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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
石斛兰 dfr基因植物表达载体的构建
潘丽晶　范干群　张妙彬　肖杨　曹友培
(珠海市农业科学研究中心 ,珠海 519070)
　　摘 　要 : 　石斛兰花瓣缺乏橙色、蓝色 ,这与其二氢黄酮醇 42还原酶 ( dihydroflavonol 42reductase, DFR)活性有着密切的关
系。根据已报道的石斛兰 dfr基因序列设计引物 ,从 D en. B urana Em era ld中分离了 dfr基因。将该基因序列正向与反向连接
到植物表达载体 pCAMB IA1301中 ,并由组成型启动子 CaMV35S驱动 ,成功构建了 dfr基因的正义和反义植物表达载体 pC2
SDN1和 pC2SDN2,并导入根癌农杆菌 (A grobacterium tum efacien) EHA105,以期利用转基因技术培育出石斛兰花色新品种。
关键词 : 　石斛兰 　dfr基因 　正义 　反义 　植物表达载体
Plant Expression Vectors Construction of dfr Gene from D endrobium
Pan L ijing　Fan Ganqun　Zhang M iaobin　Xiao Yang　Cao Youpei
( Zhuhai Agricultural Science R esearch Centre, Zhuhai 519070)
　　Abs trac t: 　The D endrobium petals are devoid of some colors such as orange and blue, which is greatly due to the activity of di2
hydroflavonol 42reductase (DFR). A dfr gene was amp lified from D en. B urana Em era ld flower with the specific p rimers according to
the reported dfr gene from other D endrobium species. The sense and antisense chains of dfr gene under the constitutive p romoter
CaMV35S were inserted into the p lant exp ression vector pCAMB IA1301 to construct sense and antisense recombinant vectors pC2SDN1
and pC2SDN2. both of which were transformed into A grobacterium tum efacien EHA105 respectively. Thus, it would help to cultivate no2
vel color species of D endrobium.
Key wo rds: 　D endrobium 　dfr gene　Sense　Antisense　Plant exp ression vector
收稿日期 : 2009202220
基金项目 :广东省科技计划项目 (2006B20130004)
作者简介 :潘丽晶 (19762) ,女 ,博士 ,助理研究员 ,主要从事分子生物学的研究 ; E2mail: panlijing@m sn. com
　　兰花是兰科植物 (O rch idaceae)的总称 ,为多年
生附生、地生或腐生草本植物。热带洋兰是相对于
国兰而言 ,主要分布于热带和亚热带、澳大利亚和太
平洋岛屿 ,具有种类繁多、色泽艳丽、花形俏丽、花姿
优雅等特点 ,属于高档名贵的花卉之一 ,在国际花卉
市场上一直受到青睐 ,是世界价格较贵且销路甚畅
的花卉。石斛兰 (D endrobium ) ,又称石斛 ,是兰科中
的第二大属 ,热带洋兰主要的切花品种之一。石斛
兰的花色艳丽 ,但市场上倍受欢迎的亮橙色、火红色
和天蓝色在石斛兰中却不曾见。长期以来 ,育种家
们渴望通过传统杂交手段获得新型的石斛兰花色品
种 ,然而 ,石斛兰的育种周期长 ,研究者们对石斛兰
花色的遗传研究较少 ,从而限制了石斛兰新型花色
品种的开发。近几年来 ,转基因技术的广泛应用 ,为
石斛兰的花色改良提供了新的途径。
花色素是一类广泛存在于植物中的水溶性色
