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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
野生罂粟 RNAi表达载体的构建及遗传转化
任丽蓉1，2 张金文1，2 魏玉杰3 何庆祥3 雷耀湖3 陆则权1，2
(1甘肃农业大学农学院，兰州 730070;2甘肃干旱生境作物学重点实验室，兰州 730070;3甘肃农垦农业研究所，武威 733006)
摘 要: 通过 PCR方法从质粒 pGEM-bc中克隆野生罂粟 BBE-COR 融合基因片段约 760 bp，以 pHANNIBAL 和植物表
达载体 pCAMBIA3300 为基础，将克隆到的 BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入 pdk内含子的两边，经酶切、PCR鉴定
及序列分析表明，特异性 RNAi表达载体 p3300-pHR构建成功。采用直接转化法，将重组子导入根癌农杆菌 AGL1 中。以野
生罂粟茎尖生长点为转化受体，用农杆菌介导法将目的基因转入野生罂粟中。经卡那霉素和除草剂筛选后，共获得 53 株转基
因植株，PCR检测后，其中 14 株表现阳性，可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中。
关键词: 野生罂粟 RNAi 根癌农杆菌 遗传转化 茎尖
Construction of RNAi Expression Vector and
Transformation in Papaver nudicarule
Ren Lirong1，2 Zhang Jinwen1，2 Wei Yujie3 He Qingxiang3 Lei Yaohu3 Lu Zequan1，2
(1Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070;2Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science，
Lanzhou 730070;3Gansu Academy of Reclamation Agricultural Research，Wuwei 733006)
Abstract: The fusion gene BBE-COR(760 bp)is cloned from plasmid pGEM-bc by the PCR technique． Plant siRNA expression
vector p3300-pHR was constructed based on the vectors pHANNIBAL and pCAMBIA3300，the forward and reverse fragments of the fu-
sion gene BBE-COR were inserted the two sides of the intron pdk． The recombinant plasmid p3300-pHR was checked by restriction en-
zyme analysis，PCR and nucleic acid sequencing． The vector p3300-pHR was transferred to Agrobacterium tumefaciens by direct DNA
transfer and the transformant was identified with PCR． Using the stem apex as the recipients，the fusion gene BBE-COR of expression
vector was efficiently transformed into poppy． Fifty-three transgenic plants were obtained after selecting with herbicide and 14 of them
were confirmed positive by PCR amplification，which contained kanamycin resistance gene and bar gene via Agrobacterium tumefaciens．
After gradient selection with kanamycin，14 transgenic plants were regenerated． PCR analysis of the genomic DNA from transgenic plants
showed that the foreign gene has integrated into poppy genome．
Key words: Papaver nudicarule RNA interference Agrobacterium tumefaciens Genetic transformation Shoot tip
收稿日期:2011-03-01
基金项目:教育部博士学科点研究基金项目(2007733008) ，甘肃省卫生厅重点中医药科技项目(2008HDTC02) ，甘肃省农垦总公司科技项目
(GZK-2009-10)
作者简介:任丽蓉，女，硕士研究生，研究方向:生物技术在作物育种中的应用;E-mail:rlrxm21120@ 163． com
