温培养 3 d，向培养皿中加入适量 1 mg /mL的
刚果红溶液，染色 1 h 后，用 1 mol /L 的 NaCl 溶液
洗脱。
1. 5 菌株鉴定
采用引物 27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-
3，907F 5-AAACTCAAATGAATTGACGGG-3，517F
5-CCAGCAGCCGCCGGTAAT-3，进行菌株 16S rRNA
基因的扩增，50 μL的扩增体系含有:2单位 Taq DNA
聚合酶(Promega，Madison，Wis．，USA) ，1 × Taq buff-
er，2 mmol /L MgCl2，0. 2 mmol /L dNTP，引物各 10
pmol。PRC扩增 30个循环，每个循环包括 94℃预变
性 2 min、58℃退火 1 min 和 72℃延伸 1. 5 min，最后
在 72℃延伸 10 min。扩增产物经纯化后送上海生工
生物工程有限公司测序。将菌株序列经 CLUST-
ALW1. 8. 1［8］行多序列联配，使用 Jukes-Cantor 法［9］
算进化距离用邻位相连法分析后通过 MEGA3. 1构建
系统发育树，通过 Bootstap法对树进行评估分析［10］。
1. 6 发酵条件试验
向在 25℃活化培养 4 d 的斜面培养基中加入
5 mL无菌水，充分振荡后，从制成的孢子悬液中取
1 mL接入种子培养基中，25℃振荡培养 2 d，再从
上述培养基中按 2%的接种量向发酵液体培养基
中接入种子液，于 180 r /min，温度 25℃的条件下
振荡培养，定时取样测定发酵液中的 CMC 酶活
力，并在上述条件下，对菌株 Tibet-YD5227-2 发酵
条件进行研究。
1. 7 酶活力的测定
发酵液于 4 000 r /min离心 10 min，取上清液过
0. 22 μm纤维素膜后作为粗酶液，按 DNS ［11］法测定
酶活力。在 pH 值为 8. 0，35℃条件下，每分钟水解
CMC产生 1 μg葡萄糖的量，定义为 1 个酶活力单位
(U /mL)。以上所测酶活均为扣除发酵液中还原
糖量。
2 结果与分析
2. 1 菌株的分离纯化与筛选
从取自青藏高原的牦牛粪材料中，在 4℃经稀
释涂布平板分离到能在以 CMC 为唯一碳源的培
养基中生长的菌株 2 株，用刚果红染色，挑选其中
透明圈与菌落直径比较大的一株，给该菌命名为
Tibet-YD5227-2。培养 4 d 后，Tibet-YD5227-2 菌
落为白色，圆形边缘不整齐，菌落表面为低凸面，
大小为 0. 5 cm;通过插片法观察到有发育良好的
分枝菌丝，菌丝无横隔。将菌株接种在产酶培养
基中，于 25℃、180 r /min 条件下产酶试验，发酵 3
d后测定酶活，该菌株产酶活力达 106. 5 U /mL。
该菌株在液体发酵培养基中产酶量较高，因此有
必要对该菌株进行产酶条件和酶学性质的进一步
研究。
2. 2 菌株的分子生物学鉴定
菌株 Tibet-YD5227-2的 16S rDNA基因序列提交
GenBank 数据库，获得 Tibet-YD5227-2 登录号为
GQ169308(已公布) ，与GenBank数据库中已有的16S
rDNA基因序列进行相似性比较分析，Tibet-YD5227-2
与图 1 中链霉菌属(Streptomyces sp．)相似性均达
99%。该株放线菌的系统发育树如图 1。
712
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
图 1 Tibet-YD5227-2 的 16S rDNA序列为基础的系统发育树
2. 3 菌体产酶特性
2. 3. 1 温度对菌株产酶的影响 将菌株 Tibet-
YD5227-2 的种子液以 2%的接种量接入液体摇瓶
培养基中，分别在 10、15、20、25、30、35、40 和 45℃下
培养，培养 4 d 后取样按 DNS 法测定酶活。结果如
图 2 所示，Tibet-YD5227-2 在 10 － 35℃条件下，菌
丝体生长并且产酶，25℃时菌株产酶活力达到最高，
图 2 温度对菌株产酶的影响
40℃时，酶活显著降低。
2. 3. 2 初始 pH对菌株产酶的影响 将 Tibet-YD5227-2
的种子液分别以 2%的接种量接入初始 pH 值分别
为 6. 0，7. 0，8. 0，9. 0，10. 0，11. 0 的发酵培养基中，
在 25℃下振荡培养 4 d，测定其酶活力。结果如图 3
所示，该菌在碱性条件下能维持较高的酶活水平，当
培养基初始 pH值为 9. 0 时酶活达到最高。
图 3 初始 pH对菌株产酶的影响
812
2010 年第 7 期 李师翁等:产低温纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究
2. 3. 3 时间对菌体生长及产酶的影响 将 Tibet-
YD5227-2 于 25℃，pH维持在 9. 0 时，振荡培养，并
定时取样测定干重和酶活力。结果如图 4 所示，该
菌在培养 96 h 后，干重和酶活力均达到最高，其中
酶活力为 145 U /mL。随着时间的进一步增加，菌体
干重和酶活呈下降趋势。
图 4 时间对菌体生长及产酶的影响
2. 4 酶学性质的初步研究
2. 4. 1 酶反应的最适温度 将 Tibet-YD5227-2 的
CMC酶液分别在 5、10、15、20、25、30、35、40、45 和
50℃条件下反应 30 min后测定酶活。由图 5 可知，
Tibet-YD5227-2 所产 CMC酶最适反应温度 35℃，在
5、10℃下仍有一定的酶活，属于低温纤维素酶;目前
尚无对产低温纤维素酶的 Streptomyces sp．的研究报
道，本研究首次筛选到产低温纤维素酶高活力的链
霉菌 Tibet-YD5227-2。
图 5 温度对 CMC酶活力的影响
2. 4. 2 酶反应的温度稳定性 将 Tibet-YD5227-2
的 CMC酶液分别在 4、15、25、35、45 和 55℃条件下分