素 ,属类黄酮化合物 ,需经过复杂的生物合成途径形
成 [ 1 ]。二氢黄酮醇 42还原酶 ( dihydroflavonol 42re2
ductase, DFR)在不同花色形成中起着关键作用 ,它
是将二氢黄酮醇转变为花色素反应的第一个酶 ,在
还原型辅酶 II(NADPH)的参与下 ,不同物种的 DFR
选择不同的底物 ,合成不同的花色素 ,呈现各异的花
色 [ 2 ]。在花色素生物合成的最后步骤中 ,无色的二
氢槲皮醇 ( dihydroquercetin, DHQ)、二氢莰非醇 ( di2
hydrokaempferol, DHK)和二氢杨梅黄铜 ( dihydro2
myricetin, DHM ) DFR等酶的作用下分别合成红色
至红紫色的矢车菊色素 ( cyanidin232glucoside)、橙红
色至红色的天竺葵色素 ( pelargonidin232glucoside)
和蓝紫色的飞燕草色素 ( delphinidin232glucoside)
(图 1)。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
Malonyl2CoA. 丙二酰辅酶 A; Coumaroyl2CoA. 香豆素辅酶 A; CHS. 查
尔酮合成酶 ; F3′H. 类黄酮 23′2羟基化酶 ; F3′5′H. 类黄酮 23′5′2羟基
化酶
图 1　花色素的合成途径
本研究从石斛兰中分离了二氢黄酮醇 42还原
酶基因 ( dfr) ,成功构建了组成型启动子 CaMV35S
驱动的正义 dfr基因和反义 dfr基因的植物表达载
体 ,并导入根癌农杆菌 ( A grobacterium tum efacien )
EHA105,以期利用转基因技术培育出石斛兰花色新
品种。
1　材料与方法
111　材料
试验材料采自珠海市农业科学研究中心兰花资
源圃的 D en. B urana Em era ld。质粒载体 pCAM2
B IA1301来自 CAMB IA , Canberra, Australia;大肠杆
菌 ( Escherich ia coli) DH5α、农杆菌 EHA105 (具有利
福平抗性 )为本室保存。
112　酶与试剂
pMD182T载体、T4 DNA 连接酶、各种限制性内
切酶、DNA markers、RNA 反转录试剂盒均购自
TaKaRa公司 ; DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒为
Omega公司产品 ; IPTG和 X2Gal等购自北京鼎国 ;
其它试剂为国产分析纯。
113　dfr基因的分离
采用 SDS改良法提取石斛兰 D en. B urana Em 2
era ld总 RNA。根据已报道的石斛兰 dfr基因 ( Gen2
Bank登录号 : AY741318) ,设计两个特异性引物 , A:
5′2AACTGGCGTTGAGGAGAGAGAA23′, B: 5′2GCAC
TT2AGAAAATCAATAGGAC23′。参照 TaKaRa 公司
的 RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3. 0试剂盒说明书进行
RT2PCR。扩增产物经回收 ,与 pMD182T载体连接 ,
转化 E. coli DH5α,提取质粒 T2dfr,鉴定后送广州
Invitrogen公司测序。质粒提取、酶切 , DNA片段回
收、连接、转化等按分子克隆实验手册略加修改
进行 [ 3 ]。
114　dfr基因植物表达载体的构建
11411　引物设计及 PCR　根据测序结果 ,重新设计
两对引物 ,用于扩增 dfr基因的正义序列和反义序列 :
正义序列 dfr1, C: 5′2GGTACCAACTGGCGTTGA
GGAGAGA23′(引入的位点 : Kpn) ,
D: 5′2GGATCCGCACTTAGAAAATCA23′(引入
的位点 : B am H I) ,
反义序列 dfr2, E: 5′2GGTACCGCACTTAGAAAA
TCA23′(引入的位点 : Kpn I) ,
F: 5′2GGATCCAACTGGCGTTGAGGAGAG23′(引
入的位点 : B am H I)。
引物由 Invitrogen公司合成。50μl PCR反应体
系 :模板 DNA 50 ng,两种引物各 0. 25μmol·L21 ,
Taq酶 0. 5 U , dNTP 200μmol·L21。以 T2dfr为模板
进行 PCR扩增 ,扩增条件 : 95℃变性 5 m in, 50℃退
火 1 m in, 72℃延伸 1 m in, 30个循环 ,最后 72℃延伸