通讯作者:张金文，男，教授，博士生导师，研究方向:生物技术在作物育种中的研究;E-mail:jwzhang305@ 163． com
罂粟(Papaver nudicarule L．)为一年生草本植
物［1］，是重要的药源植物［2］，主要用于麻醉和镇痛
药物吗啡和可待因的生产［3］，但吗啡类生物碱因其
成瘾性和依赖性对社会有极大的危害，而吗啡生物
合成途径中的中间生物碱蒂巴因和网状番荔枝等生
物碱具有更为重要的医用价值［4 － 6］。小檗碱桥酶
(BBE)和可待因酮还原酶(COR)是合成吗啡的关
键酶，利用 RNAi 技术同时抑制这两个酶基因的表
达［7］，将会使网状番荔枝碱和蒂巴因等的积累增
加。梁倩倩等［8］已成功构建以 bbe 和 cor 基因为靶
标的 RNAi载体，但其构建的载体对罂粟单个蒴果
所结种子在 8 000 粒左右。采用花粉管通道法或农
杆菌介导法进行转化，获得的大量种子或转化苗通
过在培养基中添加 Kan 进行筛选是不现实的，且用
2011 年第 8 期 任丽蓉等:野生罂粟 RNAi表达载体的构建及遗传转化
农杆菌介导法进行转化时遇到了野生罂粟稳定的再
生体系难以建立和继代困难的问题。
鉴于此，本试验以具有除草剂抗性基因(bar 基
因)的 pCAMBIA3300 载体为基础，重新构建了 BBE-
COR融合基因的特异性 RNAi 表达载体 p3300-pHR，
并利用农杆菌介导法将“BBE-COR-PDK intron-COR-
BBE”基因导入野生罂粟茎尖分生组织，研究以野生
罂粟茎尖为转化受体的可行性，为拓宽农杆菌转化的
受体系统提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 质粒和菌株 含 BBE-COR 融合基因的
pGEM-bc质粒，系笔者实验室在前期研究中获得。
pHANNIBAL 质粒、E． coli DH5α 菌株，由本实验室
保存;pCAMBIA3300 质粒由山东大学张举仁教授馈
赠;根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1 由
甘肃省农业科学院馈赠。
1. 1. 2 工具酶、试剂 Taq DNA Polymerase、DNA
Marker、低熔点琼脂糖、凝胶回收试剂盒均为 TIAN-
GEN 公司产品。限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、
RNase、dNTP 购于宝生物工程(大连)有限公司
(TaKaRa) ;SDS、Tris、Na2 EDTA、NaCl、Yeast extract
(酵母提取物)、Tryptone(胰蛋白胨)购自 Amresco
公司，其他生化试剂为国产和进口分析纯。
1. 1. 3 PCR引物 用分子生物学软件 Oligo 6． 0 进
行引物设计(表 1)。引物由 TIANGEN 生物工程有
限公司合成。
表 1 扩增 BBE-COR融合基因正、反向
片段及内含子 PDK-intron的引物
引物 引物序列(5 μ→3 μ)
P1 GCCGCTCGAGGATCCATGAACTTGAATCGAATTTC
P2 CGGGGTACCTCAATCCTTCTCATCCCAGA
P3 CGCGGATCCGAGCTCATGAACTTGAATCGAATTTCC
P4 AACCATCGATCAATCCTTCTCATCCCAGA
P5 TCTTGTTATCACCGACTGGA
P6 CCCAATTTCCCAACTGTAATC
1. 2 方法
1. 2. 1 BBE-COR融合基因反、正向序列的克隆 以
提取的 pGEM-bc质粒为模板、P3 和 P4 为引物，通过
PCR扩增 760 bp 的 BBE-COR 融合基因反向片段。
PCR扩增体系 25 μL，包括 ddH2O 18． 4 μL，10 × DNA
Polymerase(5 U/μL)0． 5 μL，Buffer plus MgCl2 2. 5 μL，
dNTP(10 mmol /L)1. 5 μL，P3、P4 引物(10 μmol /L)各
0． 3 μL，模板 1. 5 μL，扩增程序:94℃ 1 min;94℃
1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，循环 30 次;72℃延伸
10 min。同样，以 P1和 P2为引物，PCR扩增体系和扩
增程序同上，结束反应，取 5 － 10 μL 产物电泳观察结
果。用凝胶回收试剂盒回收预期大小片段，与 pGEM-
T Easy Vector连接，经 PCR检测及限制性内切酶消化
将初步确认的阳性克隆送华大公司进行测序，正确克
隆的正向片段命名为 R1，反向片段命名为 R2。
1. 2. 2 以 BBE-COR 为靶标的 RNAi 载体的构建
载体 pHR构建程序如图 1 所示。以 pHANNIBAL 为
中间载体，用 ClaⅠ/BamHⅠ双酶切反向片段 R2，回收
大片段，与经同样双酶切并回收的载体 pHANNIBAL
连接，转化 DH5α宿主菌，得到重组克隆 pHR1;然后，
用 XhoⅠ/KpnⅠ双酶切正向片段 R1并回收大片段，与
经同样双酶切并回收的 pHR1 大片段连接，转化
DH5α宿主菌，得到中间载体 pHR。以 BBE-COR 为
靶标的植物 RNAi 载体 p3300-pHR 构建程序如图 2
所示，以 pCAMBIA3300 为基础，用 BamHⅠ酶切
