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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
柴油降解菌的筛选及降解能力研究
陈苗苗 陈书洁 方旭波 陈小娥
(浙江海洋学院食品与药学学院 ,舟山 316004)
　　摘 　要 : 　从修造船业周围油污污染土样中分离纯化出 9株以柴油为唯一碳源的高效降解菌 ,其中 2#菌为微球菌属 ,确
定为优势菌株 ,其降解率高达到 6517% ;分析了接种量、柴油浓度、pH、温度、转速对 2#微球菌降解柴油的影响。结果表明 ,该
菌株最适宜生长条件接种量为 110 m l/L、柴油浓度为 114 g/L、pH710、温度为 35℃、转速为 160 r/m in。
关键词 : 　柴油 　微生物降解 　分离筛选 　微球菌属 　影响因素
Screen ing of D iesel O il Degrading
Stra ins and Their Degradation Capability
Chen M iaom iao Chen Shujie Fang Xubo Chen Xiaoe
( Food and Pharm acy School, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004)
　　Abs trac t: 　N ine degrading strains which use diesel oil as the sole carbon source for decomposing oilwere isolated from the oil2pol2
luted soil of repairing the ship2building industry, and 2# strain belongs to M icrococcus, defined as the p redom inant strain, and the degra2
dation rate of which arrived at 6517% ; the inoculation amount, diesel oil concentration, pH, temperature and rotational speed have been
analyzed on the influence of 2# strainpis degradation. The study demonstrates that this strain has app rop riate growing conditions, including
seeding volume110 m l/L, diesel oil concentration 114 g/L, pH710, temperature 35℃, rotational speed 160 r/m in.
Key wo rds: 　D iesel oil　B iodegradation　 Isolation and screening M icrococcus Affected factors
收稿日期 : 2009210214
基金项目 :浙江省大学生科研创新团队资助项目
作者简介 :陈苗苗 (19872) ,女 ,浙江富阳人 ,研究方向 :海洋微生物的利用 ; E2mail: redapp le6612@1631com
通讯作者 :方旭波 (19722) ,男 ,副教授 ,博士 ,主要从事海洋微生物技术研究 ; E2mail: fxb70@ sohu1com
柴油废水中的烃类有机污染物尤其是芳香烃类
化合物可对周边生态环境造成极大的破坏。在自然
界 ,已知的具有降解和转化油污污染物的微生物有
数百种 ,主要有细菌、真菌和藻类等 3大类型的生
物 ,它们能降解油污烃类为无毒的产物 (CO2和 H2 2
O)。微生物处理技术以其生产费用低、不产生二次
污染、可在原位进行修复等特点而被视为一项具有
广阔前景的高新技术 [ 1 ] ,被认为是最理想的方法。
由于石油污染物具有组成复杂性、生物难降解性和
较低的生物可利用度等特点 ,土壤微生物难以有效、
快速、彻底地降解土壤中的石油烃 [ 2 ] ,因此筛选高
效降解石油的微生物菌种是生物修复的必然 ,目前
关于石油降解菌方面的研究已有一些报道 [ 3 ]。
针对舟山船舶修造业周围土壤柴油污染严重现
状 ,从其周围土样中筛选具有降解柴油的优势微生
物 ,进行分离、初步鉴定及其降解能力的研究 ,为改
善船舶修造业周边环境提供有利的技术方案。
1 材料与方法
111 菌种
舟山造船厂周围的柴油污染土壤和油污废水中
筛选分离。
112 培养基
固体筛选培养基 :柴油 114 g, K2 HPO4 015 g,
KH2 PO4 015 g, MgSO4 ·7H2 O 012 g, NH4 Cl 410 g,
CaCl2 011 g, NaCl 012 g, FeCl3痕量 ,琼脂 20 g,蒸馏