10 m in。
CaMV35S启动子和 Nos polyA片段的扩增请见
文献 [ 4 ]。
11412　载体的构建 　转基因载体的构建策略如图
2所示。PCR产物连入 pMD182T克隆载体 ,连接产
物转化 E. coli DH5α,经序列测定后 ,以相应的限制
性内切酶酶切 , 回收并纯化 , 分别连入 pCAM2
B IA1301,转化 DH5α,得到重组质粒 pC2SDN1 和
pC2SDN2。重组质粒经酶切鉴定后 ,进一步送广州
Invitrogen公司进行测序鉴定。
115　农杆菌的转化及鉴定
利用冻融法将表达载体导入农杆菌 EHA105感
受态细胞 ,在含有利福平和卡那霉素的 YEB固体培
养基上 28℃培养 2～3 d。挑选阳性克隆提取质粒 ,
通过 PCR对重组克隆进行鉴定。
2　结果与分析
211　dfr基因的分离
根据已知的 dfr基因序列设计引物 ,从石斛兰
D en. B urana Em era ld中克隆出一条约为 1. 2 kb的
特异条带 ,经回收测序发现与 GenBank中的序列同
源性为 100% ,确定为 dfr基因 (图 3)。
27
2009年第 8期 潘丽晶等 :石斛兰 dfr基因植物表达载体的构建
35S. CaMV35S启动子 ; NPA. Nos polyA片段
图 2　植物表达载体的构建
M. DL2000 Marker; 1. 石斛兰 dfr基因片段
图 3　石斛兰 dfr基因的 RT2PCR产物
212　dfr基因的序列分析
用 B last分析发现 ,该基因的氨基酸序列与其他
5种非兰科植物 dfr基因的氨基酸同源性在 56% ～
59%之间 ,运用 ClustalW软件 [ 5 ]进行 6个 DFR氨基
酸序列的排比 ,结果见图 4。所引用的 DFR序列分
别来自矮牵牛 ( Petun ia )、金鱼草 (A n tirrh inum )、大
丁草 (Gerbera)、拟南芥 (A rabidopsis tha liana)和月季
(Rosa)。除石斛兰与矮牵牛外 ,其他 4种 DFR蛋白
均已被证实具有还原 DHK活性 [ 6～9 ]。
6个 DFR都存在 26个氨基酸组成的 DHK底物
特异结合区 ;除矮牵牛外 ,都含有决定 DHK活性的
特异的天冬酰胺 N位点 [ 6, 9 ]。
Pet(矮牵牛 ) . X79723; Antir (金鱼草 ) . X15536; Ger (大丁草 ) .
Z17221; A rab (拟南芥 ) . M86359; Rosa (玫瑰 ) . D85102;矩形框内是
DHK底物特异结合区 ; 3 代表特异的天冬酰胺 N位点
图 4　兰科植物 D FR蛋白的序列排比
213　植物表达载体的构建
以 T2dfr为模板 ,经 PCR扩增后 ,获得含有特定
酶切位点的正义 dfr基因 ( dfr1 )和反义 dfr基因
( dfr2)。参照文献 [ 4 ] ,扩增得到 CaMV35S启动子
和 Nos polyA 片段。将各片段分别克隆到 pCAM2
B IA1301表达载体上 ,转化 E. coli DH5α,得到重组
质粒 pC2SDN1和 pC2SDN2,挑选阳性克隆 ,纯化质
粒 ,用 B am H I和 Kpn I酶切鉴定 ,结果与预期大小一
致 (图 5)。
M1. λDNA /EcoR I + H ind IIIMarker;M2. DNA MarkerIII ; 1. 载体 pC2
SDN1的 B am H I单酶切 ; 2. 载体 pC2SDN1的 B am H I和 Kpn I双酶
切 ; 3. 载体 pC2SDN2的 B am H I单酶切 ; 4. 载体 pC2SDN2的 B am H I
和 Kpn I双酶切
图 5　植物表达载体的鉴定
214　农杆菌转化与鉴定
利用冻融法将表达载体 pC2SDN1和 pC2SDN2
分别导入农杆菌 EHA105,在含有利福平和卡那霉
素的 YEB固体培养基上筛选后挑选阳性克隆提取
质粒。利用引物 C和 D进行 PCR鉴定 ,以含有载体
pC2SDN1和 pC2SDN2的农杆菌为模板都能扩增得
到与预期大小相符的片段 ,而以未转化载体的农杆
菌为模板则没有目的片段 (图 6) ,表明已获得含有
正义 dfr基因和反义 dfr基因表达载体的农杆菌菌
株 ,可用于石斛兰的遗传转化。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
M. DL2000 Marker; 1. 含有 pC2SDN1的农杆菌 PCR产物 ; 2. 含有
pC2SDN2的农杆菌 PCR产物 ; 3. 未转化载体的农杆菌 PCR产物
图 6　转化农杆菌的 PCR鉴定
3　讨论