pHR，回收小片段后用 SacⅠ酶切回收产物，再回收大
片段，与经 SacⅠ/BamHⅠ双酶切回收的 pCAMBIA3300
载体相连，得到具有反向重复序列“BBE-COR-PDK in-
tron-COR-BBE”RNAi表达载体 p3300-pHR。
1. 2. 3 野生罂粟的遗传转化 采用直接转化法［9］
将重组质粒 p3300-pHR 导入农杆菌 AGL1 感受态细
胞中，获得用于转化的农杆菌工程菌。按照吕素莲
等［10］方法，取饱满完好的野生罂粟种子进行灭菌，用
70%乙醇浸泡 30 s，再用 2%次氯酸钠浸泡 20 min，无
菌水冲洗 5次，灭菌种子放在 MS 培养基上暗培养萌
发。待苗长至 2 cm左右后，将其茎尖生长点轻微挫
伤后在 MS培养基上进行预培养 4 d后用于转化。将
茎尖悬浮浸泡 3 － 4 min，用滤纸吸去多余的菌液，接
种于分化培养基(MS + BA 0. 1 + IAA 1. 0)共培养 2 d。
然后将受体材料转移至羧苄青霉素(Cab)250 mg /L及
Kan 100 mg /L的分化培养基上，光照为 2 200 lx，温度
21℃条件下进行选择培养，每两周继代一次，继代 3次
后将分化形成的不定芽或小苗转移至生根培养基
(1 /2MS + IBA 0． 5 +Kan 25 mg /L)。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
图 1 中间载体 pHR的构建图
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2011 年第 8 期 任丽蓉等:野生罂粟 RNAi表达载体的构建及遗传转化
图 2 RNAi表达载体 p3300-pHR的构建图
将生根的小苗移栽至装有灭菌蛭石的花盆中培
养 5 d后，将沾有 50 mg /L除草剂的棉球放置在叶片
上，待棉球干燥后取下。在此过程中部分植株逐渐死
亡，部分植株存活，将存活的转化植株进行 PCR
检测。
2 结果
2. 1 BBE-COR融合基因反向和正向的扩增
以 pGEM-bc质粒 DNA 为模板，分别用携带有
酶切位点的反、正向引物对 P3、P4 和 P1、P2 进行
PCR扩增，均得到 760 bp左右的特异性片段(图 3，
泳道 1、2) ，与预期片段大小相符，说明扩增到了目
的基因。将目的条带回收，与 pGEM-T Easy Vector
连接，酶切检测正确后(图 3，泳道 3、4 箭头所示)进
行测序，正向片段同源率达 99. 31%，反向片段同源
率达 99. 07%，说明已成功克隆到 BBE-COR 融合基
因的正向和反向片段。
2. 2 以BBE-COR融合基因为靶标的RNAi载体的构建
以 pHANNIBAL和 pCAMBIA3300 载体为基础，
按照以 BBE-COR 为靶标的反向重复 RNAi 载体构
建程序，通过酶切分析和连接，构建了 RNAi 表达载
体 p3300-pHR。在筛选培养基上挑斑克隆后，经碱
裂解法提取质粒，并根据构建的 p3300-pHR 载体上
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的限制性位点对其进行酶切分析，将重组质粒
p3300-pHR 经 BamHⅠ /ClaⅠ双酶切后，在 1 503 bp
左右有特异性条带(图 4，泳道 1 箭头所示) ，其大小
与正向 BBE-COR + PDK 大小相符;经 KpnⅠ /BamH
Ⅰ双酶切在 760 bp左右出现特异条带(图 4，泳道 2
箭头所示) ，其大小与正向 BBE-COR 大小相符;经
KpnⅠ /SacⅠ双酶切后，在 1 503 bp左右有特异性条
带(图 4，泳道 3 箭头所示) ，其大小与反向 BBE-
COR + PDK大小相符;经 BamHⅠ/SacⅠ双酶切后，在
2 330 bp左右有特异性条带(图 4，泳道 4箭头所示) ，
M． DNA Marker D2000;1． 以 P3 /P4 为引物扩增;2． 以
P1 /P2 为引物扩增;3，4． EcoR I酶切
图 3 BBE-COR反向和正向 PCR扩增产物及酶切检测
M1． DNA Marker D2000;M2． DNA Marker D15000;
1． BamHⅠ /ClaⅠ酶切 p3300-pHR;2． KpnⅠ/BamHⅠ
酶切 p3300-pHR;3． KpnⅠ/SacⅠ酶切 p3300-pHR;4．
BamHⅠ/SacⅠ酶切 p3300-pHR;5．以 P3 /P4 为引物
扩增;6．以 P1 /P2 为引物扩增
图 4 p3300-pHR酶切和 PCR检测
其大小与反向 BBE-COR + PDK +正向 BBE-COR 大
小相符。对酶切鉴定正确的重组质粒 p3300-pHR，以
P3和 P4为引物进行 PCR扩增，能扩增出 1 条约 760
bp左右的片段，其大小与反向 BBE-COR片段大小相
符(图 4，泳道 5) ，以 P1和 P2为引物进行 PCR扩增，
能扩增出 1 条约 760 bp 左右的片段，其大小与正向
BBE-COR片段大小相符(图 4，泳道 6) ，由此说明，在
构建的以 BBE 和 COR 基因为靶标的 RNAi 载体中，
具有转录形成发夹型 mRNA 的结构单元———“正向
BBE-COR + PDK内含子 +反向 BBE-COR”构建成功。
2. 3 对野生罂粟的转化
采用直接转化法［9］将表达载体 p3300-pHR 质