水定容到 1 000 m l, pH710, 121℃灭菌 20 m in。
液体油培养基 :柴油 114 g, K2 HPO4 015 g, KH2 2
PO4 015 g,MgSO4 ·7H2 O 012 g, NH4 Cl 410 g, CaCl2
011 g,NaCl 012 g, FeCl3痕量 ,蒸馏水定容到 1 000 m l,
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2009年第 12期 陈苗苗等 :柴油降解菌的筛选及降解能力研究
pH 710, 121℃灭菌 20 m in。
斜面保存培养基 :牛肉膏蛋白胨培养基。
113 柴油降解菌的筛选
11311 菌种的富集培养 用移液管移取油污废水
1 m l,放入三角瓶中 ,加入液体油培养液 ,在 35℃、
160 r/m in的条件下振荡培养 3～5 d。待培养液混
浊后 ,再从中移取 3 m l液体 ,加入到新的液体油培
养基中 ,重复操作 3次。
11312 柴油降解菌的初筛 将接种后的液体油培
养液梯度稀释 ,吸取 012 m l菌液均匀涂布于固体筛
选培养基平板上 , 35℃的条件下恒温培养 ,直至长出
菌落。
11313 降解菌的复筛与保存 观察在平板上得到
的优势菌落 ,选取形态特征一致的单菌落 ,在固体筛
选培养基上多次划线分离 ,经过数次培养后得到纯
化的单菌落。观察菌落特征 ,选择不同颜色及形态
的单菌落 ,接种于斜面保存培养基 ,置于冰箱中
保存。
114 高效柴油降解菌的鉴定
参照文献 [ 4 ] ,根据细胞及菌落形态 ,对分离筛
选得到的高效柴油降解菌进行初步鉴定。
115 菌株的降解能力测定
菌株对柴油的降解能力采用紫外分光光度
法 [ 5 ]进行测定。降解率计算公式如下 :
降解率 ( % ) = C1 - C2
C1
×100%
　　式中 : C1为柴油的初始浓度 mg/m l, C2为柴油的
测定浓度 mg/m l。
116 2#微球菌的性能分析
将菌株无菌操作接入液体油培养基中 ,在
35℃、160 r /m in的条件下振荡培养。将 110 m l/
L的 2#菌液接种到液体油培养基中进行恒温振
荡培养 ,以空白液体油培养基为对照 ,每隔 2 h取
样 ,在 320 nm处测定培养液的 OD值 ,绘制其生
长曲线。
117 2#微球菌的降解率影响因素试验
11711 接种量对降解率的影响 将培养 24 h的 2#
菌液 015、110、115、210、215 m l分别接种到 1 000 m l
液体油培养基中 ,在 35℃、160 r/m in的条件下振荡
培养 2 d,测定柴油降解率。
11712 柴油浓度对降解率的影响 配制柴油浓度
分别为 112、114、116、118 g/L的液体油培养基 , 2#
菌液按 110 m l/L接种 ,在 35℃、160 r/m in的条件下
振荡培养 2 d,每隔 6 h测定一次柴油降解率。
11713 pH对降解率的影响 将 2#菌液按 110 m l/
L分别接种到初始 pH为 410、510、610、710、810和
910的液体油培养基中 ,在 35℃、160 r/m in的条件
下振荡培养 2 d,测定柴油降解率。
11714 温度对降解率的影响 将 2#菌液按 110 ml/L
接种到液体油培养基中 ,分别在 25℃、30℃、35℃、
40℃、45℃和 50℃温度下振荡培养 2 d,测定柴油降
解率。
11715 转速对降解率的影响 将 2#菌液按 110 ml/L
接种到液体油培养基中 ,设置振荡器的转速分别为
0、120、140、160 r/m in,在 35℃下恒温培养 2 d,以不
加菌液的液体油培养基作为空白对照 ,测定柴油降
解率。
2 结果与分析
211 柴油降解菌的筛选结果
经过筛选、分离和纯化 ,从几十株菌株中得到
14株具有较强柴油降解能力的菌株 ,观察菌落特征
并测定其柴油降解率 ,结果见表 1。从表 1可以看
出 ,不同菌株有不同的菌落特征和降解率 ,表 1只列
出了降解率在 45%以上的菌株 ,其中 2#菌株的降解
率最高 ,达 6517% ,而最低的只有 4615%。结合各
菌株在固体筛选培养基上的生长情况 ,选取降解率
大于 55%的菌株 ,即选取 2#、3#、4#、7#、8#、9#、11#、
13#和 14#菌株为高效柴油降解菌 ,并对这 9株菌株
进行初步鉴定。
212 高效降解菌的初步鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册 》,对以上分离筛选出
的 9株高效柴油降解菌进行初步鉴定 ,鉴定结果如
下。由表 2可见 , 9株高效柴油降解菌一共有 6种
不同的菌属 ,其中 2#菌株为微球菌属 ,其降解能力
最高 ,且传代性能稳定 ,故选取 2#菌株进行性能分
析和降解因素试验。
213 2#微球菌的性能分析结果
21311 生长曲线 由图 1可知 , 2#菌在培养 6 h后
开始进入对数生长期 ,此时生长速度最快 , 24 h后