对于观赏植物而言 ,花色是一个重要的观赏
性状。在诸多影响花色形成的因素之中 ,花瓣中
花色素的种类及含量是决定花色的最重要的因素
之一。随着花色形成机制的剖析和相关基因的分
离 ,以及转基因技术的发展 ,人们可以更有目的地
改变花色。采用转基因技术改变植物花色的方法
主要有 :
(1)直接导入外源结构基因。国际上首例利用
转基因技术改变花色的实验便是采用此方法。
Meyer等 [ 10 ]将玉米 dfr基因导入矮牵牛 RC01突变
体后 , DHK被还原 ,花变成淡砖红色 ,生成矮牵牛的
新花色系列。之后研究者们在矮牵牛中异源表达月
季、非洲菊的 dfr同源基因 ,使花色变红 [ 2, 8 ]。
(2)导入调节基因使植物内源基因活化。Ho2
loton等 [ 11 ]报道从矮牵牛中已克隆并表达了辅色素
黄酮醇合酶基因 F1,增加这种辅色素通常会使花的
蓝色加深。
(3)导入植物内某内源基因的正义或反义基因
以抑制该内源基因的活性。A ida等 [ 12, 13 ]将反义 dfr
和反义 chs导入蓝猪耳中 ,二者都可使花更显蓝 ,反
义 dfr比反义 chs更能使花显蓝。他们认为 ,通过导
入反义 dfr,使 dfr基因钝化 ,从而导致黄酮的积累 ,
使辅色作用增强。这是导入反义 dfr比导入反义 chs
更加显蓝的原因。
花色素的合成是多个基因协同表达以及底物竞
争的结果。DFR对底物识别的活性以及与 F3′H和
F3′5′H的竞争 ,最终决定着花色。至今 ,研究者们
已克隆到多种植物的 dfr基因 ,其 DFR氨基酸序列
的特征也与活性有关。例如 , DFR存在 26个氨基
酸组成的底物特异结合区 ,其中第 134位氨基酸可
直接影响酶的底物特异性 ,大多数物种在 134位含
有天冬酰胺 N [ 6, 9 ]。
有些植物的 DFR缺乏还原底物 DHK活性 ,因
而其花瓣缺少橙色 ,如矮牵牛 ;相反 ,大丁草 DFR能
够还原 DHK,使花瓣产生橙色 [ 8 ]。在矮牵牛的 DFR
序列中 ,因其底物特异区中的 134位不存在 N 位
点 ,而缺乏还原 DHK活性 [ 9 ]。这个区域在番薯中
也被认为是底物特异区 [ 14 ]。
目前 ,已报道的来自兰科植物的 dfr基因共有
4种 ,除石斛兰外 ,还有兰属 ( Cym bid ium )、文心兰
(O ncid ium Gow er R am sey)和 B rom head ia fin layson i2
ana。Johnson等将兰属 dfr基因转入矮牵牛中 ,发
现兰属的 DFR不能有效还原 DHK,从而导致天竺
葵色素的缺乏 ,但兰属的 DFR中存在 134位的 N
特异氨基酸 [ 7 ] 。文心兰与 B rom head ia fin layson iana
的 DFR中也都存在 134位的 N ,但它们却无法还
原底物 DHK,这就提示 ,兰花的 DFR底物特异性位
点不是 134位的 N位点 [ 15, 16 ]。Mudalige2Jayawickra2
ma
[ 17 ]推测 ,由于 F3′H和 DFR作用于相同的底物
DHK,它们之间的竞争决定了 DHQ和 DHK的不同
表达水平。
Petit等 [ 18 ]首次对 DFR的三维结构进行了详细
描述 ,他们将一种葡萄 (V itis vin ifera )的 dfr基因在
大肠杆菌中表达 ,分离纯化其活性蛋白 ,不仅检测了
DFR 的活性 , 还获得了该酶与 DHQ 和辅酶 II
(NADP)的两种结合物 (DFR2DHQ 和 DFR2NADP)
的三维结构图。Trabelsi等 [ 19 ]进一步获得了 DFR2
NADP2杨梅酮和 DFR2NADP2栎精两种结合物的晶
体 ,通过三维结构的展示 ,证实黄酮醇可能抑制
DFR的活性。
本研究从石斛兰中成功分离了 dfr基因 ,对其
氨基酸序列进行了分析 ,发现其编码的氨基酸序列
存在 26个氨基酸组成的 DHK底物特异结合区和特
异的 N位点。石斛兰花瓣缺乏橙色、蓝色 ,这与其
DFR活性有着密切的关系。为培育石斛兰花色新
品种和探讨 DFR在石斛兰花色中的作用机制 ,构建
了组成型启动子 CaMV35S驱动的正义 dfr基因和反
义 dfr基因的植物表达载体 ,并导入根癌农杆菌
EHA105,目前转基因苗的筛选和培育工作正在进
行中。
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2009年第 8期 潘丽晶等 :石斛兰 dfr基因植物表达载体的构建
参 考 文 献
1　 Tanaka Y, KatsumotoY, B rugliera F, et al. Plant Cell, 2005, 80:
1～24.