粒导入农杆菌 AGL1，在附有卡那霉素和利福平的
YEB平板上筛选后，挑取阳性克隆按照农杆菌质粒
提取方法［11］提取质粒 DNA。分别以 P1 和 P2、P3
和 P4 为引物对重组质粒 p3300-pHR 进行 PCR 扩
增，在 760 bp 处分别出现特异性条带，其大小与正
向和反向 BBE-COR 大小相符(图 5，泳道 1、2) ;以
P5 和 P6 为引物进行 PCR扩增，在 900 bp 处出现特
异条带，其大小与 PDK内含子大小相符(图 5，泳道
3) ;再以 P1 和 P6、P3 和 P5 为引物对进行 PCR 扩
增，在 1 503 bp 处均出现特异条带，其大小与正向
BBE-COR + PDK 及反向 BBE-COR + PDK 大小相符
(图 5，泳道 4、5)。PCR 鉴定结果表明已获得了含
有目的片段表达载体的农杆菌菌株。
M． DNA Marker DL2000;1． 以 P1 /P2 为引物扩增;2． 以
P3 /P4 为引物扩增;3．以 P5 /P6 为引物扩增;4．以 P1 /P6
为引物扩增;5．以 P3 /P5 为引物扩增
图 5 转化农杆菌的 PCR鉴定
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2011 年第 8 期 任丽蓉等:野生罂粟 RNAi表达载体的构建及遗传转化
以野生罂粟茎尖分生组织为受体，轻微将其挫
伤后在农杆菌菌液中浸染，经过 3 代筛选培养基的
筛选(图 6-A) ，共获得再生植株 187 株(图 6-B) ，移
栽喷施除草剂后成活 53 株。从成活的野生罂粟株
系上剪取叶片提取总 DNA，用引物 P1 和 P2、P3 和
P4 对这些再生植株进行 PCR 检测，结果(图 7)表
明，呈阳性的植株为 14 株。目前，对阳性再生植株
生物碱含量的测定正在进行中。
图 6 转化野生壁粟
M． DNA Marker DL2000;1 － 7． 抗性苗(2，6，7 为检测到
的目的片段) ;8．正对照(BBE-COR)
图 7 抗性苗的 PCR鉴定
3 讨论
目前，采用 RNAi技术选育吗啡、蒂巴因等生物
碱含量丰富的罂粟品种在国外已有研究，如 Allen
等［5］以罂粟可待因酮还原酶(COR)基因为靶标，采
用 RNAi技术(RNA interference，RNAi)抑制 COR基
因的表达，结果在转基因植株中检测只有极少量的
吗啡生成;Fujii 等［12］则以小檗碱桥酶(BBE)为靶
标，用具有 BBE基因反向重复序列的 RNAi 载体转
化罂粟，结果转基因植株内源 BBE 基因表达受到抑
制。但目前国外尚没有利用 RNAi 技术同时调控
BBE和 COR基因表达的报道。
pARQ是本实验室于 2008 年构建的同时调控
野生罂粟 BBE、COR基因表达的 RNAi表达载体，该
载体具有选择标记基因卡那霉素抗性基因(Kanr)。
罂粟一个蒴果里有 8 000 粒左右的种子，采用花粉
管通道法进行转化，获得的大量种子无法进行筛选，
用农杆菌浸染进行遗传转化时也需要将所有转化苗
进行 DNA提取并做 PCR检测，其工作量都非常大，
不利于筛选工作的进行。这就需要建立有效的筛选
体系，有效去除非转化体的干扰。针对这一问题，本
试验对原构建的载体进行改造，采用具有抗除草剂
bar基因的 pCAMBIA3300 载体为基础，重新构建了
野生罂粟 BBE-COR 融合基因的 RNAi 表达载体。
在用该载体进行花粉管通道法和农杆菌浸染法转化
野生罂粟后，获得的大量种子和转化苗直接播种到
温室或大田，通过喷施相应的除草剂将未转化的材
料杀死，存活下来的植株再进行进一步的靶标基因
表达筛选和成分的鉴定。
植株再生困难，容易提早开花，转化周期长及效
率低是目前制约野生罂粟遗传转化的主要因素。本
试验以野生罂粟茎尖分生组织为受体进行遗传转
化，与传统的胚性愈伤组织为受体相比，此方法具有
简便、快速、工作效率高、试验周期短、取材不受季节
限制等优点。利用农杆菌浸染获得的幼苗经除草剂
筛选后得到抗性植株 53 株，抗性植株进行 BBE-
COR融合基因 PCR 扩增检测后，其中 14 株为阳性
植株，转化率达 10． 16%，高于农杆菌介导的其他转
化体系。该转化效率如此高，与转化受体的组织感
受状态有紧密的联系，受体组织为茎尖分生组织，其
代谢旺盛，生长迅速，且茎尖有轻微损伤，利于农
杆菌在野生罂粟细胞上的吸附性，大大提高了转
化效率。该试验还需要对阳性植株进行 Southern
杂交及吗啡含量测定等方面的鉴定来进一步证
实该转化体系能极大地解决目前野生罂粟转化
率低的问题。
参 考 文 献
［1］王淑敏．罂粟，古柯和大麻．生物学通报，2000，35(3) :22-23．
［2］Unterlinner B，Lenz R，Kutchan TM． Molecular cloning and function-
al expression of codeinone reductase:the penultimate enzyme in mor-
phine biosynthesis in the opium poppy Papaver somniferum． The
Plant Journal，1999，18(5) :465-475．
311
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
［3］Ye K，Ke Y，Keshava N，et al． Opium alkaloid noscapine is an antitu-