进入平稳期。对数生长期的微生物对新的培养环境
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
的适应期缩短 ,接种后能迅速生长繁殖。所以根据 生长曲线确定采用菌龄为 24 h的菌体进行接种。
表 1 菌株的菌落特征及柴油降解能力
菌株号 菌落形态 菌体大小 (μm) 菌落颜色 菌体形态 降解率 ( % )
1# 不透明 ,微隆起 ,全缘 ,光滑 ,有光泽 (013～018) ×(016～110) 粉红 短杆状 5213
2# 半透明 ,圆形 ,表面光滑 ,较干燥 013 淡黄 球形 6517
3# 半透明 ,圆形 ,隆起 ,光滑 ,有光泽 (015～018) ×(113～510) 淡黄 杆状 5711
4# 不透明 ,边缘假根状 ,根状扩散 ,表面干燥 (013～017) ×(012～015) 白色 杆状 6011
5# 不透明 ,边缘整齐 ,表面湿润 ,突起 (011～019) ×(012～017) 白色 短杆状 4919
6# 不透明 ,边缘整齐 ,表面湿润 ,突起 ,圆形 011 ×(018～113) 红棕色 杆状 5118
7# 不透明 ,边缘不规则 ,表面湿润 ,褶皱 (015～113) ×(012～014) 白色 长杆状 5716
8# 不透明 ,边缘整齐 ,表面湿润、光滑 (011～016) ×(111～118) 黄色 短杆状 5814
9# 不透明 ,表面干燥 ,圆形突起 ,边缘不齐 (110～115) ×(115～215) 白色 杆状 5613
10# 半透明 ,润湿光滑 ,圆形 ,边缘整齐 (015～110) ×(11 0～310) 白色 球状 4615
11# 不透明 ,表面干燥 ,边缘不整齐 (018～110) ×(110～310) 白色 圆端直的杆状 5719
12# 半透明 ,润湿光滑 ,圆形 ,边缘整齐 (015～110) ×(110～310) 白色 直杆状 5314
13# 半透明 ,润湿光滑 ,边缘不整齐 (015～110) ×(110～310) 白色 杆状 5615
14# 半透明 ,润湿光滑 ,圆形 ,边缘整齐 (015～110) ×(115 ～410) 白色 短杆状 5917
表 2 高效柴油降解菌的鉴定结果
菌株号 初步鉴定
2# 微球菌属
3#、14# 假单胞菌属
4#、9# 不动细菌属
7# 动胶菌属
8#、13# 黄杆菌属
11# 邻单胞菌属
图 1 2#菌株的生长曲线
214 2#微球菌降解率的影响因素及结果分析
21411 接种量对降解率的影响 如图 2所示 ,接 种量在 110 m l/L时 , 2#菌的降解率较高。在达到一定接种量后 ,再增加接种量反而会导致新增细胞减少而使整体活性下降 ,降解柴油的后劲不足。由于微生物大量繁殖 ,造成菌株集中 ,短时间内消耗了培养基中大量营养成分 ,不利于新菌株的持续生长 ,从而影响了降解率。因此 ,投加量应为 110 m l/L。图 2 接种量对降解率的影响21412 柴油浓度对降解率的影响 图 3的结果显示 ,随着柴油浓度的升高 , 2#菌在 114 g/L时有较强的降解能力 ,培养 48 h后的降解率可达 4117%。而
柴油浓度大于 114 g /L时 ,降解率反而降低 ,因为柴
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2009年第 12期 陈苗苗等 :柴油降解菌的筛选及降解能力研究
油浓度增大后 ,培养基表面形成一层油膜 ,使得溶液
内的溶解氧浓度降低 ,抑制微生物的生长繁殖 ,从而
影响对柴油的降解。
21413 pH对降解率的影响 pH是一个影响微生
物生长的重要因素 ,试验结果 (图 4 )表明 : pH 为
710时 2#菌有较好的降解能力。pH过低导致 H +浓
度超过了微生物酶的适应范围 ,引起微生物原生质
膜的电荷变化 ,影响微生物对营养物质的吸收和酶
的活性 ;而 pH过高抑制微生物生长 ,从而抑制降解
酶的分泌 [ 6 ]。
21414 温度对降解率的影响 从图 5可以看出 ,
随着温度升高 , 2#菌的降解率也随之上升 ,当温度升
至 35℃时降解率为 6516% ,达到最大值 ;而当温度
升高时 ,降解率开始下降。这是因为 ,一方面 ,微生
物的分解活动需要酶的参与 ,酶在低温时被抑制 ,而
在高温时发生变性 ;另一方面 ,温度直接影响柴油的
物理状态和化学组成 ,低温下油粘度升高 ,有毒的短
链烷烃挥发性下降 ,生物降解启动滞后 ;温度过高 ,
则会直接影响微生物的生长 ,并且烃的膜毒性会增
大 ,抑制菌株的降解。所以 ,从图所示中可以确定适
合 2#菌株生长的温度为 35℃。
图 5 温度对降解率的影响
21415 转速对降解率的影响 根据图 6所示内容 ,
2#菌株降解柴油的能力随着转速的上升而逐渐升高。
因为振荡速度越快 ,营养物和氧气在细胞间的传质
效率就越高 ,微生物生长变得旺盛 ,有利于柴油的降
解。因此 ,确定转速为 160 r/m in时 2#菌株有较好
的降解能力。