2　 Tanaka Y, Fukui Y, Fukuchi2M izutaniM, et al. Plant Cell Physi2
ol, 1995, 36: 1023～1031.
3　 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T,Molecular Cloning: A Labora2
to ryManual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
4　潘丽晶 ,张妙彬 ,梁擎中 ,等. 中山大学学报 (自然科学版 ) ,
2009, 1: 67～71.
5　 Thomp son JD, H iggins DG, Gibson TJ. Nucleic Acids Res, 1994,
22: 4673～4680.
6　 Beld M, Martin C, Huits H, et al. PlantMol B iol, 1989, 13: 491
～502.
7　 Johnson ET, Yi H, Shin B, et al. Plant J, 1999, 19: 81～85.
8　 Elomaa P, Helariutta Y, Griesbach RJ, et al. Mol Gen Genet,
1995, 248: 649～656.
9　 Johnson ET, Ryu S, Yi H, et al. Plant J, 2001, 25: 325～333.
10　Meyer P, Heidmann I, Forkmann G, et al. Nature, 1987, 330:
677～678.
11　Holton TA, B rugliera F, Tanaka Y, et al. Plant J, 1993, 4: 1003
～1010.
12　A ida R, Sanae K, Yoshikazu T, et al. Plant Sci, 2000, 153: 32～
42.
13　A ida R, Yoshida K, Kondo T, et al. Plant Sci, 2000, 160: 49
～56.
14　Zufall RA, RausherMD. Nature, 2004, 428: 847～850.
15　H ieber AD, Mudalige2Jayawickrama RG, Kuehnle AR. Planta,
2005, 223: 521～531.
16　L iew CF, Loh CS, Goh CJ, et al. Plant Sci, 1998, 135: 161
～169.
17　Mudalige2Jayawickrama RG, Champagne MM, H ieber AD, et al. J
Am Soc Hort Sci, 2005, 130: 611～618.
18　Petit P, Granier T, d’Estaintot BL, et al. J Mol B iol, 2007, 368:
1345～1357.
19　Trabelsi N, Petit P, Manigand C, et al. Acta Cryst, 2008, 64: 883
～891.
(上接第 55页 )
23　钱方 ,高志芳 ,滕木子 ,安利佳 1河南农业科学 , 2007, 7: 17～201
24　刘广金 ,姚晓林 ,蒋家平 1现代农业科技 , 2008, 4: 208～2101
25　郝金凤 ,哈斯阿古拉 1北方园艺 , 2006, (6) : 43～451
26　葛庆燕 ,苏乔 ,安利佳 1分子植物育种 , 2004, 2 (4) : 713～7191
27　Fu XD, Duc LT, Fontans S, et al1 Transgenic Research, 2000, 9
(1) : 11～191
28　苏宁 ,吴燕民 ,孙丙耀 ,等 1生物技术通报 , 2001, 4: 9～131
29　Daniell H, W iebe PO, M lillan AF1 Trends in Plant Science, 200 l,
6 (6) : 237～2391
30　van Bel AJE, H ibherd J, Prnfer D, et a11Curr Op in B iotech, 2001,
12: 144～1491
31　范国昌 ,张中林 ,沈桂芳 1细胞生物学杂志 , 1998, 20 ( 4 ) : 169
～ 1731
32　Bogorad L1Trendsin B iotech, 2000, 18: 257～2631
33　Daniell H, Datta R, Varma S, et a11 Nat B iotech, 1998, 16L: 345 ～848134　Ruf S, Hermann M, Berger IJ, et a11 Nat B iotech, 2001, 19: 870～875135　Mariani C, DeB luckeleer M, Tnlettner J, et a11 Nature , 1990,347: 737～741136　Kuvshinov V, Koivu K, Kanerva A, et a11 Plant Sci , 2001, 160:517～522137　L i YC, Meng FR1 China B iotechnology1 2003, 9: 30～33138　Gressel J1 Trends in B iotech, 1999, 17 (9) : 361～866139　Luo KM, Zhao DG, L i Y, Pei Y1 Chinese H igh Technology Letters12005, 15 (7) : 61～66140　Luo K, Duan H, Zhao D, et al1 Plant B iotech, 2007, 5 ( 2 ) : 263～274141　L i Y, Duan H, et al1 Gene2deletor: An New Tool to Address Con2cerns over GE Crop s1 ISB News Report1 ( http: 2007 / /www1 isb1vt1edu / news/2007 /news071 jun1htm)
57