别保温 0. 5、1、1. 5、2 和 2. 5 h 后，在 35℃测定剩余酶
活力。由图 6可知，该酶在 4℃时稳定性最好，随着温
度升高，稳定性下降，45℃放置 2. 5 h 之后，残余酶活
维持在 20%左右，55℃放置 2 h，酶活完全丧失。
图 6 温度对 CMC酶稳定性的影响
2. 4. 3 酶反应的最适 pH值 将来源于 Tibet-YD5227-
2的 CMC酶液分别置于不同的 pH条件下测定 CMC酶
活力。由图 7可知，Tibet-YD5227-2所产 CMC酶反应最
适 pH值为8. 0，且在 pH值为 7. 0 － 10. 0 左右也有较
高的酶活性，说明 Tibet-YD5227-2 所产生的酶制剂
在棉织品生物整理剂以及洗涤工业中将具有良好的
应用前景。
图 7 pH值对菌株 CMC酶活力的影响
2. 4. 4 酶反应的 pH稳定性 将于源于 Tibet-YD5227-2
的 CMC酶液分别置于不同的 pH 环境中，于 35℃下
保温 60 min，按常规方法测定酶活力。如图 8 所示，
Tibet-YD5227-2所产 CMC 酶在 pH 值为 7. 0 － 10. 0
范围内，酶活性保持在 60%以上，可见该菌产生的
CMC酶在中碱性条件具有较强的稳定性。
2. 4. 5 金属离子对酶活性的影响 在酶反应体系
中加入不同的金属离子(0. 01 mol /L) ，测定所产的
CMC酶活力，结果如表 1 所示，K +、Fe2 +、Mg2 +对酶
反应有促进作用，Hg2 +、Cu2 +对酶反应有抑制作用。
912
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
图 8 不同 pH值条件下 CMC酶活的稳定性
表 1 金属离子对酶活性的影响
金属离子 对照 Hg2 + K + Fe2 + Mg2 + Mn2 + Zn2 + Cu2 + Ca2 +
相对酶活
力(%)
100 30 142 132 126 95 96 65 98
3 结论
低温纤维素酶在低温条件下可以高效发挥作
用，为工业生产降低成本，具有重要的应用和研究价
值。在过去半个多世纪里，人们主要从寒带和冰川
等不同的环境的陆地开发和获得低温纤维素酶［12］，
其中对细菌产低温纤维素酶的报道较多［13，14］，对产
低温纤维素酶的链霉菌研究尚未见报道。本研究首
次从青藏高原牦牛粪中分离得到一株产低温纤维素
酶酶活力高的链霉菌，酶学性质初步研究显示，该酶
最适反应温度为 35℃，最适反应 pH 值为 8. 0，在碱
性条件下具有较高的酶活和稳定性。近 10 年来，随
着中性和碱性纤维素酶在清洗、纺织等方面的广泛
应用，该菌株所产的纤维素酶也将在常温催化和碱
性应用方面显出良好的应用前景和经济价值。
参 考 文 献
［1］Akila G，Chandra TS． A novel cold-tolerant clostridium strain PX-
YL1 isolated from a psychrophilic cattle manure digester that secretes
thermolabile xylanase and cellulose． FEMS Microbiol Lett，2003，
219:63-67．
［2］高伦江，董全，唐春红．纤维素酶的研究进展及前景展望． 江苏
食品与发酵，2007(4) :5-8．
［3］吴斌，胡肆珍． 产纤维素酶放线菌的研究进展． 中国酿造，2008
(1) :5-8．
［4］宋波，羊键．一株降解纤维素放线菌的筛选及其产酶条件的研
究．微生物学杂志，2005，5(25) :36-39．
［5］van Solingen P，Meijer D，van der Kleij WA，et al． Cloning and ex-
pression of an endocellulase gene from a novel Streptomycete isolated
from an East African soda lake． Extremophiles，2001，5(5) :33-341．
［6］顿宝庆，吴薇，王旭静，等． 一株高纤维素酶活力纤维素分解菌
的分离与鉴定．中国农业科技导报，2008，10(1) :113-117．
［7］侯晓娟，王卫卫，李忠玲，等．一株产碱性纤维素酶放线菌的分离
及酶学特性．西北大学学报:自然科学版，2007，37(5) :781-784．
［8］Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，et al． Clustal X Windows in-
terface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by
quality analysis tools． Nucleic Acids Research，1997，24:
4876-4882．
［9］Jukes TH，Cantor CR． Munro ． Mammalian Protein Metabolism［M］．
New York:Academic Press，1969．
［10］Felsenstein J． Confidence limits on phylogenies:an approach using
the bootstrap． Evolution，1985，39:783-791．
［11］赵亚华．生物化学实验技术教程［M］．广州:华南理工大学出版
社，2000:149-150．
［12］俞勇，李会荣，陈波，等．北极高维度海域海冰嗜冷菌系统发育
多样性及其低温水解酶分析． 微生物学报，2006，46(2) :
184-190．
［13］曾胤新，俞勇，陈波，等．低温纤维素酶产生菌的筛选、鉴定、生
长特性及酶学性质．高技术通讯，2005，15(4) :58-62．
［14］王玢，汪天虹，张刚，等．产低温纤维素酶海洋嗜冷菌的筛选及
研究．海洋科学，2003，27(5) :42-45．
022