mor agent that arrests metaphase and induces apoptosis in dividing
cells． Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(4) :1601-1606．
［4］梁倩倩，魏玉杰，张金文，等．野生罂粟 COR基因克隆及转化．西
北植物学报，2009，29(8) :1520-1526．
［5］Allen RS，Millgate AG，Chitty JA，et al． RNAi mediated replacement
of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy．
Nat Biotechnol，2004，22(12) :1559-1566．
［6］Shukla S，Singh SP，Yadav HK，et al． Alkaloid spectrum of different
germplasm lines in opium poppy(Papaver somniferum L．)． Genetic
Resources and Crop Evolution，2006，53(3) :533-540．
［7］Yadav HK，Shukla S，Singh SP． Genetic variability and interrelation-
ship among opium and its alkaloids in opium poppy(Papaver som-
niferum L．)． Euphytica，2006，150:207-214．
［8］梁倩倩，张金文，魏玉杰，等．野生罂粟 COR、BBE 基因片段融合
及其 RNAi载体构建．中国生物工程杂志，2009，29(11) :41-47．
［9］王关林，方宏筠．植物基因工程(第 2 版) ［M］． 北京:科学出版
社，2002:776-777．
［10］吕素莲，尹小燕，张举仁，等．农杆菌介导的棉花茎尖遗传化及
转 betA植株的产生．高技术通讯，2004(11) :20-25．
［11］王关林，方宏筠．植物基因工程(第 2 版) ［M］．北京:科学出版
社，2002:738．
［12］Fujii N，Inui T，Iwasa K，et al． Knockdown of berberine bridge en-
zyme by RNAi accumulates(S)-reticuline and activates a silent
pathway in cultured California poppy cells． Transgenic Res，2007，
16:363-375．
(责任编辑 马鑫
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 102 页)
［9］Ogata K，Morikawa S，Ametani Y，et al． Comparison of the free and
DNA complexed forms of the DNA-binding domain of c-MYB． Nature
Structural Biology，1995，2:309-320．
［10］陈俊，王宗阳．植物 MYB类转录因子研究进展．植物生理与分
子生物学学报，2002，28(2) :81-88．
［11］ Sharp PM，Devine KM． Codon usage and gene expression level in
Dictyosteiium discoidtum:highly expressed genes do prefer optimal
codons． Nucleic Acids Research，1989，17(13) :5029-5039．
［12］Robinson M，Lilley R，Little S，et al． Codon usage can affect effi-
ciency of translation of genes in Escherichia coli． Nucleic Acids Re-
search，1984，12(17) :6663-6671．
［13］Roy P，Richard T． A sensitive method for the determination of pro-
tein-DNA binding specificities． Nucleic Acids Research，1990，18
(21) :6197-6204．
［14］Adam J，Lena G，David G，et al． Transcriptional analysis of the ja-
maicamide gene cluster from the marine cyanobacterium Lyngbya
majuscula and identification of possible regulatory proteins． BMC
Microbiology，2009，9(1) :247．
［15］Das PM，Ramac HK，Vanwert J，et al． Chromatin immunoprecipitati-
on assay． Biotechniques，2004，37(6) :961-969．
(责任编辑 马鑫)
411