图 6 转速对降解率的影响
3 讨论
目前 ,石油污染问题已成为世界各国普遍关
注的问题。为了消除石油污染 ,科学工作者正在
进行广泛研究 ,寻求安全、可靠、经济有效的治理
方法。近年来 ,各国普遍采用的治理方法有焚烧
法、固化法、洗井法、生物法等 [ 7 ]。土壤中广泛分
布着可降解石油的微生物种 ,它们在土壤生物修
复中具有重要作用 ,但是数量上相差很大。土壤
中降解石油微生物的数量与污染物的存在有着密
切关系。它们能够适应环境 ,然后进行选择性富
集并发生遗传改变 ,从而导致烃类降解细菌所占
比例及编码降解烃类基因的质粒数量增加。有报
道指出 ,降解烃类的微生物一般只占微生物群落总
(下转第 171页 )
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2009年第 12期 段传人等 :白腐菌混合菌降解木质素最佳条件的优化
3　讨论
通过正交试验 ,得出了在固态发酵条件下白腐
菌混合菌降解木质素的最佳条件 ,即当温度为
32℃、pH310、固体发酵时间为 20 d、培养液与竹材
基质质量百分比为 110%时降解木质素的效率最
高。试验表明该种白腐菌混合菌降解木质素的能力
较强 ,可能与各菌种间的相互协调作用机制有关 ,分
析认为不同种白腐菌混合培养 ,由于彼此间木质素
降解酶系、生活史长短、营养需求、生长因子及各酶
系的同工酶等不同的生物学特性互补 ,在分泌木质
素降解酶系上表现了较好的种属互惠性。研究发
现 ,该白腐菌混合菌对温度和接种时的培养液与竹
材基质质量百分比变化较敏感 ,而对试验中较长的
发酵处理时间作用不明显。
通过试验研究发现 , H2 O2和苯甲醇对白腐菌混
合菌降解木质素有明显的促进作用 ,已有的相关研
究表明 , H2 O2可以使锰过氧化物酶和木质素过氧化
物酶的活性显著提高 ,从而促进木质素的降解。而
苯甲醇是白腐菌产酶的调控因子和诱导剂 ,在对木
质素的降解作用十分显著。但这两种诱导物的具体
作用机制还有待进一步研究。
参 考 文 献
1　张之亮 ,张元明 ,章悦庭 ,等. 新纺织 , 2004, (5) : 16～l8.
2　黎先发 , 贺新生 1纤维素科学与技术 , 2006, 12 (2) : 41～461
3　 Chandra A, Guha SRD1 Indian Forester, 1981, 107 (1) : 54～591
4　 J imenez2Tobon G , KuratkowskiW , Rozbicka B , et al1 M icrobiol2
ogy, 2003, 149 (11) : 3121～31271
5　 Hofrichter M1 Enzyme and M icrobial Technology, 2002, 30 ( 4 ) :
454～4661
6　李越中 , 高培基 1微生物学报 , 1994, 34 (1) : 29～361
7　 Swamy J, Ram say JA1 App l M icrobiol B iotechnol, 1999, 51 ( 3 ) :
391～3961
(上接第 163页 )
数的不到 1% ,而当有石油污染物存在时 ,降解者的
比例增加到 10% [ 7 ]。
本研究从舟山船舶修造业周围的柴油污染土壤
和油污废水区域采样 ,经过富集培养和多次分离筛
选 ,得到 14株柴油降解菌 ,并筛选出 9株高效柴油
降解菌。通过对高效降解菌进行的初步鉴定 ,得到
6种不同的菌属。
进一步考察 2#菌对柴油的降解能力 ,试验结果
表明 , 2#菌株具有较高的柴油降解能力 ,降解率达
6517%。通过对 2#微球菌柴油降解因素的试验 ,表
明菌液接种量、柴油浓度、pH、温度及转速均对降解
效果有一定的影响。2#微球菌的生长期大致需 42
h;当接种量为 110 m l/L, 柴油浓度为 114 g/L, pH710,培养温度为 35℃,转速为 160 r/m in时 , 2#微球菌有较好的柴油降解能力。参 考 文 献1　 A tlas RM. Marine Pollution Bulletin, 1995, 31 (4) : 178～182.2　 Mark AS, James SB, Cheryl AP, et al. Ecological Engineering, 2004,23: 263～277.3　沈薇 ,杨树林 ,陆晓 ,等. 环境科学与技术 , 2006, 29 (1) : 16～19.4　藿尔特 JG,简明第八版伯杰细菌鉴定手册 [M ]. 济南 :山东大学出版社 , 1988.5　周建勇 ,顾跃明. 冶金分析 , 2002, 22 (3) : 51～53.6　钱奕 ,张鹏 ,谭大伟. 过程工程学报 , 2001, 1 (4) : 4.7 　 Marchal RP. O il & Gas Science and Technology, 2003, 58(4) : 414～448.
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